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문제 정의
- 하지만 일본 및 남미 등에서 다양한 선인장 가공식품이 시판되는 것과 달리 국내에서는 제주지역을 중심으로 선인장 청차 등의 단순가공식품만이 생산되고 있어 그 이용은 걸음마 단계라 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 손바닥 선인장의 응용범위를 다양화하기 위한 일환으로 활성이 기대되는 손바닥 선인장을 용매 및 온도, 초음파병행 조건을 달리하여 추출하고, 면역 활성을 탐색함으로써 손바닥 선인장의 기능성 제재로의 가능성 및 최적 추출조건을 검토하고자 연구를 수행하였다.
- , 2004). 따라서 손바닥 선인장 유용물질의 효과적인 추출을 위해 물을 용매로 하여 100℃ 이하 60℃에서 초음파를 병행하여 추출하는 공정이 바람직할 것으로 사료되는 바이다.
제안 방법
- Miller)은 2006년 11월 수확된 것을 제주도 제주시에 위치한 정우식품에서 지원받아 사용하였다. 손바닥 선인장은 수확 후 4℃에서 냉장보관 하던 생과를 이용하였으며, 시료는 각각 10 배 (v/w)의 100℃ 증류수와 60℃ ethanol을 사용하여 24시간 동안 추출하였고, 다시 초음파 추출기를 통하여 각각의 추출온도인 100℃와 60℃에서 60 kHz 의 초음파로 30분간 초음파 추출을 병행한 것을 이용하였다. 추출 후 추출물의 여과는 Whatman사의 20-25 ㎛ 여과지를 이용하여 감압여과 하였으며, 감압 여과 후 농축과 동결건조 단계를 거쳐 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 면역세포 생육 증진 효과는 인간 면역 세포인 T cell (Jurkat, ATTC, USA)과 B cell (Raji, ATTC, USA)을 이용하여 검증하였다. 실험에 사용된 면역세포는 RPM1 1640 배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK celle alpha minimum essential medium (α-MEM) 배지에 2mM L-glutamine, 0.
- 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 1.0 × 104 cells/㎖ 의 농도로 조절한 후 시료를 투여하여 8일 동안 배양하면서 매일 각 well의 세포수를 혈구계수기로 측정하여 생육도를 측정하는 방법을 사용하였다 (Kim et al., 2005).
- Cytokinee IL-6와 TNF-α의 정량을 Chemicon (USA)사의 IL-6와 TNF-α 정량 kit를 사용하여 측정하였다. 세포의 농도를 1.
- 5mg/me로 100 ㎕ 씩 첨가하여 다시 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 배양배지의 상층액을 취한 다음 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D값을 표준물질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양을 측정하였다 (Han et al., 1998).
- 1 대식세포이며, 세포는 10% heat-inactivated bovine serum과 RPMI 1640 배지를 이용하여 24 well plate에 4—5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 5% CO2 incubator 안에서 37℃에서 48시간동안 배양하여 실험에 사용하였다. 대식세포에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitrite의 양을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다. 먼저 시료를 처리하고 48시간 동안 세포를 배양하고 상등액 50 ㎕를 취하여 동일부피의 Griess시약 (1% sulfenilamide/0.
- 대식세포에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitrite의 양을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다. 먼저 시료를 처리하고 48시간 동안 세포를 배양하고 상등액 50 ㎕를 취하여 동일부피의 Griess시약 (1% sulfenilamide/0.1 % N-(1-naphthyl)-ethylenedia-mine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 첨가하고 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 32 μM에서부터 0.
- 5% H3PO4)을 첨가하고 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 32 μM에서부터 0.25 μM까지 RPMI 1640 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. NCT생성능의 양성대조구 물질로는 LPS를 사용하였다 (Ding et al.
- ATCCS부터 분양 받은 NK-92MI cell을 α-MEM배지에 2 mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, lOeM 2-mercaptoethanol, 12.5% FBS와 12.5% horse serum 에 2x×107cells/㎖ 의 농도로 희석시켜 이용하였다.
- 인간 T세포와 B세포를 T-25 Flask에 배양하면서 sample을 투여한 후 증식정도를 관찰하면서 3~4번의 계대배양 후 세포를 원심분리하여 상층액을 취하였다. NK-92MI cell을 24well plate에 4~5×104cells/㎖로 900㎕ 씩 분주하고 24시간 후 T세포와 B세포의 상층액을 각 plate에 100㎕ 씩 투여하였으며 배양 48시간 후 6일 동안 NK-92MI cell의 활성도를 cell counter를 이용하여 생세포수 측정을 통해 확인하였다 (Yueran et al.
- 원심분리하여 상층액을 취하였다. NK-92MI cell을 24well plate에 4~5×104cells/㎖로 900㎕ 씩 분주하고 24시간 후 T세포와 B세포의 상층액을 각 plate에 100㎕ 씩 투여하였으며 배양 48시간 후 6일 동안 NK-92MI cell의 활성도를 cell counter를 이용하여 생세포수 측정을 통해 확인하였다 (Yueran et al., 2003; Cecilia, 2002).
- 인간의 면역체계에서 중요한 역할을 하는 면역세포인 B cell과 T cell에 대한 손바닥선인장의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 면역세포의 생육 촉진 효과를 생육도 측정을 통해 확인하였다. Fig.
- 2에 나타내었다. 대식세포의 NOS (nitric oxide synthase)는 항상 존재하는 것이 아니라 TNFa와 같은 여러가지 cytokine과 LPS (대장균 유래 lipopolysaccharide)와 같은 세균 내독소의 영향을 받아 NOS 유전자의 발현이 유도되기 때문에(Bama et al., 1984; Miyagawa et al., 1988) 이번 실험에서는 시료를 LPS와 같이 투여하여 NCT의 생성능을 확인하였다. 결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 NOS 생성능에 있어서도 면역세포 및 cytokine 분비와 유의적인 결과를 나타내었다.
- NK 세포의 활성 측정은 B cell과 T cell에 추출물을 첨가한 후 그의 배양액을 NK 세포에 첨가하여 나타나는 생육도의 변화를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 활성을 측정하였다. Fig.
- 면역기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 T cell과 B cell을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 1.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 손바닥 선인장 (Optmtia ficus-indica L. Miller)은 2006년 11월 수확된 것을 제주도 제주시에 위치한 정우식품에서 지원받아 사용하였다. 손바닥 선인장은 수확 후 4℃에서 냉장보관 하던 생과를 이용하였으며, 시료는 각각 10 배 (v/w)의 100℃ 증류수와 60℃ ethanol을 사용하여 24시간 동안 추출하였고, 다시 초음파 추출기를 통하여 각각의 추출온도인 100℃와 60℃에서 60 kHz 의 초음파로 30분간 초음파 추출을 병행한 것을 이용하였다.
- 손바닥 선인장은 수확 후 4℃에서 냉장보관 하던 생과를 이용하였으며, 시료는 각각 10 배 (v/w)의 100℃ 증류수와 60℃ ethanol을 사용하여 24시간 동안 추출하였고, 다시 초음파 추출기를 통하여 각각의 추출온도인 100℃와 60℃에서 60 kHz 의 초음파로 30분간 초음파 추출을 병행한 것을 이용하였다. 추출 후 추출물의 여과는 Whatman사의 20-25 ㎛ 여과지를 이용하여 감압여과 하였으며, 감압 여과 후 농축과 동결건조 단계를 거쳐 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 검증하였다. 실험에 사용된 면역세포는 RPM1 1640 배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK celle alpha minimum essential medium (α-MEM) 배지에 2mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, lOeM 2-mercaptoethanol, 12.5% fetal bovine serum (FBS) 과 12.5% horse serum (Myelocult)을 첨가시켜 배양하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 α-MEMe Gibco (USA)사로부터 구입하였고, Hepes buffer는 Sigma (USA) 사에서 구입하여 사용하였다. 혈청은 Gibco사의 FBS와 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA와 세포염색을 위한 sulforhodamine B (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 구입하여 사용하였다. 혈청은 Gibco사의 FBS와 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA와 세포염색을 위한 sulforhodamine B (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 사용된 세포주는 마우스 유래 J774.1 대식세포이며, 세포는 10% heat-inactivated bovine serum과 RPMI 1640 배지를 이용하여 24 well plate에 4—5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 5% CO2 incubator 안에서 37℃에서 48시간동안 배양하여 실험에 사용하였다. 대식세포에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitrite의 양을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다.
- 25 μM까지 RPMI 1640 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. NCT생성능의 양성대조구 물질로는 LPS를 사용하였다 (Ding et al., 1998).
데이터처리
- Miller. Significant differences were compared with control at p < 0.05 by student t-test.
- : Data values are expressed as mean±SD of triplicate determinations. The data showed significant difference in the same row at the level of p < 0.05 by student t-test.
성능/효과
- 시료를 첨가한 모든 조건에서 대조군과 비교하여 증가된 생육도를 확인할 수 있었다. 대부분의 측정에서 초음파를 병행한 추출물이 병행하지 않은 추출물에 비해 5-50% 높은 활성을 나타내었고, 그 중 가장 높은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물로 6일째 12.8×104 cells/㎖ 를 나타냄 으로서 시료를 첨 가하지 않은 대조구의 8.4×104cells/㎖ 에 비하여 약 52%의 이상의 B cell 생육 증진을 나타내며 모든 측정기간에서 가장 좋은 활성을 나타냈다.
- 최대 생육도를 나타내는 6일째 60℃ 초음파병행 추출물의 생육도는 11.9×104cells/㎖ 로 대조군의 8.4×104cell/㎖ 과 비교하여 T cell의 생육을 약 41% 증가시키는 것으로 나타났다. 또 B cell의 생육과 마찬가지로 초음파를 병행한 추출물이 병행하지 않은 추출물에 비해 높은 활성을 나타내었다.
- 4×104cell/㎖ 과 비교하여 T cell의 생육을 약 41% 증가시키는 것으로 나타났다. 또 B cell의 생육과 마찬가지로 초음파를 병행한 추출물이 병행하지 않은 추출물에 비해 높은 활성을 나타내었다.
- 이는 조음파공정을 통한 공동효과에 따른 활성 물질의 용출량 증가에 기인하는 것으로 생각된다. 또한 B cell과 T cell을 통한 모두의 결과에서 용매별로는 초음파를 병행한 60℃ 에탄올 추출물이 대조군에 비해 5~35%의 활성 증진을 나타내며 초음파를 병행한 60t 물 추출물 다음으로 좋은 활성을 보였으나 초음파를 병행하지 않은 60℃ 에탄올 추출물은 대조군 및 100℃ 물 추출물과 비슷한 활성을 나타내며 다른 추출물에 비해 낮은 활성을 나타내었다. 온도별로는 초음파병행 조건과 상관없이 병행한 추출물과 병행하지 않은 추출물 모두에서 100℃ 물 추출물에 비해 60℃ 물 추출물의 활성이 높게 나타남에 따라 손바닥 선인장의 면역 활성 증진을 나타내는 성분이 100℃ 이상의 고온에서 활성의 감소를 나타내는 것으로 사료된다.
- 각 시료에 따른 cytokine 분비량은 면역세포 생육도와 유의적인 값을 나타내었다. 각 시료에 대한 세포 당 IL-6와 TNF-α의 분비량을 살펴보면, 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물의 경우 6일째 T cell에서 각각 3.
- 78×10-4 pg/cell을 나타내며 다른 시료와 비교하여 많은 cytokine 분비량을 나타내었다. 또한 초음파를 병행하여 추출한 추출물들이 면역세포 생육증진 활성 측정에서와 마찬가지로 병행하지 않은 추출물들에 비해 많은 cytokine 분비를 나타내었다. 이는 손바닥 선인장과 유사한 해당화의 뿌리 추출물을 통한 연구 (Lee et al.
- 또한 초음파를 병행하여 추출한 추출물들이 면역세포 생육증진 활성 측정에서와 마찬가지로 병행하지 않은 추출물들에 비해 많은 cytokine 분비를 나타내었다. 이는 손바닥 선인장과 유사한 해당화의 뿌리 추출물을 통한 연구 (Lee et al., 2003)의 면역세포 생육증진 효과와 유사한 수치로 손바닥 선인장 추출물 첨가를 통한 면역세포의 생육 증진 및 cytokine 분비량 증가를 통하여 손바닥 선인장이 면역 활성 증진과 관련하여 활용 가능성이 있으며 초음파병행 추출 공정을 통해 면역 활성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
- , 1988) 이번 실험에서는 시료를 LPS와 같이 투여하여 NCT의 생성능을 확인하였다. 결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 NOS 생성능에 있어서도 면역세포 및 cytokine 분비와 유의적인 결과를 나타내었다. 시료만을 첨가한 결과에서 60℃ 초음파병행 물추출물이 12.
- 결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 NOS 생성능에 있어서도 면역세포 및 cytokine 분비와 유의적인 결과를 나타내었다. 시료만을 첨가한 결과에서 60℃ 초음파병행 물추출물이 12.3 μM 로 가장 높은 대식세포 생성능을 보였으며 100℃ 물 추출물이 8.3 μM로 양성대조군인 LPS와 같은 수치를 나타내며 가장 낮은 생성능을 나타내었다. 이는 양성대조군인 LPS에 비해 높은 수치로 손바닥 선인장의 면역 활성을 확인할 수 있는 결과이나 높은 면역 활성을 가진 것으로 알려진 마황, 복분자 및 당귀의 분획을 통한 연구 (Kim et al.
- , 2005)에서 같은 농도를 통해 나타난 20~30 μM와 비교하였을 때는 낮은 결과이다. 반면 시료와 LPS를 혼합 처리한 결과에서 각각의 조건이 시료만을 첨가했을 때의 8.3-12.3 μM보다 높은 14-17 μM의 결과를 나타냄에 따라 손바닥 선인장 추출물이 NCT생성능을 가지며 LPS 등 다른 물질과 상승작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 3은 B cell에 각 시료를 첨가하여 배양한 후 그 배양액을 NK 세포에 첨가하였을 때 NK 세포의 활성도를 첨가시료의 추출조건별로 비교하여 나타낸 그림이다. 6일 동안 생육도를 관찰하였는데 시료를 첨가한 모든 조건에서 대조군과 비교하여 생육도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. (A)는 용매에 따른 생육도를 나타낸 것으로 배양 6일간의 측정에서 모두 에탄올 추출물에 비해 물 추출물이 5-20% 이상 좋은 활성을 나타내었다.
- 6일 동안 생육도를 관찰하였는데 시료를 첨가한 모든 조건에서 대조군과 비교하여 생육도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. (A)는 용매에 따른 생육도를 나타낸 것으로 배양 6일간의 측정에서 모두 에탄올 추출물에 비해 물 추출물이 5-20% 이상 좋은 활성을 나타내었다. (B)는 온도조건에 따른 생육도를 비교한 것으로 60℃ 물 추출물이 100℃ 물 추출물과 비교해 5% 이상의 좋은 활성을 보였다.
- (A)는 용매에 따른 생육도를 나타낸 것으로 배양 6일간의 측정에서 모두 에탄올 추출물에 비해 물 추출물이 5-20% 이상 좋은 활성을 나타내었다. (B)는 온도조건에 따른 생육도를 비교한 것으로 60℃ 물 추출물이 100℃ 물 추출물과 비교해 5% 이상의 좋은 활성을 보였다. (C)는 (A)와 (B)를 통해 일반추출에서 가장 좋은 활성을 나타낸 60℃ 물 추출물과 초음파를 병행한 추출물들을 비교한 것이다.
- (C)는 (A)와 (B)를 통해 일반추출에서 가장 좋은 활성을 나타낸 60℃ 물 추출물과 초음파를 병행한 추출물들을 비교한 것이다. 초음파를 병행한 모든 추출조건에서 대조군 및 60℃ 물 추출물보다 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 가장 좋은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물로 6일째 16.
- 초음파를 병행한 모든 추출조건에서 대조군 및 60℃ 물 추출물보다 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 가장 좋은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물로 6일째 16.6 × 104 cells/㎖를 나타내어 12.3 × 104 cell/㎖를 나타낸 대조군에 비해 약 1.35배의 활성 증가를 확인할 수 있었다. 다음으로 초음파를 병행한 100℃ 물 추출물이 16.
- 4를 통해 확인할 수 있다. 용매에 따른 비교를 통해 배양 6일간의 측정에서 모두 에탄올 추출물에 비해 물 추출물이 3-25% 이상 좋은 활성을 나타낸 것을 확인하였다. 온도조건에 따른 비교에서도 60℃ 물 추출물이 100℃ 물 추출물과 비교해 좋은 활성을 나타내었다.
- 온도조건에 따른 비교에서도 60℃ 물 추출물이 100℃ 물 추출물과 비교해 좋은 활성을 나타내었다. B cell에서와 같이 초음파를 병행한 모든 추출조건에서 대조군 및 60℃ 물 추출물보다 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 그 중 5일째 가장 좋은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물로 20.
- 3배의 활성 증가를 보여주었다. 이상의 결과를 통해 앞에서 살펴본 면역세포의 증식에서와 마찬가지로 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물이 높은 면역 활성 성분을 가질 것으로 사료된다. 또한 NK cell의 생육 증진 활성을 통해 손바닥 선인장추출물은 물을 용매로 하여 60℃에서 초음파 공정을 병행하였을 때 가장 높은 면역 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 따라서 본 연구를 통해 손바닥 선인장은 면역 활성을 나타내는 성분을 함유하고 있으며, 초음파병행 추출공정을 통해 유효성분의 면역 활성 증진효과를 기대할 수 있음을 확인하였다. 이는 초음파병행 공정을 통한 공동현상의 높은 압력으로 세포 내부조직이 파괴되어 지방질의 이동거리가 짧아지고 확산이 용이하게 일어나기 때문으로 사료된다(Chung et al.
- B cell은 시료첨가 시점을 기준으로 하여 6일째 최고 생육도를 나타내는 생육곡선을 나타내었다. 시료를 첨가한 모든 조건에서 대조군과 비교하여 증가된 생육도를 확인할 수 있었다. 대부분의 측정에서 초음파를 병행한 추출물이 병행하지 않은 추출물에 비해 5-50% 높은 활성을 나타내었고, 그 중 가장 높은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물로 6일째 12.
- 이상의 결과를 통해 앞에서 살펴본 면역세포의 증식에서와 마찬가지로 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물이 높은 면역 활성 성분을 가질 것으로 사료된다. 또한 NK cell의 생육 증진 활성을 통해 손바닥 선인장추출물은 물을 용매로 하여 60℃에서 초음파 공정을 병행하였을 때 가장 높은 면역 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 현재 제주도를 중심으로 손바닥 선인장의 재배가 증가하고 있으며, 세계적으로 선인장을 통한 기능성 가공식품의 개발 및 시장규모도 계속적으로 증가하고 있어 향후 소비가 증가될 것으로 전망된다. 하지만 일본 및 남미 등에서 다양한 선인장 가공식품이 시판되는 것과 달리 국내에서는 제주지역을 중심으로 선인장 청차 등의 단순가공식품만이 생산되고 있어 그 이용은 걸음마 단계라 할 수 있다.
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