선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 즉 여러 개의 대장암 세포 주의 세포집락 형성을 통해 방사선 감수성을 알아내고 이 감수성의 순서와 MTT assay를 시행하여 얻은 방사선 감수성간에 상관 관계가 존재한다면 임상에서 MTT assay 사용할 수 있을 것이다. 또한 환자의 암조직을 직접 채취하는 것과 흡사한 조건을 만들기 위하여 대장암 세포 주를 마우스에 주입하여 종양을 형성시킨 후 이를 채취하고 방사선을 조사하여 MTT assay를 시행한 후 얻은 방사선에 대한 저해율(inhibition rate, %)이 기존의 세포집락 측정기법을 통한 감수성과 상관관계가 있는지 알아보고자 하였다.
- 환자 개인별 방사선에 대한 암세포의 감수성은 방사선 치료 효과에 중요한 영향을 준다. 본 연구는 생검이 가능한 직장암 환자를 대상으로 MTT assay를 통한 환자의 방사선 감수성 예측 가능성을전 임상 실험을 통하여 확인하고자 하였다.
- 따라서 항암제 선별이나 암 기초연구에 널리 사용되고 있는 실정이다. 본 연구는 임상에서 항암제 감수성 측정에 MTT assay를 이용한다는 점에 착안하여 수술 전 방사선 치료를 시행하는 직장암 환자의 방사선 감수성 예측에 사용할 수 있을 지를 확인하기 위하여, 전 임상 실험을 통하여 가능성을 검증하고자 하였다. 즉 여러 개의 대장암 세포 주의 세포집락 형성을 통해 방사선 감수성을 알아내고 이 감수성의 순서와 MTT assay를 시행하여 얻은 방사선 감수성간에 상관 관계가 존재한다면 임상에서 MTT assay 사용할 수 있을 것이다.
제안 방법
- 2 Gy에서의 생존분획(SF2)을 각 세포 별 방사선 민감도 순서에 반영하였다.
- MTT assay의 흡광도를 이용한 방사선에 대한 저해율은 각 세포별 방사선을 조사하지 않은 그룹의 흡광도 값을 기준으로 하였을 때, 방사선을 조사한 각 그룹의 흡광도 값의 비율을 계산한 것으로 다음의 공식을 이용하여 구하였다.
- 각 세포 주별 집락 형성률(Plating efficiency, PE)을 구하고, 각 방사선량에 대한 세포 생존 확률을 구하여 세포생존곡선을 완성하였다. HCT-8, LoVo, WiDr 그리고 CT-26세포 주의 집락형성률은 각각 54%, 47%, 49%, 45%였다.
- 각각의 세포 주를 단세포 현탁액으로 만든 후 계수하였으며, PBS 50μL 당 1×106개의 세포가 되도록 준비한 현탁액을 50μL 씩 누드 마우스(4주령)의 등에 주입하였다. 마우스에서 직경 1×1 cm 크기 이상의 종양세포 덩어리가 형성될 때까지 약 2주 동안 관리하였으며, 경추 탈골 후 종양덩어리를 취하였다.
- 방사선량 및 배양시간은 예비실험에서 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 및 30 Gy를 조사한 후 시간에 따른 MTT 저해율의 최적화를 본 연구5)를 토대로 하여 실제 임상에 적용 가능하다고 판단되는 10 Gy와 20 Gy의 조사량 및 48시간의 배양 시간을 선택하였다. 대조군, 10 Gy 및 20 Gy의 세 그룹으로 나누어 각각의 그룹 당 세 개의 배양접시를 사용하였다. 방사선 조사 48시간 후 배양액과 MTT 시약이 약 10：1의 비율이 되도록 MTT 시약을 첨가하여 2시간 배양하였다.
- 에 따라 α (linear inactivation coefficient; Gy-1)와 β (quadratic inactivation coefficient; Gy-2)를 excel 프로그램을 통하여 구하였다. 또한 각 세포 주의 방사선 감수성을 비교하기 위하여 2 Gy 에서의 생존 세포 확률(SF2)을 구하였다. 각 군간의 통계학적 차이는 SPSS version 15.
- 대조군, 10 Gy 및 20 Gy의 세 그룹으로 나누어 각각의 그룹 당 세 개의 배양접시를 사용하였다. 방사선 조사 48시간 후 배양액과 MTT 시약이 약 10：1의 비율이 되도록 MTT 시약을 첨가하여 2시간 배양하였다. 배양액을 제거한 후 배양접시에 100% DMSO 3 mL를 첨가하여 세포에 흡수된 MTT formazan을 녹여내고 96-well 배양접시에 100μL씩 분주하여 scanning multiwell spectrophotometer (Boitek instruments Inc.
- 5 cm 정도 크기의 조직으로 자른 후 3 mL의 배양액에 담아 방사선을 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy 세 그룹으로 나누어 조사하였다. 방사선 조사 후 조직에 accumax 용액 (Innovative Cell Technologies Inc., Sandiego, USA)을 가하여 단일세포로 만든 후 세포 수를 측정하였다. 96-well 배양접시에 각 그룹별로 하나의 well 당 1×105 cells/200μL (배양액)의 세포를 넣은 후 48시간 동안 5%의 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 세포가 안정적으로 배양접시에 부착된 것을 확인 후, 각각의 선량대로 방사선을 조사하였다. 방사선량 및 배양시간은 예비실험에서 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 및 30 Gy를 조사한 후 시간에 따른 MTT 저해율의 최적화를 본 연구5)를 토대로 하여 실제 임상에 적용 가능하다고 판단되는 10 Gy와 20 Gy의 조사량 및 48시간의 배양 시간을 선택하였다. 대조군, 10 Gy 및 20 Gy의 세 그룹으로 나누어 각각의 그룹 당 세 개의 배양접시를 사용하였다.
- 방사선 조사 48시간 후 배양액과 MTT 시약이 약 10：1의 비율이 되도록 MTT 시약을 첨가하여 2시간 배양하였다. 배양액을 제거한 후 well당 100% DMSO 100μL 를 첨가하여 세포에 흡수된 MTT formazan을 녹여내고 scanning multiwell spectrophotometer로 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3개 well의 평균 흡광도를 결과로 사용하였다.
- 방사선 조사 48시간 후 배양액과 MTT 시약이 약 10：1의 비율이 되도록 MTT 시약을 첨가하여 2시간 배양하였다. 배양액을 제거한 후 배양접시에 100% DMSO 3 mL를 첨가하여 세포에 흡수된 MTT formazan을 녹여내고 96-well 배양접시에 100μL씩 분주하여 scanning multiwell spectrophotometer (Boitek instruments Inc., Burlington, VT, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3개 well의 평균 흡광도를 결과로 사용하였다.
- 따라서 방사선을 받은 세포는 세포 분열이 일어날 때 죽거나 세포고사(아포토시스)의 과정을 거쳐 죽게 된다. 본 실험에 사용된 MTT assay는 세포 내 미토콘드리아 외막의 탈수소효소작용에의하여 노란색 수용성의 MTT tetrazolium이 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원되는 원리를 이용한 것으로 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 대사가 왕성한 살아있는 세포의 농도를 반영한다. 이 방법은 비교적 간편하고, 객관적 결과를 쉽게 정량화할 수 있어 실험실에서 세포사의 측정에 많이 사용되고 있다.
- 4%의 crystal violet 시약으로 30분간 염색한 후 세포집락을 계수하였다. 생존 분획(surviving fraction, SF)은 각 선량별 3개의 배양 접시의 세포집락 갯수의 평균을 이용하여, 다음 식으로 구하였다.
- 각각의 세포 주를 단세포 현탁액으로 만든 후 계수하여 직경 60 mm 배양접시에 2×105개씩 넣고 밤새 배양하였다. 세포가 안정적으로 배양접시에 부착된 것을 확인 후, 각각의 선량대로 방사선을 조사하였다. 방사선량 및 배양시간은 예비실험에서 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 및 30 Gy를 조사한 후 시간에 따른 MTT 저해율의 최적화를 본 연구5)를 토대로 하여 실제 임상에 적용 가능하다고 판단되는 10 Gy와 20 Gy의 조사량 및 48시간의 배양 시간을 선택하였다.
- 각각의 세포 주를 단세포 현탁액으로 만든 후 trypan blue 염색을 통해 계수하여 95% 이상이 단세포임을 확인하였으며, 직경 60 mm 배양접시 3개에 각각 선량에 따라0 Gy: 250개, 2 Gy: 250개, 4 Gy: 500개, 6 Gy: 1,000개, 8 Gy: 2,000개의 세포를 넣고 밤새 배양하였다. 세포가 안정적으로 배양접시에 부착된 것을 확인 후, 감마선 조사장치인 GC-3000 Elan (MDS Nordian, Ontario, Canad. 선량률：3 Gy/min)을 사용하여 각각의 선량대로 방사선을 조사한 후 육안으로 세포집락이 확인될 때까지 약 7일에서 10일 동안 배양하였다. 세포집락 형성 후 -20℃에 2시간 이상 보관해둔 고정액(100% methanol)으로 10분간 고정하고 0.
- 선량률：3 Gy/min)을 사용하여 각각의 선량대로 방사선을 조사한 후 육안으로 세포집락이 확인될 때까지 약 7일에서 10일 동안 배양하였다. 세포집락 형성 후 -20℃에 2시간 이상 보관해둔 고정액(100% methanol)으로 10분간 고정하고 0.4%의 crystal violet 시약으로 30분간 염색한 후 세포집락을 계수하였다. 생존 분획(surviving fraction, SF)은 각 선량별 3개의 배양 접시의 세포집락 갯수의 평균을 이용하여, 다음 식으로 구하였다.
- 마우스에서 직경 1×1 cm 크기 이상의 종양세포 덩어리가 형성될 때까지 약 2주 동안 관리하였으며, 경추 탈골 후 종양덩어리를 취하였다. 종양덩어리를 수술용 메스를 이용하여 0.2∼0.5 cm 정도 크기의 조직으로 자른 후 3 mL의 배양액에 담아 방사선을 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy 세 그룹으로 나누어 조사하였다. 방사선 조사 후 조직에 accumax 용액 (Innovative Cell Technologies Inc.
대상 데이터
- 본 실험에서는 결장의 선암종인 HCT-8, LoVo, CT-26 및 WiDr 등 총 4개의 세포 주를 사용하였다(Table 1). HCT-8과 LoVo는 American Type Culture Collection (ATCC)에서, CT-26과 WiDr은 한국 세포 주 은행으로부터 구입하였다. HCT-8 세포 주는 Horse serum (Gibco, New York, NY, USA) 10% 및 penicillin 10μL/mL 함유 RPMI1640으로 배양하였으며, LoVo 세포 주는 FBS 10% 및 penicillin 10μL/mL 함유 RPMI1640으로 배양하였다.
- 각각의 세포 주를 단세포 현탁액으로 만든 후 trypan blue 염색을 통해 계수하여 95% 이상이 단세포임을 확인하였으며, 직경 60 mm 배양접시 3개에 각각 선량에 따라0 Gy: 250개, 2 Gy: 250개, 4 Gy: 500개, 6 Gy: 1,000개, 8 Gy: 2,000개의 세포를 넣고 밤새 배양하였다. 세포가 안정적으로 배양접시에 부착된 것을 확인 후, 감마선 조사장치인 GC-3000 Elan (MDS Nordian, Ontario, Canad.
- 본 실험에서는 결장의 선암종인 HCT-8, LoVo, CT-26 및 WiDr 등 총 4개의 세포 주를 사용하였다(Table 1). HCT-8과 LoVo는 American Type Culture Collection (ATCC)에서, CT-26과 WiDr은 한국 세포 주 은행으로부터 구입하였다.
데이터처리
- 또한 각 세포 주의 방사선 감수성을 비교하기 위하여 2 Gy 에서의 생존 세포 확률(SF2)을 구하였다. 각 군간의 통계학적 차이는 SPSS version 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) 모수 검증(Anova test)을 통하여 구하였다.
- 각 군간의 통계학적 차이는 SPSS version 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) 비모수 검증(Mann-Whitney test)을 통하여 구하였다.
- 각 세포 주의 세포생존곡선은 방사선량에 따라 구한 세포의 생존 분획의 관계를 linear quadratic 모형의 수식인 S=e-αD-βD2에 따라 α (linear inactivation coefficient; Gy-1)와 β (quadratic inactivation coefficient; Gy-2)를 excel 프로그램을 통하여 구하였다. 또한 각 세포 주의 방사선 감수성을 비교하기 위하여 2 Gy 에서의 생존 세포 확률(SF2)을 구하였다.
성능/효과
- 세포의 내부 요인은 DNA 의 손상과 이를 복구하는 시스템과 관련된 일련의 복잡한 작용이다.22) 이런 복잡한 작용에서 MTT assay는 내부요인의 민감도를 반영할 여지가 있으나, 외부요인에 대한 변수는 전혀 고려되지 않는다. 따라서 환경 요인 변수에 대한 연구가 함께 병행되어야 정확한 민감도 측정이 될 것이다.
- 04). Ex vivo 실험에서는 HCT-8, WiDr, LoVo, CT-26의 순으로 그 값이 높아짐을 확인하였으며(Fig. 3), 역시 Lovo와 CT-26에 비하여 HCT-8와 WiDr의 방사선 감수성이 낮았다(p=0.05).
- 각 세포 주별 집락 형성률(Plating efficiency, PE)을 구하고, 각 방사선량에 대한 세포 생존 확률을 구하여 세포생존곡선을 완성하였다. HCT-8, LoVo, WiDr 그리고 CT-26세포 주의 집락형성률은 각각 54%, 47%, 49%, 45%였다. SF2는 CT-8과 WiDr의 경우 그 값이 각각 0.
- In vitro 및 ex vivo 실험의 MTT assay를 통해 얻은 흡광도 값은 Table 2와 같다. In vitro 실험의 흡광도에 따른 방사선 저해율을 구한 결과 WiDr, HCT-8, LoVo, CT-26의 순으로 그 값이 높아짐을 볼 수 있었으며(Fig. 2), 세포생존곡선과 마찬가지로 Lovo와 CT-26에 비하여 HCT-8과 WiDr의 방사선 감수성이 낮았다(p=0.04). Ex vivo 실험에서는 HCT-8, WiDr, LoVo, CT-26의 순으로 그 값이 높아짐을 확인하였으며(Fig.
- 또한 세포집락 측정기법에서의 방사선 감수성에 따른 순서 및 SF2를 표기하였다. SF2에 따른 방사선 감수성이 높은 순서는 HCT-8, WiDr, LoVo, CT-26의 순이었으며, MTT assay의 저해율을 통해 감수성이 높은 순서는 in vitro 에서 WiDr, HCT-8, LoVo, CT-26 순서였으며, ex vivo에서는 HCT-8, WiDr, LoVo, CT-26의 순이었다.
- 이는 두 방법을 통한 방사선 감수성 결과가 상관관계를 보임으로써 임상적용이 어려운 세포집락 측정기법 대신 10 Gy 및 20 Gy를 조사한 후 저해율을 구하는 MTT assay를 이용하여 방사선 감수성을 예측할 수 있는 임상 적용 가능성을 제시 하였다. 또한 단일 세포 주를 조직으로 형성시켜 실험을 진행한 ex vivo 방법을 통하여, 환자의 생검 조직을 채취하여 방사선 조사 후 MTT assay를 적용할 수 있다는 임상 연구의 가능성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 대장암 세포 주인 HCT-8, LoVo, CT-26및 WiDr에서 세포집락 측정 기법를 통한 생존 세포의 확률과 MTT assay를 통한 방사선에 의한 생존 저해율에 따른 결과를 비교하여, 두 방법 간의 방사선 감수성의 순서는 큰 차이가 없이 거의 일치함을 확인하였다. 이는 두 방법을 통한 방사선 감수성 결과가 상관관계를 보임으로써 임상적용이 어려운 세포집락 측정기법 대신 10 Gy 및 20 Gy를 조사한 후 저해율을 구하는 MTT assay를 이용하여 방사선 감수성을 예측할 수 있는 임상 적용 가능성을 제시 하였다.
- Kabeshima 등10)과 Yamaue 등11)은 대장암 환자를 대상으로, Xu 등12) 은 유방암 환자를 대상으로 MTT assay 방법이 임상에서 항암제 감수성 검사로 사용할 수 있는지 등을 검증하였다. 이 논문에 의하면 대장암 및 유방암 환자에서 MTT assay 의 저해율 정도에 따라 항암제의 감수성을 예측 할 수 있다는 결론을 도출하였다. 그러나 검체마다 반응도가 상이하였거나, 기존에 잘 알려진 예후 인자들과는 일반적으로 상관관계가 없는 문제점이 보고 되었다.
- 본 연구에서는 대장암 세포 주인 HCT-8, LoVo, CT-26및 WiDr에서 세포집락 측정 기법를 통한 생존 세포의 확률과 MTT assay를 통한 방사선에 의한 생존 저해율에 따른 결과를 비교하여, 두 방법 간의 방사선 감수성의 순서는 큰 차이가 없이 거의 일치함을 확인하였다. 이는 두 방법을 통한 방사선 감수성 결과가 상관관계를 보임으로써 임상적용이 어려운 세포집락 측정기법 대신 10 Gy 및 20 Gy를 조사한 후 저해율을 구하는 MTT assay를 이용하여 방사선 감수성을 예측할 수 있는 임상 적용 가능성을 제시 하였다. 또한 단일 세포 주를 조직으로 형성시켜 실험을 진행한 ex vivo 방법을 통하여, 환자의 생검 조직을 채취하여 방사선 조사 후 MTT assay를 적용할 수 있다는 임상 연구의 가능성을 확인하였다.
후속연구
- 따라서 실제 임상에서 직장암의 민감도 측정에 MTT assay를 적용 하기 위하여 다음과 같은 문제에 대한 연구를 필요로 한다. 10 Gy 및 20 Gy의 용량이 임상에서 방사선 감수성을 반영할 수 있는지 여부와 본 연구에서 사용한 배양시간이 적절한지에 대한 임상 연구를 필요로 한다. 또한 본 논문은 세포주 및 세포주를 누드 마우스에 주입하여 종양을 형성한 후 채취하였으므로 비교적 종양이 동질의 성질을 가지고 있어 검체마다 상이한 결과를 가져오지 않았다.
- 세포의 방사선 감수성 측정의 표준으로 세포집락 측정(clonogenic assay) 기법을 사용하며 이는1,2) 종양이나 재증식 능력을 가진 정상 조직에서 유래한 세포가 in vitro에서 성장해 형성하는 세포집락을 측정하는 것이다.3,4) 그러나 이 방법은 단일 세포 부유액의 준비가 어렵고, 세포의 종류에 따라 세포집락 형성 정도가 매우 낮아 실험치를 구하기 힘든 점, 실험을 진행하여 결과를 얻을 때까지 10일 이상의 결과가 소요되므로 환자를 대상으로 하는 임상용 감수성 측정 방법으로 사용하기에는 한계가 있다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay는 실험방법이 비교적 간단하고 반자동화되어 있어 객관적인 결과를 쉽게 정량화할 수 있고 실험기간도 3일 내지 5일 정도로 비교적 짧은 이점이 있다.
- 그러나 검체마다 반응도가 상이하였거나, 기존에 잘 알려진 예후 인자들과는 일반적으로 상관관계가 없는 문제점이 보고 되었다. 결국 MTT assay 를 통한 항암제의 감수성 검사의 가능성은 확인하였으나이 방법을 통하여 생존율을 증가 시킬 수 있는지에 대한 해답은 향후 잘 계획된 많은 수의 환자를 통한 전향적 연구를 필요로 하고 있다.
- 암환자의 방사선 치료 전 암세포의 방사선에 대한 감수성을 미리 측정할 수 있다면 임상적으로 많은 도움이 될 것이다. 항암요법에 대하여는 항암제 감수성을 측정하기 위한 방법이 시도되고 있는 반면, 방사선치료에 대한 감수성을 측정할 수 있는 방법은 흔치 않은 실정이다.
- 따라서 환경 요인 변수에 대한 연구가 함께 병행되어야 정확한 민감도 측정이 될 것이다. 즉 방사선 치료 전 직장암 환자를 대상으로 MTT assay를 이용한 방사선 감수성을 예측할 수 있을지 여부는 많은 임상 연구가 이루어진 후에 결론 내릴 수 있을 것이다.
- 본 연구는 임상에서 항암제 감수성 측정에 MTT assay를 이용한다는 점에 착안하여 수술 전 방사선 치료를 시행하는 직장암 환자의 방사선 감수성 예측에 사용할 수 있을 지를 확인하기 위하여, 전 임상 실험을 통하여 가능성을 검증하고자 하였다. 즉 여러 개의 대장암 세포 주의 세포집락 형성을 통해 방사선 감수성을 알아내고 이 감수성의 순서와 MTT assay를 시행하여 얻은 방사선 감수성간에 상관 관계가 존재한다면 임상에서 MTT assay 사용할 수 있을 것이다. 또한 환자의 암조직을 직접 채취하는 것과 흡사한 조건을 만들기 위하여 대장암 세포 주를 마우스에 주입하여 종양을 형성시킨 후 이를 채취하고 방사선을 조사하여 MTT assay를 시행한 후 얻은 방사선에 대한 저해율(inhibition rate, %)이 기존의 세포집락 측정기법을 통한 감수성과 상관관계가 있는지 알아보고자 하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.