선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 소유래 원료를 사용하는 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 안전성을 보증하기 위해서 BHV1 을 정량적으로 신속하게 검출할 수 있는 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 개발하고자 하였다. BHV-1 전체 유전자를 대상으로 BHV-1 에만 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다.
- 25). 본 연구에서는 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BHV-1 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BHV-1 을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BHV-1 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 확립하고자하였다. 또한 확립된 real-time PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BHV-1 을 감염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BHV-1 을 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BHV-1 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BHV-1 을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BHV-1 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 확립하고자하였다. 또한 확립된 real-time PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BHV-1 을 감염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BHV-1 을 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
- MDBK 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다. CPE가 명백흐}게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, 400Xg에서 5분간 원심 분리하여 상층액은 따로 W 5.
- BHV-1의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titei를 50% tissue culture infectious dose (TCIEy)로 나타내었다. BHV-1 을 2% 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 0.
- 25 ml씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양배지를 0.25 ml씩 접종하였다. 그 후 CO2 배양기에서 5% CO2, 35℃로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- 25 ml씩 접종하였다. 그 후 CO2 배양기에서 5% CO2, 35℃로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- 1). Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgCe 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgCe 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- 5 μl를 첨가하여 최종부피를 25 nl로 맞추었다. 핵산증폭은 pre- incubatione 95℃에서 2분, denaturatione 95℃에서 30초, annealinge 30초(annealing 온도 최적화를 위해 52, 54, 56, 58 에서 PCR 수행), extentione 72℃에서 1분으로 하여 45 cycle 을 수행하였다. 45 cycle PCR 후 7JC에서 5분 반응시킨 후 1.
- 핵산증폭은 pre- incubatione 95℃에서 2분, denaturatione 95℃에서 30초, annealinge 30초(annealing 온도 최적화를 위해 52, 54, 56, 58 에서 PCR 수행), extentione 72℃에서 1분으로 하여 45 cycle 을 수행하였다. 45 cycle PCR 후 7JC에서 5분 반응시킨 후 1.5% agarose gel (Sigma Co., USA)을 사용하여 100 V 전압으로 30분 정도 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 PCR 반응산물을 확인하였다.
- BHV-1의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq (Bioneer, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. BHV-1 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다.
- BHV-1의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq (Bioneer, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. BHV-1 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다.
- 5 μl, template 2 μl에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 20 μl가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubatiorie 95℃에서 15분, denaturatione 95℃에서 10초, annealinge 30초(annealing 온도 최적화를 위해 52, 54, 56, 58, 60, C에서 realtime PCR 수행), extentione 72℃에서 30초로 하여 50 cycle을수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72부터 9SC까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다.
- 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72부터 9SC까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 MgCK 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 52℃에서 MgCl2를 2 mM에서 5 mM까지 변화시켜 첨가해준 BHV-1 DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.
- Titer를 측정하고자 하는 시료들과 함께 Titer가 2xl(f TCID50ml인 BHV-1을 순차적으로 2x10° TCIDMml까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료 속에 들어있는 BHV-1 DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다.
- 시료 속에 들어있는 BHV-1 DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다. 표준곡선은 BHV-1의 농도에 따라 real-time PCR 에 의해 검줄되는 crossing point 값을 TCID50 equivalent/ml로 전환하여 작성하였다.
- 확립된 BHV-1 DNA 정량법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 2xl07 TCIDJ ml인 BHV-1 을 순차적으로 2x10° TCIDsc/ml까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다.
- 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 2xl07 TCIDJ ml인 BHV-1 을 순차적으로 2x10° TCIDsc/ml까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 재현성 검증을 위해 titer가 2x 107 TCIDeml인 BHV-1 을 순차적으로 2x10° TCIDJml까지 10 단계 희석한 표준시료를 서로 다른 날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다.
- 민감도를 측정하기 위해 titer가 2xl07 TCIDJ ml인 BHV-1 을 순차적으로 2x10° TCIDsc/ml까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 재현성 검증을 위해 titer가 2x 107 TCIDeml인 BHV-1 을 순차적으로 2x10° TCIDJml까지 10 단계 희석한 표준시료를 서로 다른 날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 human parvovirus B19 (BBI Diagnostics, USA), minute virus of mice (ATCC VR 1346), bovine parvovirus (ATCC VR 767), porcine parvovirus (ATCC VR 742)에 대한 cross-reactivity® 즉정하였다.
- 재현성 검증을 위해 titer가 2x 107 TCIDeml인 BHV-1 을 순차적으로 2x10° TCIDJml까지 10 단계 희석한 표준시료를 서로 다른 날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 human parvovirus B19 (BBI Diagnostics, USA), minute virus of mice (ATCC VR 1346), bovine parvovirus (ATCC VR 767), porcine parvovirus (ATCC VR 742)에 대한 cross-reactivity® 즉정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 9.
- 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BHV-1 을 오염시킨 CHO 세포주에서 BHV-1 검출 시험을 실시하였다. CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (TMDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100X Hypoxanthine- Thyminidine supplement (HT supplement; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다.
- 세포주에서 BHV-1 검출 시험을 실시하였다. CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (TMDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100X Hypoxanthine- Thyminidine supplement (HT supplement; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44에 BHV1 을 감염시킨 후 4일 동안 배양하였다.
- 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 BHV-K 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline (PBS)으로 3번 세척한 다음 CHO DG44를 계대 배양하였다. 4일 동안 배양한 후 다시 계대배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BHV-1 이 존재하는지 여부를 확인하였다.
- 4일 동안 배양한 후 다시 계대배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BHV-1 이 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 liter가 107 TCIDJml인 BHV-1 을 사용하였으며, 음성 대조군으로는 CHO 세포주 배 양배지 또는 비감염된 CHO 세포주를 사용하였다.
- 확립된 real-time PCR을 소유래 콜라겐 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BHV-1 을 오염시킨 콜라겐에서 BHV-1 검출 시험을 실시하였다. Titer가 108 TCID50/ml인 BHV-1 을 순차적으로 10배씩 희석한 후 각 희석액 0.
- BHV-1 검출 시험을 실시하였다. Titer가 108 TCID50/ml인 BHV-1 을 순차적으로 10배씩 희석한 후 각 희석액 0.2 ml 을 소유래 콜라겐 1.8 ml에 spiking한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BHV-1 을 검출하였다 Real-time PCR 음성대조군으로는 바이러스를 첨가하지 않은 콜라겐을 사용하였다.
- 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 원료물질, 공정 중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스 검출을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다(1, 2). 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software를 이용하여 BHV-1 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). 일반 PCR을 실시하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다.
- 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software를 이용하여 BHV-1 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). 일반 PCR을 실시하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 2X103 TCIRc/ml과 2X101 TCUZ/ml인 BHV-1 을 시료로 PCR을 수행한 결과 primer 쌍 BHV-F2, BHV-R2가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시).
- PCR 조건을 최적화한 결과 annealing temperature와 MgCl2 농도는 각각 52。(2와 3 mM이었다. 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 2X10, TCIDRml인 BHV1 을 순차적으로 희석하여 PCR한 결과 2x 10° TCIDRml까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다(Fig.
- PCR 조건을 확립하였다. Forward primer로 BHV-F2를 reverse primer로 BHV-R2를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature를 최적화하였다(Fig. 2). Titer가 2x10, TCID5(/ml, 2X105 TCID50/ml, 2X103 TCID/ml, 2X101 TCID50/ml인 BHV를 시료로 annealing temperature를 52, 54, 56, 58℃로 변화시키며 real-time PCR을 수행하였을 때 52%2에서 crossing point가 가장낮게 나타나 52℃가 최적 온도임을 알 수 있었다.
- 최적 온도에서 MgCq 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다(Table 2). Titer가 2xl05 TCIDJml, 2xl03 TCID50/ml, 2x 101 TCIDJml인 BHV-1 을 시료로 MgCl2 농도를 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM로 변화시켜가며 real-time PCR을 수행하였을 때 2 mM에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 MgCL 농도는 2 mM임을 알 수 있었다.
- BHV-1 DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재 현성 (reproducibility), 특이성 (specificity) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titei가 2xl07 TCIDRml인 BHV-1 을 순차적으로10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다.
- 민감도를 측정하기 위해 titei가 2xl07 TCIDRml인 BHV-1 을 순차적으로10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 2 TCIDJml임을 확인할 수 있었다(Fig.
- 확립된 BHV-1 DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른날에 BHV-1 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을수행한 후 crossing point 값을 비교하였다(Fig. 4). BHV-1 log titer (log10 TCID50/ml; x)에 대한 crossing point 값(y) 간의 표준회귀식은 첫째 날의 경우 y=-4.
- (B) Agarose gel electro-phoresis of ttie PCR products. Specificity of the real-time PCR assay was evaluated using the optimized protocol and then the PCR products were analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis. M; 100 bp DNA ladder, 1; Bovine herpesvirus type 1, 2; human parvovirus B19, 3; minute virus of mice, 4; bovine parvovirus, 5; porcine parvovirus, NC; Negative control.
- 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BHV1 을 오염시킨 CHO 세포주에서 BHV-1 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BHV-1 을 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다.
- BHV-1 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BHV-1 을 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다. BHV- 1은 CHO DG44 세포주에서 병변효과를 나타내지 않았다(Fig.
- 세포배양 상청액 4 ml을 회수하고, CHO DG44 세포를 trypsin을 처리하여 4 ml 부피로 회수하였다. 세포배양 상청액과 CHO 세포에서 각각 DNA를 추출하고, 확립된 real-time PCR을 활용하여 BHV-1 을 정량 검출하였다(Fig. 6C). 세포배양액에서는 1.
- 확립된 real-time PCR을 소유래 콜라겐 제조공정에 적용할 수있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BHV-1 을 오염시킨 콜라겐에서 BHV-1 검출시험을 실시하였다. Titer가 108 TCIDRmT인 BHV-1 을 순차적으로 10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하고, 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence 값의 증가를 관찰한 글과 10 TCID50/ml 까지 정량적으로 검출할수 있었다(Fig.
- 일반적으로 BT 세포주 단층 세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정 시료, 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일 이상 배양을 하면서 병변효과를 관찰하여 오염 여부를 판단하거나 haemadsorption test를 통해 바이러스 오염여부를 판단한다. 또한 BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정 시료, 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일 이상 배양한 다음 소유래 바이러스에 대한 항혈청을 이용해 면역형광 방법으로 바이러스 오염 여부를 판단한다. 이러한 생물학적 실험법의 경우 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 드는 단점이 있다.
- 핵산증폭은 pre-incubatiorie 95℃에서 15분, denaturatione 95℃에서 10초, annealinge 30초(annealing 온도 최적화를 위해 52, 54, 56, 58, 60, C에서 realtime PCR 수행), extentione 72℃에서 30초로 하여 50 cycle을수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72부터 9SC까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 MgCK 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 52℃에서 MgCl2를 2 mM에서 5 mM까지 변화시켜 첨가해준 BHV-1 DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.
대상 데이터
- BHV-1 (ATCC VR-188)의 배양과 정량을 위해 Madian-Derby bovine kidney (MDBK; ATCC CCL-22) 세포를 사용하였다. MDBK 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다.
- 사용하였다. MDBK 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다.
- BHV-1 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기서열은 NCBI data base에 보고된 BHV-1 complete genome (NC 001847)을 기초로 Primer3 Software# 이용하여 디자인하였다(Table 1). Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgCe 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다.
- BHV-1 DNA는 GENE ALL™ Blood SV Mini Kit (General Biosystem, Korea)을 사용하여 분리하였다. PCR 반응을 위해 바이러스 genomic DNA 2 μl, 10 pmol forward primer 1 pl, 10 pmol reverse primer 1(11, 2x GoTaq®Green Master Mix (Promega, USA) 12.
- 특이성 검증을 위해 human parvovirus B19 (BBI Diagnostics, USA), minute virus of mice (ATCC VR 1346), bovine parvovirus (ATCC VR 767), porcine parvovirus (ATCC VR 742)에 대한 cross-reactivity® 즉정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 9.4X105 IU/ml, 106 TCID/ml, 106 TCID50/ml, 106 TCIDRmi이었다.
- 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BHV-1 이 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 liter가 107 TCIDJml인 BHV-1 을 사용하였으며, 음성 대조군으로는 CHO 세포주 배 양배지 또는 비감염된 CHO 세포주를 사용하였다.
- PCR 시험법을 개발하고자 하였다. BHV-1 전체 유전자를 대상으로 BHV-1 에만 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 5 쌍의 primer 중 BICP4 (early-intermediate transcription control protein) 유전자를 대상으로 디자인한 primer쌍 BHV-F2, BHV- R2의 민감도가 가장 우수하였다.
데이터처리
- Reproducibility of real-time PCR assay for quantitative detection of BHV-I. The standard curves were obtained by the regression analysis of crossing point values versus initial virus titer. These results were obtained from three independent assays perfonned at different days.
이론/모형
- 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. BHV-1 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 AccuPower Greenstar PC'R Premix Ex Taq 5 pl, 10 pmol forward primer 0.
성능/효과
- 일반 PCR을 실시하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 2X103 TCIRc/ml과 2X101 TCUZ/ml인 BHV-1 을 시료로 PCR을 수행한 결과 primer 쌍 BHV-F2, BHV-R2가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시). PCR 조건을 최적화한 결과 annealing temperature와 MgCl2 농도는 각각 52。(2와 3 mM이었다.
- 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 2X10, TCIDRml인 BHV1 을 순차적으로 희석하여 PCR한 결과 2x 10° TCIDRml까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (www.
- 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/) 한 결과 PCR 산물이 BHV-1 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시).
- 2). Titer가 2x10, TCID5(/ml, 2X105 TCID50/ml, 2X103 TCID/ml, 2X101 TCID50/ml인 BHV를 시료로 annealing temperature를 52, 54, 56, 58℃로 변화시키며 real-time PCR을 수행하였을 때 52%2에서 crossing point가 가장낮게 나타나 52℃가 최적 온도임을 알 수 있었다.
- 2). Titer가 2xl05 TCIDJml, 2xl03 TCID50/ml, 2x 101 TCIDJml인 BHV-1 을 시료로 MgCl2 농도를 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM로 변화시켜가며 real-time PCR을 수행하였을 때 2 mM에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 MgCL 농도는 2 mM임을 알 수 있었다.
- 민감도를 측정하기 위해 titei가 2xl07 TCIDRml인 BHV-1 을 순차적으로10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 2 TCIDJml임을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). Melting curve 분석 결과 BHV-1 DNA에 특이적인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대조군에서는 BHV-1 DNA에 특이적인 peak를 확인할 수 없었다 (Fig.
- 3B). 증폭된 PCR 산물을 2% (w/v) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 BHV-1 양성시료에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(자료 미제시).
- 다른 DNA virus들 (human parvovirus B19, minute virus of mice, bovine parvovirus, porcine parvovirus)을 대상으로 특이성을 실험할 결과 BHV-1의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 완충용액 음성 대조군과 같이 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 없었다(Fig. 5A). Realtime PCR 산물을 1.
- 5A). Realtime PCR 산물을 1.5% agarose gel 상에서 분석한 결과 BHV-1 양성 대조군에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성 대조군에서는 PCR 반응 산물이 생성되지 않았다(Fig. 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 BHV-1에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 BHV-1에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 8xl05 TCID50 equivalent/ml BHV-1 이 검출되었다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% (w/v) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 BHV-1 양성시료, 세포배양액, 세포에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 음성 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(Fig. 6D). BHV-1 이 비감염된 CHO DG44에서도 BHV-1 을 검출할 수 없었다(자료 미제시).
- BHV-1 검출시험을 실시하였다. Titer가 108 TCIDRmT인 BHV-1 을 순차적으로 10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하고, 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence 값의 증가를 관찰한 글과 10 TCID50/ml 까지 정량적으로 검출할수 있었다(Fig. 7).
- 최근에 와서 real-time PCR 을 이용하여 소의 정자에서 BHV-1 감염여부를 판별하려는 연구가 시도되었다(26). 최적화된 조건에서 real-time PCR의 민감도는 3.8 TCIDRml이었다.
- BHV-1 전체 유전자를 대상으로 BHV-1 에만 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 5 쌍의 primer 중 BICP4 (early-intermediate transcription control protein) 유전자를 대상으로 디자인한 primer쌍 BHV-F2, BHV- R2의 민감도가 가장 우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 MgCl2 농도 등 PCR 조건을 최적화한결과 확립된 실험법의 민감도는 2 TCIDRml이었다.
- 5 쌍의 primer 중 BICP4 (early-intermediate transcription control protein) 유전자를 대상으로 디자인한 primer쌍 BHV-F2, BHV- R2의 민감도가 가장 우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 MgCl2 농도 등 PCR 조건을 최적화한결과 확립된 실험법의 민감도는 2 TCIDRml이었다. 본 연구결과는 Wang 등(26)이 발표한 real-time PCR의 민감도 3.
- 99 이상으로 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높음을 알 수 있었다. 생물의 약품의 품질관리 평가에 있어 시험법의 민감도와 재현성은 분석의 정확성, 특이성, 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 시험법은 BHV-1 을 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다.
- 이러한 생물학적 실험법의 경우 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 드는 단점이 있다. 본 연구를 통해 확립된 BHV-1 검출 시험법을 CHO 세포주에서 BHV-1 검출 시험에 활용하였을 때, BHV-1에 오염된 CHO 세포주가 병변현상을 일으키지는 않았지만, CHO 세포주와 세포주배양 상등액에서 BHV-1 을 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 BHV-1 real-time PCR 시험법은 동물세포주 검증과 생산공정 검증에서 BHV-1 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다.
- 본 연구를 통해 확립된 BHV-1 검출 시험법을 CHO 세포주에서 BHV-1 검출 시험에 활용하였을 때, BHV-1에 오염된 CHO 세포주가 병변현상을 일으키지는 않았지만, CHO 세포주와 세포주배양 상등액에서 BHV-1 을 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 BHV-1 real-time PCR 시험법은 동물세포주 검증과 생산공정 검증에서 BHV-1 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다. 동물세포주 검증에서 realtime PCR을 활용한 BHV1 검출 시험은 지금까지 보고된 바 없다.
- 하지만 BHV- 1 을 효과적으로 검출할 수 있는 시험법이 확립되지 않아 realtime PCR 시험법 같은 민감한 시험법이 요구되고 있다. 본 연구를 통해 확립된 BHV-1 검출 시험법을 0.5% 콜라겐에 적용하였을 때 10 TCID50/ml 까지 정량적으로 검출할 수 있어 콜라겐의 품질보증에 활용할 수 있는 우수한 시험법임을 확인하였다. 민감도를 높이기 위해서는 콜라겐으로부터 BHV-1 DNA 추출 조건의 최적화가 필요하다고 판단된다.
후속연구
- 활용할 수 있는 적절한 방법이다(1). 본 연구를 통해 확립된 BHV-1 real-time 시험법도 세포배양 유래 생물의약품 제조공정에서 바이러스 제거 검증과 크로마토그래피 세척 검증에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.