Background: The purpose of this study was to evaluate recently developed real-time polymerase chain reaction (PCR) assay kit to detect Mycobacterium tuberculosis (MTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM) in respiratory specimens. Methods: We assessed the positive rate of the real-time PCR assay to...
Background: The purpose of this study was to evaluate recently developed real-time polymerase chain reaction (PCR) assay kit to detect Mycobacterium tuberculosis (MTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM) in respiratory specimens. Methods: We assessed the positive rate of the real-time PCR assay to detect MTB and NTM in 87 culture-positive specimens (37 sputum, 50 bronchial washing), which were performed real-time PCR by using $Real-Q_{TM}$ MTB&NTM Kit from January 2009 to June 2009, at Gyeongsang University Hospital. To compare the efficacy with the TB-PCR assay, we evaluated 63 culture-positive specimens (19 sputum, 44 bronchial washing) for MTB or NTM, which were performed TB-PCR by using ABSOLUTETM MTB II PCR Kit from March 2008 to August 2008. Results: Among 87 specimens tested using real-time PCR, MTB and NTM were cultured in 58 and 29, respectively. The positive rate of real-time PCR assay to detect MTB was 71% (22/31) and 92.6% (25/27) in AFB stain-negative and stain-positive specimens. For NTM, the positive rate of real-time PCR was 11.1% (2/18) and 72.7% (8/11) in AFB stain-negative and stain-positive specimens. Among 63 specimens performed using TB-PCR, MTB and NTM were cultured in 46 and 17, respectively. The positive rate of TB-PCR was 61.7% (21/34) and 100% (12/12) in AFB stain-negative and stain-positive specimens. TB-PCR was negative in all NTM-cultured 17 specimens. Conclusion: TB/NTM real-time PCR assay is useful to differentiate MTB and NTM in AFB stain-positive respiratory specimens and it is as effective in detecting MTB with TB-PCR.
Background: The purpose of this study was to evaluate recently developed real-time polymerase chain reaction (PCR) assay kit to detect Mycobacterium tuberculosis (MTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM) in respiratory specimens. Methods: We assessed the positive rate of the real-time PCR assay to detect MTB and NTM in 87 culture-positive specimens (37 sputum, 50 bronchial washing), which were performed real-time PCR by using $Real-Q_{TM}$ MTB&NTM Kit from January 2009 to June 2009, at Gyeongsang University Hospital. To compare the efficacy with the TB-PCR assay, we evaluated 63 culture-positive specimens (19 sputum, 44 bronchial washing) for MTB or NTM, which were performed TB-PCR by using ABSOLUTETM MTB II PCR Kit from March 2008 to August 2008. Results: Among 87 specimens tested using real-time PCR, MTB and NTM were cultured in 58 and 29, respectively. The positive rate of real-time PCR assay to detect MTB was 71% (22/31) and 92.6% (25/27) in AFB stain-negative and stain-positive specimens. For NTM, the positive rate of real-time PCR was 11.1% (2/18) and 72.7% (8/11) in AFB stain-negative and stain-positive specimens. Among 63 specimens performed using TB-PCR, MTB and NTM were cultured in 46 and 17, respectively. The positive rate of TB-PCR was 61.7% (21/34) and 100% (12/12) in AFB stain-negative and stain-positive specimens. TB-PCR was negative in all NTM-cultured 17 specimens. Conclusion: TB/NTM real-time PCR assay is useful to differentiate MTB and NTM in AFB stain-positive respiratory specimens and it is as effective in detecting MTB with TB-PCR.
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문제 정의
. 본 연구는 객담 및 기관지세 척액과 같은 호흡기 검체에서 결핵균과 NTM 검출에 TB/NTM real-time PCR의 유용성을 알아보기 위한 것이다.
제안 방법
1차 PCR이 끝난 후 튜브에 2차 PCR 혼합물을 18 μL, 1 차 PCR 효소 0.5 μL와 1차 산물 1.5 μL를 첨가한 다음 Roter-Gene TM 3000/6000을 이용하여 95 oC 5분의 변성 단계 후 94 oC 30 초, 65 oC 30초, 72 oC 30초의 PCR 주기로 25회 한 후 72 oC 5분 동안 시행하였다.
결과는 각각의 채널에서 파장을 확인하여 CT 값을 구하고 35 미만인 경우에 양성으로 판독하였다. MTB와 NTM을 구별하는 방법은 MTB signal은 나오지 않고 mycobacterai genus-specific signal만 나오는 경우에 NTM으로 추정하였다.
PCR 반응 후 반응물 7 μL를 2% 아가로스 젤에 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 확인하 였다.
PCR은 튜브에 2×PCR mixture를 12.5 μL을 넣고, MTB와 NTM, Internal control (IC) primer/probe 혼합액을 넣은 다음 추출한 검체 DNA 2.5 μL를 첨가하고, Roter-Gene TM 3000/6000 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 이용 하여 50 oC 2분, 95 oC 10분의 변성 단계 후 95 oC 15초, 67 oC 45초 동안 40주기로 시행하였다.
5 μL를 첨가하 였다. Roter-Gene TM 3000/6000을 이용하여 95 o C 5분의 변성 단계 후 94 oC 30초, 68 oC 30초, 72 oC 30초의 PCR 주기로 35회 한 후 72 oC 5분 동안 시행하였다. 1차 PCR이 끝난 후 튜브에 2차 PCR 혼합물을 18 μL, 1 차 PCR 효소 0.
8) 2∼3배를 첨가하여 다시 섞어주었다. 검체를 4 oC에서 4,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후 침전물을 회수하여 검사를 시행하였다. 항산균 도말은 Ziehl-Neelsen 염색법을 이용하여 미국질병 예방통제국의 기준에 따라 판독하였고 3 , 배양은 3% Ogawa 한천 배지에 접종하고 37 oC에서 최대 8주까지 배양하 였다.
5 μL를 첨가하고, Roter-Gene TM 3000/6000 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 이용 하여 50 oC 2분, 95 oC 10분의 변성 단계 후 95 oC 15초, 67 oC 45초 동안 40주기로 시행하였다. 결과는 각각의 채널에서 파장을 확인하여 CT 값을 구하고 35 미만인 경우에 양성으로 판독하였다. MTB와 NTM을 구별하는 방법은 MTB signal은 나오지 않고 mycobacterai genus-specific signal만 나오는 경우에 NTM으로 추정하였다.
호흡기 검체에서 항산균 도말검사는 음성이면서 TB/NTM real-time PCR이 양성인 경우와 도말검사는 양성이면서 TB/NTM real-time PCR이 음성인 경우, 항산균 도말검사와 TB/NTM realtime PCR이 모두 음성 또는 양성인 경우를 조사하였다. 기존의 TB-PCR법과 비교하기 위해 2008년 3월부터 8월까지 TB-PCR을 시행하고 객담 및 기관지세척액에서 결핵균 또는 NTM이 배양된 59명(남자 39명, 여자 20명; 평균나이 61.3세) 환자의 63예 검체(객담 19예, 기관지세척액 44예) 를 대상으로 후향적으로 같은 방법으로 분석하였다.
항산균 도말은 Ziehl-Neelsen 염색법을 이용하여 미국질병 예방통제국의 기준에 따라 판독하였고 3 , 배양은 3% Ogawa 한천 배지에 접종하고 37 oC에서 최대 8주까지 배양하 였다. 배양 후 집락이 보이면 SD bioline TB Ag MPT64 Rapid (Standard Diagnostic Inc., Seoul, Korea)를 이용한 면역크로마토그래피 방법으로 결핵균과 NTM을 일차적으로 구별하였다.
7세)을 대상으로 총 87예의 검체(객담 37예, 기관지세 척액 50예)를 후향적으로 분석하였다. 호흡기 검체에서 항산균 도말검사는 음성이면서 TB/NTM real-time PCR이 양성인 경우와 도말검사는 양성이면서 TB/NTM real-time PCR이 음성인 경우, 항산균 도말검사와 TB/NTM realtime PCR이 모두 음성 또는 양성인 경우를 조사하였다. 기존의 TB-PCR법과 비교하기 위해 2008년 3월부터 8월까지 TB-PCR을 시행하고 객담 및 기관지세척액에서 결핵균 또는 NTM이 배양된 59명(남자 39명, 여자 20명; 평균나이 61.
대상 데이터
2009년 1월부터 6월까지 객담 및 기관지세척액에서 TB/NTM real-time PCR을 시행하고 배양에서 결핵균 또는 NTM이 동정된 80명(남자 54명, 여자 26명; 평균 나이 61.7세)을 대상으로 총 87예의 검체(객담 37예, 기관지세 척액 50예)를 후향적으로 분석하였다. 호흡기 검체에서 항산균 도말검사는 음성이면서 TB/NTM real-time PCR이 양성인 경우와 도말검사는 양성이면서 TB/NTM real-time PCR이 음성인 경우, 항산균 도말검사와 TB/NTM realtime PCR이 모두 음성 또는 양성인 경우를 조사하였다.
TB/NTM real-time PCR을 시행한 검체에서 결핵균과 NTM이 배양된 경우는 각각 58예, 29예이었다. 결핵균이 배양된 58예 중에서 47예(81%)가 TB real-time PCR 양성 이었고, NTM이 배양된 29예 중에서 NTM real-time PCR 이 양성인 경우는 10예(34.
데이터처리
, Chicago, IL, USA) 프로 그램을 이용하였다. 검사간의 민감도 비교는 교차분석을 통하여 chi-sqaure test를 시행하였으며, p값이 0.05 이하인 경우 의미 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
ABSOLUTETM MTB II PCR Kit (Biosewoom Inc.)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 시행하였다. 전처리와 DNA 추출은 real-time PCR과 동일한 방법으로 실시하였 다.
Real-QTM MTB&NTM Kit (Biosewoom Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 시행하였다.
검체를 4 oC에서 4,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후 침전물을 회수하여 검사를 시행하였다. 항산균 도말은 Ziehl-Neelsen 염색법을 이용하여 미국질병 예방통제국의 기준에 따라 판독하였고 3 , 배양은 3% Ogawa 한천 배지에 접종하고 37 oC에서 최대 8주까지 배양하 였다. 배양 후 집락이 보이면 SD bioline TB Ag MPT64 Rapid (Standard Diagnostic Inc.
성능/효과
3%)이었고 도말양성인 12예는 TB-PCR이 모두 양성이었다. NTM이 배양된 17예는 TBPCR이 모두 음성이었고, 항산균 도말검사가 양성으로 나와 NTM으로 간주한 경우는 4예이었고(Table 3) Mycobacterium abscessus가 2예, M. gordonae과 M. intracellulare가 각각 1예이었다.
4%) 이었다(Table 1). NTM이 배양된 29예 중에서 도말음성은 18예이었고 이 중 NTM real-time PCR 양성은 2예(11.1%), 음성은 16예(88.9%)이었고, 도말양성 11예 중에서 NTM real-time PCR 양성은 8예(72.7%), 음성은 3예(27.3%)이 었다(Table 1). NTM이 배양된 29예 중에서 균동정을 의뢰하여 확인한 예는 Table 2와 같다.
본 연구의 결과로 보면 TB/NTM real-time PCR 검사는 도말음성 보다는 도말양성 검체에서 결핵균과 NTM을 감별하는데 더 유용할 것으로 생각된다. NTM이 배양된 검체에서 도말양성의 경우 real-time PCR 양성률은 72.7% (8/11예)이었지만, 도말음성의 경우는 11.1% (2/18예)로 도말양성 검체에 비해 상대적으로 매우 낮은 양성률을 보였다. Chang 등 17 의 보고에서도 도말음성 검체 8예 중에서 1예에서만 NTM real-time PCR이 양성으로 나왔고, Kim 등 15 은 6예의 도말음성 검체에서 3예가 NTM real-time PCR 양성으로 보고하고 있다.
TB/NTM real-time PCR 검사는 본 연구에서 결핵균을 진단하는 데도 높은 민감도를 보였다. 도말양성 검체에서 TB real-time PCR은 92.
결론적으로 TB/NTM real-time PCR은 항산균 도말양성의 호흡기 검체에서 결핵균과 NTM을 감별하는데 유용하 며, 결핵균의 검출에도 기존 TB-PCR만큼 우수한 것으로 판단된다.
TB/NTM real-time PCR을 시행한 검체에서 결핵균과 NTM이 배양된 경우는 각각 58예, 29예이었다. 결핵균이 배양된 58예 중에서 47예(81%)가 TB real-time PCR 양성 이었고, NTM이 배양된 29예 중에서 NTM real-time PCR 이 양성인 경우는 10예(34.4%)이었다. 도말음성이고 결핵 균이 배양된 31예에서 TB real-time PCR 양성은 22예 (71%), 음성은 9예(29%)이었으며, 도말양성 27예 중에서 TB real-time PCR 양성은 25예(92.
TB/NTM real-time PCR 검사는 본 연구에서 결핵균을 진단하는 데도 높은 민감도를 보였다. 도말양성 검체에서 TB real-time PCR은 92.6% (25/27예)의 양성률을 보였고 도말음성 검체에서도 71% (22/31예)의 양성률을 보였는데 이것은 TB-PCR 검사를 시행한 도말음성 검체에서의 양성률 61.7% (13/21예) 보다 높은 것이다(p＜0.05). Kim 등 15 의 보고에서도 본 연구와 비슷한 70% 정도의 양성률을 보였다.
4%)이었다. 도말음성이고 결핵 균이 배양된 31예에서 TB real-time PCR 양성은 22예 (71%), 음성은 9예(29%)이었으며, 도말양성 27예 중에서 TB real-time PCR 양성은 25예(92.6%), 음성은 2예(7.4%) 이었다(Table 1). NTM이 배양된 29예 중에서 도말음성은 18예이었고 이 중 NTM real-time PCR 양성은 2예(11.
TB-PCR 검사를 시행한 검체에서 결핵균이 배양된 경우는 46예이었고 도말검사 음성은 34예, 양성은 12예이었 다. 도말음성인 34예 중에서 TB-PCR 양성은 21예 (61.7%), 음성은 13예(38.3%)이었고 도말양성인 12예는 TB-PCR이 모두 양성이었다. NTM이 배양된 17예는 TBPCR이 모두 음성이었고, 항산균 도말검사가 양성으로 나와 NTM으로 간주한 경우는 4예이었고(Table 3) Mycobacterium abscessus가 2예, M.
Chang 등 17 의 보고에서도 도말음성 검체 8예 중에서 1예에서만 NTM real-time PCR이 양성으로 나왔고, Kim 등 15 은 6예의 도말음성 검체에서 3예가 NTM real-time PCR 양성으로 보고하고 있다. 본 연구와 국내의 연구결과를 보면 도말음성 검체에서 NTM에 대한 real-time PCR의 민감도는 낮은 것으로 생각된다.
폐결핵과 NTM에 의한 폐질환은 임상증상이나 방사선 소견으로 감별하기 쉽지 않기 때문에 실제 임상에서는 항산균 도말검사가 양성으로 나와 폐결핵으로 치료하다가 배양에서 NTM이 동정되어 약제를 변경하거나 중단하는 경우를 흔히 보게 된다 18 . 항산균 배양 양성의 검체에서 NTM의 검출률은 점점 증가하는 추세인데 8,9 , 본 연구에서도 배양 양성 검체에서는 30% (46/150예)이었고, 도말양 성의 경우에는 24.4% (12/49예)를 차지하였다. 이런 점으로 볼 때 항산균 도말이 양성이 나와도 NTM의 가능성을 항상 염두에 두어야 하며 적절한 치료와 방침을 결정하기 위해 조기 감별이 중요하다고 할 수 있다.
후속연구
본 연구의 결과로 보면 TB/NTM real-time PCR 검사는 도말음성 보다는 도말양성 검체에서 결핵균과 NTM을 감별하는데 더 유용할 것으로 생각된다. NTM이 배양된 검체에서 도말양성의 경우 real-time PCR 양성률은 72.
Kim 등 15 의 보고에서도 본 연구와 비슷한 70% 정도의 양성률을 보였다. 본 연구의 결과로 보면 결핵균 검출에 대한 real-time PCR 민감도도 기존의 TB-PCR 만큼 우수할 것으로 생각되지만 두 검사 간의 민감도를 비교하기 위해서는 동일한 검체를 이용한 검사가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
실시간 중합효소연쇄반응법은 어떤 방법이며 장점은 무엇인가?
실시간 중합효소연쇄반응법(real-time PCR)은 특정 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질의 방출을 실시간으로 분석하여 측정하는 방법으로 정량화 할 수 있고 중합효 소연쇄반응법 이후 전기영동과 같은 추가적인 과정이 필요 하지 않기 때문에 오염의 위험성을 낮출 수 있다. 또한 기존 중합효소연쇄반응법에 비해 검사 시간을 단축할 수 있으며 특이도를 높일 수 있는 다양한 장점을 가지고 있다 13
항산균 도말 염색검사 및 결핵균 배양검사의 단점을 보완한 방법으로 무엇을 언급하고 있으며 장점과 단점은?
도말 및 배양검사의 단점을 보완한 결핵균 중합효소연 쇄반응법(TB-PCR)은 검체 내에 소수의 균이 존재하더라도 진단이 가능하고 신속한 결과를 얻을 수 있어 조기진단에 널리 이용되고 있으며, 민감도와 특이도가 높아 결핵의 진단에 널리 사용하고 있다 4,5. 하지만 위양성의 위험이 있고, 최근 빈도가 증가되고 있는 NTM을 직접 검출하지 못하는 단점이 있다 6.
항산균 도말 염색검사의 장점과 단점은 무엇인가?
항산균 도말 염색검사는 간단한 방법으로 신속하게 결과를 확인할 수 있지만 민감도가 낮고 결핵균과 비결핵성 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM)과의 감별이안 되며, 결핵균 배양검사는 검체에 존재하는 결핵균이 아주 적어도 검출되는 장점이 있고 특이도도 높지만 결과를 확인하는데 시간이 오래 걸리는 단점이 있다 3.
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