목 적: 본 연구에서는 신생 생쥐 고환으로부터 다분화능 생식줄기세포주 (MGSCs)를 확립하고, 배아체 형성을 통한 삼배엽성 세포로의 분화 가능성을 확인하고자 하였다. 연구방법: 고환에서 유래한 MGSCs를 확립하기 위하여 생후 $2{\sim}3$일된 생쥐 고환 조직으로부터 세포들을 분리하여 1% FBS를 첨가한 생쥐 배아줄기세포주 배양조건에서 배양하였다. MGSCs 콜로니가 형성된 후에는 배양액의 FBS의 농도를 15%로 높였다. 이러한 과정으로 확립된 MGSCs의 미분화 및 분화 특성을 배아줄기세포주와 비교, 분석하였다. 결 과: 신생 생쥐 고환 조직에서 수획한 세포들로 실시한 9번의 배양실험에서 2개의 MGSCs 세포주를 확립하였다. MGSCs 세포주와 생쥐 배아줄기세포 모두에서 미분화 표지인자인 Thy-1, Oct-4, Nanog, Sox2의 발현과 alkaline phosphatase 활성을 관찰할 수 있었으며, MGSCs의 미세구조 또한 생쥐 배아줄기세포와 유사하였다. MGSCs에서 형성된 배아체에서 삼배엽성 표지유전자의 발현을 확인하였다. 결 론: 본 연구의 결과는 배아줄기세포의 윤리적인 문제점을 극복할 수 있는 고환 유래의 다분화능 MGSCs가 생물공학과 재생의학에서 효율적으로 이용될 수 있는 가능성을 보여준 것으로 생각된다.
목 적: 본 연구에서는 신생 생쥐 고환으로부터 다분화능 생식줄기세포주 (MGSCs)를 확립하고, 배아체 형성을 통한 삼배엽성 세포로의 분화 가능성을 확인하고자 하였다. 연구방법: 고환에서 유래한 MGSCs를 확립하기 위하여 생후 $2{\sim}3$일된 생쥐 고환 조직으로부터 세포들을 분리하여 1% FBS를 첨가한 생쥐 배아줄기세포주 배양조건에서 배양하였다. MGSCs 콜로니가 형성된 후에는 배양액의 FBS의 농도를 15%로 높였다. 이러한 과정으로 확립된 MGSCs의 미분화 및 분화 특성을 배아줄기세포주와 비교, 분석하였다. 결 과: 신생 생쥐 고환 조직에서 수획한 세포들로 실시한 9번의 배양실험에서 2개의 MGSCs 세포주를 확립하였다. MGSCs 세포주와 생쥐 배아줄기세포 모두에서 미분화 표지인자인 Thy-1, Oct-4, Nanog, Sox2의 발현과 alkaline phosphatase 활성을 관찰할 수 있었으며, MGSCs의 미세구조 또한 생쥐 배아줄기세포와 유사하였다. MGSCs에서 형성된 배아체에서 삼배엽성 표지유전자의 발현을 확인하였다. 결 론: 본 연구의 결과는 배아줄기세포의 윤리적인 문제점을 극복할 수 있는 고환 유래의 다분화능 MGSCs가 생물공학과 재생의학에서 효율적으로 이용될 수 있는 가능성을 보여준 것으로 생각된다.
Objective: The aim of this study was to investigate whether multipotent germline stem cells (MGSCs) can be established from neonatal mouse testis. Methods: Various cells containing MGSCs were collected from neonatal testis of ICR mice and allocated to plates for in vitro culture. After 7 days in cul...
Objective: The aim of this study was to investigate whether multipotent germline stem cells (MGSCs) can be established from neonatal mouse testis. Methods: Various cells containing MGSCs were collected from neonatal testis of ICR mice and allocated to plates for in vitro culture. After 7 days in culture, the cells were passed to a fresh culture plate and continuously cultured. From the third or fourth passage, the presumed MGSCs were cultured and maintained on mitomycin C-inactivated STO feeder cells. The MGSCs were cultured in a condition where mouse embryonic stem cells (ESCs) are cultured. Characteristics of the MGSCs were evaluated by RT-PCR, immunocytochemistry, alkaline phosphatase activity, karyotyping, and transmission electron microscopy. Results: Two MGSCs lines were established from 9 pooled sets of neonatal testicular cells. MGSCs colonies were morphologically undistinguishable from ESCs colonies and both MGSC lines as well as ESCs expressed undifferentiated stem cell markers, such as Thy-1, Oct-4, Nanog, Sox2 and alkaline phosphatase. Fine structure of undifferentiated MGSCs were similar to those of ESCs and 60% of MGSCs (12/20) had normal karyotype at passage 10. They were able to form embryoid bodies (EBs) and MGSC-derived EBs expressed marker genes of three germ layers. Conclusion: We could establish the MGSCs from neonatal mouse testis and they were differentiated to multipotent lineages of three germ layers. Molecular characteristics of MGSCs were similar to those of ESCs. Our results suggest a possibility that multipotent stem cells derived from testis, the MGSCs, could replace the ESCs in biotechnology and regenerative medicine.
Objective: The aim of this study was to investigate whether multipotent germline stem cells (MGSCs) can be established from neonatal mouse testis. Methods: Various cells containing MGSCs were collected from neonatal testis of ICR mice and allocated to plates for in vitro culture. After 7 days in culture, the cells were passed to a fresh culture plate and continuously cultured. From the third or fourth passage, the presumed MGSCs were cultured and maintained on mitomycin C-inactivated STO feeder cells. The MGSCs were cultured in a condition where mouse embryonic stem cells (ESCs) are cultured. Characteristics of the MGSCs were evaluated by RT-PCR, immunocytochemistry, alkaline phosphatase activity, karyotyping, and transmission electron microscopy. Results: Two MGSCs lines were established from 9 pooled sets of neonatal testicular cells. MGSCs colonies were morphologically undistinguishable from ESCs colonies and both MGSC lines as well as ESCs expressed undifferentiated stem cell markers, such as Thy-1, Oct-4, Nanog, Sox2 and alkaline phosphatase. Fine structure of undifferentiated MGSCs were similar to those of ESCs and 60% of MGSCs (12/20) had normal karyotype at passage 10. They were able to form embryoid bodies (EBs) and MGSC-derived EBs expressed marker genes of three germ layers. Conclusion: We could establish the MGSCs from neonatal mouse testis and they were differentiated to multipotent lineages of three germ layers. Molecular characteristics of MGSCs were similar to those of ESCs. Our results suggest a possibility that multipotent stem cells derived from testis, the MGSCs, could replace the ESCs in biotechnology and regenerative medicine.
배아체 형성은 지지세포 제거 후 단독배양된 MGSCs와 생쥐 배아줄기세포에 trypsin-EDTA (0.25% /0.02%)를 각각 처리하여 수획한 후, 박테리아 배양 접시에서 1.2×105 cells/mL의 세포를 접종한 후 5일동안 부유배양하면서 DMEM 배양액에 15% FBS를 첨가한 배아체 배양액을 2일 간격으로 교체하였다.
MGSCs와 생쥐 배아줄기세포의 배아체를 형성하기 위하여 강제부유법을 사용하였으며, 형성된 배아체에서 삼배엽성 표지인자의 발현 양상을 확인하였다. 배양 2~3일째부터 배아체가 형성되는 것을 두 가지 줄기세포에서 모두 관찰할 수 있었고 (Figure 3A-C), 배양 5일째 삼배엽성 표지인자의 발현 양상을 확인하기 위하여, 형성된 배아체에서 RT-PCR을 수행하였다. MGSCs와 생쥐 배아줄기세 포의 삼배엽성 표지인자의 발현을 관찰한 결과, 두가지 줄기세포에서 다소 상이한 발현 양상을 관찰할 수 있었지만, 외배엽성 표지유전자인 FGF-5, nestin, 중배엽성 표지인자인 enolase, α-globin, 내배엽 표지유전자인 α-fetoprotein, Gata-4 등이 모두 발현됨을 관찰할 수 있었다 (Figure 3D).
본 연구에서는 MGSCs와 생쥐 배아줄기세포를 박테리아 배양접시에서 강제 부유시켜 배아체를 형성시켰다. 이러한 배아체 형성 과정에서 부착한 상태로 성장하는 배아체의 빈도가 생쥐 배아줄기 세포 유래 배아체에 비해 MGSCs 유래 배아체에서 다소 높게 관찰되었다 (data not shown).
생후 2~3일된 생쥐 고환 조직을 해부기를 이용 하여 조각낸 후 collagenase (1 mg/mL)와 trypsinEDTA (0.25%/0.02%)로 처리하여 세포들을 분리하였다. 분리된 고환세포들을 조직 배양접시에서 하루 동안 배양하였고, 다음날 부유배양된 세포들만을 모아 새로운 배양접시로 옮겨 배양하였다.
역전사 반응 후 cDNA, 10 × PCR buffer, 5 U/µL Taq polymerase (Boehringer Mannheim, Germany), 2 mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany), 그리고 증류수에 미분화 표지인자인 Oct-4, Nanog, Sox2, Thy-1을 그리고 외배엽성 표지유전자인 FGF-5, nestin, 중배엽성 표지인자인 enolase, α-globin, 내배엽 표지유전자인 α-fetoprotein, Gata-4의 primers를사용하여 줄기세포의 미분화 및 분화 상태에서의 유전자 발현 정도를 RT-PCR을 통하여 확인하였다.
분리된 고환세포들을 조직 배양접시에서 하루 동안 배양하였고, 다음날 부유배양된 세포들만을 모아 새로운 배양접시로 옮겨 배양하였다. 이들을 7일 주기로 세 번의 계대배양을 시행한 후, mitomycin C로 비활성화된 STO 지지세포층 위에서 배양하였다. 이후 MGSCs로 생각되는 세포들을 1% FBS (Hyclone, Utah, USA)를 첨가한 생쥐 배아줄기세포주 배양조건에서 배양하였다.
탈수 과정은 50%알코올에서 무수알코올 농도 순으로 실시하였으며, 치환 및 포매는 100% propylene을 두 번 처리한 후 propylene : Epon (1:1)에 12시간 동안 치환하고, Epon 812에 포매하였다. 준비된 시료를 박편절 단기를 이용하여 60 nm의 두께로 절편하고, lead citrate와 uranyl acetate로 이중염색한 후 Hitachi H-7600 (Hitachi, Japan) 투과전자현미경을 사용하여 관찰하였다.
줄기세포에서 미분화 표지인자로 사용되는 ALP 의 활성도를 확인하기 위하여 MGSCs와 생쥐 배아 줄기세포를 대상으로 Naphthol/Fast Red Violet solution을 처리하여 발색 결과를 관찰하였다. MGSCs 와 생쥐 배아줄기세포 모두에서 강한 ALP 활성 반응을 관찰할 수 있었다.
추출한 total RNA를 MMLV, 5 × MMLV RT buffer, RNasin, 10 mM dNTP, 10 pM oligo-dT, 3차 증류수를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 역전사 (reverse transcription) 반응을 시켰다.
2)로 보정된 1% OsO4에서 90분간 후 고정하였다. 탈수 과정은 50%알코올에서 무수알코올 농도 순으로 실시하였으며, 치환 및 포매는 100% propylene을 두 번 처리한 후 propylene : Epon (1:1)에 12시간 동안 치환하고, Epon 812에 포매하였다. 준비된 시료를 박편절 단기를 이용하여 60 nm의 두께로 절편하고, lead citrate와 uranyl acetate로 이중염색한 후 Hitachi H-7600 (Hitachi, Japan) 투과전자현미경을 사용하여 관찰하였다.
대상 데이터
MGSCs와 생쥐 배아줄기세포 그리고 그로부터 형성된 배아체로부터 RNA를 추출하기 위하여 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 사용하였다. 각각의 시료는 1 mL의 Trizol reagent를 넣어 분쇄한 후 200 µL의 chloroform을 넣고 섞었다.
생후 2~3일된 생쥐 고환 조직에서 수획한 세포들로 실시한 9번의 배양실험에서 2개의 MGSCs 세포주를 확립하였다. 고환 유래 MGSCs 콜로니 형성은 배양 시작 후 3~4주째에 관찰할 수 있었다.
MGSCs와 생쥐 배아줄기세포의 미세구조적 형태를 관찰하기 위해 투과전자현미경 표본을 제작하였다. 지지세포를 제거한 후, 배양된 MGSCs와 생쥐 배아줄기세포의 콜로니들을 사용하였다. 전고정을 위해 0.
이론/모형
MGSCs와 생쥐 배아줄기세포의 배아체를 형성하기 위하여 강제부유법을 사용하였으며, 형성된 배아체에서 삼배엽성 표지인자의 발현 양상을 확인하였다. 배양 2~3일째부터 배아체가 형성되는 것을 두 가지 줄기세포에서 모두 관찰할 수 있었고 (Figure 3A-C), 배양 5일째 삼배엽성 표지인자의 발현 양상을 확인하기 위하여, 형성된 배아체에서 RT-PCR을 수행하였다.
성능/효과
줄기세포에서 미분화 표지인자로 사용되는 ALP 의 활성도를 확인하기 위하여 MGSCs와 생쥐 배아 줄기세포를 대상으로 Naphthol/Fast Red Violet solution을 처리하여 발색 결과를 관찰하였다. MGSCs 와 생쥐 배아줄기세포 모두에서 강한 ALP 활성 반응을 관찰할 수 있었다. 그러나 지지세포에서는 ALP의 활성에 따른 발색 반응을 관찰할 수 없었다 (Figure 2A-C).
MGSCs와 생쥐 배아줄기세 포의 삼배엽성 표지인자의 발현을 관찰한 결과, 두가지 줄기세포에서 다소 상이한 발현 양상을 관찰할 수 있었지만, 외배엽성 표지유전자인 FGF-5, nestin, 중배엽성 표지인자인 enolase, α-globin, 내배엽 표지유전자인 α-fetoprotein, Gata-4 등이 모두 발현됨을 관찰할 수 있었다 (Figure 3D).
결론적으로 본 연구에서는 국내 최초로 생쥐 고환에서 다분화능을 나타내는 MGSCs를 분리, 배양 하는데 성공하였으며, 배아체 형성을 통한 분화실험에서 이들이 삼배엽성 세포들로의 분화가 진행됨을 확인하였다. 이는 MGSCs가 배아줄기세포를 확립하는 과정에서 발생하는 윤리적 문제와 면역 거부반응을 극복할 수 있는 좋은 대안이 될 수 있는 가능성을 높여준 것으로 생각된다.
고환 유래 MGSCs 콜로니 형성은 배양 시작 후 3~4주째에 관찰할 수 있었다. 계대배양 과정에서 나타난 MGSCs 콜로니를 단일세포로 분리하여 배양하면 3~4일 후에 새로운 콜로니가 형성되고 5일이 경과되면 일부 세포들이 분화되기 시작하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 MGSCs의 계대배양을 3~4일을 주기로 실시하였으며, 6개월 이상의 계대배양 동안 특별한 콜로니 모양의 변화가 관찰되지 않았다.
계대배양 중인 MGSCs에서 염색체 분석 방법으로 20개의 중기 염색체를 관찰한 결과, 정상적인 염색체 수를 갖고 있는 세포는 12개 (60%)였다. 그외에 중기 염색체 상에서 각각 39개 (n=1)와 41개 (n=1)의 염색체를 갖는 세포와 80개 이상의 염색체수 (n=6)를 나타내는 세포들을 관찰할 수 있었다.
그러나 지지세포에서는 ALP의 활성에 따른 발색 반응을 관찰할 수 없었다 (Figure 2A-C). 계대배양 중인 MGSCs와 생쥐 배아 줄기세포에서 모두 미분화 표지인자인 Oct-4, Sox2, Nanog, Thy-1 유전자들 모두가 발현되는 것을 RTPCR 방법으로 확인할 수 있었다 (Figure 2D).
계대배양 과정에서 나타난 MGSCs 콜로니를 단일세포로 분리하여 배양하면 3~4일 후에 새로운 콜로니가 형성되고 5일이 경과되면 일부 세포들이 분화되기 시작하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 MGSCs의 계대배양을 3~4일을 주기로 실시하였으며, 6개월 이상의 계대배양 동안 특별한 콜로니 모양의 변화가 관찰되지 않았다.
즉, 동일한 조건하에서 분화를 유도하였지만, 실질적인 배아체 형성 결과에서 차이가 있었으며, 이에 따라 삼배엽 표지인자의 발현에서도 다소 차이가 발생할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 두 줄기세포의 배아체를 1~2주 정도 자연분화 실험을 실시한 결과, 두 세포군 모두에서 박동하는 심근세포를 관찰할 수 있었 으나, 그 빈도는 MGSCs에서 높게 관찰되었다 (data not shown). 이는 MGSCs가 정자를 형성하는 생식세포가 아닌 고환 조직 내의 중배엽성 세포에서 유래 하여, 중배엽성 세포로의 분화가 우성적으로 나타날 수도 있음을 시사하고 있다.
본 연구에서는 MGSCs와 생쥐 배아줄기세포를 박테리아 배양접시에서 강제 부유시켜 배아체를 형성시켰다. 이러한 배아체 형성 과정에서 부착한 상태로 성장하는 배아체의 빈도가 생쥐 배아줄기 세포 유래 배아체에 비해 MGSCs 유래 배아체에서 다소 높게 관찰되었다 (data not shown). 즉, 동일한 조건하에서 분화를 유도하였지만, 실질적인 배아체 형성 결과에서 차이가 있었으며, 이에 따라 삼배엽 표지인자의 발현에서도 다소 차이가 발생할 수 있을 것으로 생각된다.
투과전자현미경을 이용하여 MGSCs의 미세구조를 관찰한 결과, MGSCs 콜로니의 내부와 외층에 존재하는 세포들 간에 형태적 차이점을 볼 수 있었다. 콜로니 내부에 존재하는 세포들의 핵은 주로 진정염색질 (euchromatin)로 구성되어 있었으며 인이 매우 활성화되어 있음을 관찰하였다 (Figure 1D).
확립한 MGSCs의 형태를 생쥐 배아줄기세포와 비교한 결과, 두 군 모두에서 성장 및 증식 형태가 단일세포에서 세포와 세포 사이가 밀착된 다층의 콜로니 형태로 증식하며, 배양 4~5일이 경과하면 콜로니 상층부에 구형의 세포와 일부 어두운 색의 세포가 표층 부위에서 관찰되었다 (Figure 1A-C).
후속연구
29 이러한 결과는 생쥐 배아줄기세포와 MGSCs 간에 미분화 표지인자의 발현 양상을 포함해 근본적으로 서로 다른 특성을 지니고 있을 가능성을 제시하고 있다. 향후 이에 대한 심화 연구를 통해서 MGSCs의 특성을 보다 명확하게 확인해야 될 것으로 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
줄기세포는 분리 시기에 따라 어떻게 구분되는가?
줄기세포 (stem cells)는 미분화 상태로 오랜 기간 동안 자가분열을 통하여 증식이 가능하며, 적절한 조건하에서 특수한 기능을 수행하는 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 줄기세포는 분리시기에 따라 배아줄기세포 (embryonic stem cells)와 성체줄기세포 (adult stem cells)로 구분된다. 배아줄기세포는 포배기 시기의 내세포괴 (inner cell mass)로부터 유래하며 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)을 지니고 있다.
줄기세포는 어떤 능력을 가지고 있는가?
줄기세포 (stem cells)는 미분화 상태로 오랜 기간 동안 자가분열을 통하여 증식이 가능하며, 적절한 조건하에서 특수한 기능을 수행하는 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 줄기세포는 분리시기에 따라 배아줄기세포 (embryonic stem cells)와 성체줄기세포 (adult stem cells)로 구분된다.
embryonic stem cells의 특징은?
이러한 줄기세포는 분리시기에 따라 배아줄기세포 (embryonic stem cells)와 성체줄기세포 (adult stem cells)로 구분된다. 배아줄기세포는 포배기 시기의 내세포괴 (inner cell mass)로부터 유래하며 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)을 지니고 있다. 1981년 Evans와 Kaufman에 의하여 생쥐의 배아줄 기세포주가 확립된 이후,1 햄스터, 양, 돼지, zebrafish, 토끼, 원숭이, 흰쥐 등에서도 배아줄기세포의 분리가 성공적으로 이루어 졌다.
참고문헌 (29)
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