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제안 방법
- 세포주(IWH/3T3)를 5% CO2, 37笆하에 24시간 배양 후 hemocytometer로 측정하여 1.2Xi" cells/ml이 되도록 배양액의 세포 농도를 조절하였다. 이를 96 well plate에 세포수가 well 당 1.
- 50 ml 둥근바닥 플라스크에 염화메칠렌(10 ml)을 가하고 2, 3, 4, 5-tetramethoxytoluene( 1)(1.00 g, 4.71 mmol)과 4-chloro-2-methy 1-1 -benzenesulfonyl-2-butene(2)(0.80 g, 3-27 mm이)을 용해시키고 무수 염화철(μ1)(0.13 g, 0.80 mmol)을 상온에서 가한 후, 반응물을 12시간동안 환류시켰다. 반응액 온도를 25℃로 조절하고 초산(2.
- Coenzyme Q10의 합성 방법은 다음과 같으며 coenzyme Q), coenzyme Q2, coenzyme Q3, coenzyme Q3-L, coenzyme Qa-C 및 coenzyme Q4는 coenzyme Qm과같은 방법으로 제조하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 isoprene unit 수가 다른 coenzyme Qi, Q2, Q3, Q3-L, Q3-C. Q4와 Qio을 scheme 1과 같이 합성하고[17], coenzyme Qn 유도체들의 항산화력 측정[18]과 세포독성 검사(MTT)[19] 를 실시하여 coenzyme Qn의 n수에 따른 구조와 생리활성 관계를 알아보았다.
- 생존율을 측정하였다 [18]. 근위세뇨관 상피세포 (LLC-PK1 cell)를 5% CO2, 37℃ 하에서 24시간 배양 후 hemocytometer로 측정하여 1.5><106 cells/ml이 되도록 너]] 양액의 세포농도를 조절하였다. 이를 96 well plate에 세포 수가 well당 1.
- 지질 과산화 유발물질인 2,2f-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)^- 생체 내에서 혈류를 타고 산소분자와 반응하여 탄소라 디칼을 형성하고 이어서 과산화 라디칼을 생성하여 생체막의 구조를 파괴하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 실험에서는 근위세뇨관 상피세포(LLC-PK1 cell)에 AAPH 와 합성한 coenzyme Qn 유도체들을 처리하여 세포 파괴 에 대한 세포 생존율 측정을 통해 coenzyme Qn 유도체들의 항산화력 효과를 확인하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 coenzyme Qi의 0.
- Coenzyme Q10은 소의 심장에서 발견된 보조효소로 활성산소가 원인인 성인병을 예방하거나 고혈압, 동맥경화, 울혈성 심부전증, 협심증, 근육이영양증 등의 효과가 있어 치료 목적으로 사용되고 있으며, 주름살 개선, 미백효과와 자외선 차단 등의 기능성 화장품으로 널리 사용되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 coenzyme Q10과 isoprene unit의 개수가 다른 n=l-4와 10인 여러 coenzyme Qn 유 도체들을 합성하였다. 합성한 coenzyme Qn 유도체들을 구조별로 나열하면 2,3-dimethoxy-5-methylbenzoquinone (coenzyme Qo), 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-isoprenyl-l,4- benzoquinone(coenzyme Q】)，2,3-dimethoxy-5- methyl-6-븡eranyl-l,4-benzoquinone(coenzyme Q2), 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-famesyl-l ,4-benzoquinone(coen zyme Q3), 2,3-dimethoxy 5 methyl 6 (isoprenyL4 linoloyl )-1,4-benzo-quinone(coenzyme Q3-L), 2,3-dimethoxy-5- methyl-6-(isoprenyl-4-citronellyl)-l,4-benzo-quinone(coenz yme Q3-C), 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-geranylgeranyl-l,4- benzoquinone(co-enzyme Q4)와 2,3-dimethoxy-5-methyl-6 -deca-prenyl-1,4-benzoquinone(coenzyme Q10)과 같다.
- 50 mmol)을 가하고 힌] 산(20 ml)과 테트라히드로퓨란(3 ml)을 가하여 완전히 녹인 후 반응 온도를 -5℃로 조절하였다. 삼브롬화인(1.76 g, 6.50 mmol) 에 테트라히드로퓨란(1.60 ml)을 혼합한 용액을 10분간 서서히 가한 후 피리딘 1~2방울 가하였다. 온도를。笆로 조절하여 45분 동안 교반 하였다.
- 세포 독성 검사는 MTT 측정 방법[19]을 변형하여 측정하였다. 세포주(IWH/3T3)를 5% CO2, 37笆하에 24시간 배양 후 hemocytometer로 측정하여 1.
- 세포배양은 배양하고자 하는 세포와 배지를 petri dish 에 넣은 후 C6, 37℃ 배양기에서 배양하고 현미경과 hemocytometer를 이용하여 세포배양 상태와 세포수를 측정하였다. 세포에 영양분을 공급하기 위해 Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium 89%, fetal bovine serum 10%, antibiotics 1%로 제조한 배지를 5% CO2> 37℃ 배양기에서 보관하였다.
- 세포에 영양분을 공급하기 위해 Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium 89%, fetal bovine serum 10%, antibiotics 1%로 제조한 배지를 5% CO2> 37℃ 배양기에서 보관하였다. 배지 9 ml에 세포배양액 1 ml를 가하여 총 부피가 10 ml가 되도록 하여 5분간 원심분리(시000 rpm)한 뒤 상등액을 제거하고 침전물에 배지 1 ml를 가하여 현탁액을 제조하였다.
- 아세톤(10 ml)에 2, 3, 4, 5-tetramethoxy-6-(iso-prenyl-4-benzenesulfonyl)toluene(3)(1.00 g, 2.38 m mol)을용해하고 0℃로 온도를 조절한 후 암모늄 이질산세륨 (IV)(0.33 g, 0.6 mm이)을 가하였다. 1시간 동안 15-20℃ 에서 반응시킨 후 염화메칠렌(15 ml)과 증류수(15 ml)를가하여 20분간 교반 후 충분리를 하였다.
- 분리된 유기층에 포화 차아황산나트륨 용액(15 ml)을 넣은 후 상온에서 1시간 동안 교반하고 포화 소금물(20 ml)을 가하여 유기층을 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후 감압 농축 시켜 목적물(0.90 g, 96%)을 얻었다. IR (KBr disk, cm'1) : 1558, 1359, 1356, 1 172, 'H NMR(C DCI3, 8) : 1.
- 1 ml)을 가하여 1시간 교반 하였다. 유기층을 분리하여 증류수로 세척한 다음 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하여 오일 상인 목적물(L13 g, 84%)을 얻었으며 이 화합물을 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다. IR (KBr disk, cm'1) : 3400, 1554, 1470, 1354, 'H NMR(CDCb, 6) : 0.
- 4시간 후 배양액을 제거하고 DMSO 100 以를 가하여 상온에서 5분 교반 하면 보라색을 띠게 된다. 이 액을 가지고 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 대조물질과 각 시료들의 흡광도 값을 측정하였다.
- 이와 같이 배양한 배양액을 제거하고 DMSO 100 或를 가하여 상온에서 5분 교반 하면 보라색 용액이 된다. 이 액을 가지고 ELISA reader를 사용하여 570 nm에서 대조 물질과 각 시료들의 흡광도 값을 측정하였다.
- 즉, 합성 중간체로 hydroquinone head grcmp의 -OH기를 보호하는데 실란 화합물을 사용하여 실릴 옥시 화합물로 제조해 사용하였고 그 결과 제조공정의 단축 수율 증대 및 고순도로 목적물을 제조할 수 있었다. 합성한 coenzyme Qn 유도체들의 생리활성 검증은 항산화력 측정, 세포독성검 사를 실시하여 coenzyme Q)의 n수에 따른 구조와 생리활성 관계를 알아보았다. 그 결과 항산화력 측정에서는 coenzyme Qio과 비교하여 coenzyme Q2, coenzyme Q3, coenzyme Q3-L, coenzyme Q3-C와 coenzyme Q4는 모든 농도에서 우수한 항산화 효과를 나타내어 coenzyme Qn 의 isoprene unit이 불규칙적으로 배열되거나, isoprene unit의 형태가 직선 구조의 형태가 아닐 때 우수한 항산화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
- 항산화력 측정은 근위세뇨관 상피세포(LLC- PK1 cell) 의 생존율을 측정하였다 [18]. 근위세뇨관 상피세포 (LLC-PK1 cell)를 5% CO2, 37℃ 하에서 24시간 배양 후 hemocytometer로 측정하여 1.
- 현미경으로 관찰하여 각 모서리에 있는 사각형 (1x1 mm) 내의 세포 수를 측정하여 4로 나눈 값을 평균 세포 수로 하였다. 측정한 세포 수를 식(전체 세포 수 = 평균 세포 수 X 104 X 희석농도)에 대입하여 배양한 세포 수를 구하였다.
- 활성산소가 세포 생체막의 구성 성분인 불포화 지방산 을 공격하여 과산화 반응이 유발되어 체내에 과산화지질 이 축적되는 것에 대한 coenzyme Q„ 유도체들의 항산화력 측정 실험을 실시하였다. 지질 과산화 유발물질인 2,2f-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)^- 생체 내에서 혈류를 타고 산소분자와 반응하여 탄소라 디칼을 형성하고 이어서 과산화 라디칼을 생성하여 생체막의 구조를 파괴하는 것으로 알려져 있다.
대상 데이터
- 사용하였다. 2, 2 , -azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH) 는 Wako사의 제품을 사용하였다.
- 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압 농축하였다. 농축액을 실리카겔 크로마토그래피법(초산에틸과 헥산 1:9) 으로 정제하여 coenzyme Qo(O.85 g, 85%)을 얻었다. 다른 coenzyme Q„ 화합물들도 위와 같은 방법으로 제조하였다.
- 또한, coenzyme Qn을 제조하기 위해 현재까지 이 분야의 제조에 알려져 있지 않은 중간체를 사용하였다. 즉, 합성 중간체로 hydroquinone head grcmp의 -OH기를 보호하는데 실란 화합물을 사용하여 실릴 옥시 화합물로 제조해 사용하였고 그 결과 제조공정의 단축 수율 증대 및 고순도로 목적물을 제조할 수 있었다.
- 본 합성에 사용한 모든 시약은 Aldrich 사의 제품을 이용하였으며 용매는 공업용 시약을 정제하여 사용하였다. 2, 2 , -azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH) 는 Wako사의 제품을 사용하였다.
- 2xl04 cells/ml이 되도록 옮겨준 후 5% CO2, 37℃하에서 2시간 동안 배양하였다. 시료는 화합물 Coenzyme Qt, Q2, Q3, Q3-L, Q3-C, Q4와 아o을 각각 DMSO로 용해시켜 0.4, 0.2, 0.1과 0.04 mmol 농도로 제조하였다. 96 well plate에 배양 중인 세포의 배양액을 버리고 위에서 각 농도별로 제조한 시료 100 以와 2, 2'-azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH) 용액 10 j以와 dulbecco's modified eagle's medium 90 /必를 혼합한 후 24시간 동일 조건에서 배양하였다.
- 2xl04 cells/ml이 되도록 옮겨준 후 5% CO2, 37℃하에서 24시간 동안 배양하였다. 시료는 화합물 coenzyme Qi, Q2, Q3, Q3-L, Q3- C, Q4와 Qio 에 DMSO를 가하여 40 mmol 시료를 제조하였고 이를 희석하여 4.0, 0.4와 0.04 mmol로 제조하였다. 위에서 배양한 96 well plate에 배양 중인 세포의 배양액을 버린 뒤 각각의 Coenzyme Qn 시료 용액 100 以와 무수 에탄올 10 以와 dulbecco's modified eagle's me- dium 90 成를 혼합한 후 8시간 동일 조건에서 배양하였다.
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