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문제 정의
- 본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 라미프릴의 두 가지 제제인한독약품의 “트리테이스프로텍트®정”을 대조약으로, (주)태평양제약의, 라미프린®정”을 시험약으로 하여 두 약물이 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 생물학적동등성시험 기준7)에 따라 건강한 성인 남자를 대상으로 시험하였다. 두 라미프릴 제제의 혈장 중 농도 곡선하 면적 (AUCt)과 최고 혈장 중 농도(Cmax)를 분산분석 (ANOVA, analysis of variance) 및 90% 신뢰구간을 이용한 통계 검정을 통해 생물학적동등성을 비교, 판정하고자 하였다.
제안 방법
- HPLC를 사용하여 혈중 약물 분석을 위해 펌프(Prostar 220, Varian, Palo Alto, CA, 미국), 자동주입기(Prostar 400, Varian, Palo Alto, CA, 미국) 등으로 구성된 HPLC system(Varian, Palo Alto, CA, 미국)를 사용하였으며, 검출기로는 1200L MS/MS(Varian, Palo Alto, CA, 미국)를, 데이터 처리는 Star Chromatography Workstation 6.0(Varian, Palo Alto, CA, 미국)을 이용하였다. 또한, 원심분리기(MR 300, 한일과학산업사, 인천, 한국), 탁상용 혼합기 (Maxi Mix H, Thermolyne, Iowa, 미국)를 사용하였다.
- 검량선의 작성 - 검량선 작성을 위하여 라미프릴 표준품을 50% 메탄올 수용액에 녹여 농도를 100μg/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 공혈장으로희석하여 라미프릴의 혈장 중 농도가 각각 0.2 (정량한계 농도), 2, 5, 20, 50, 100 및 200ng/mL 농도가 되도록 혈장 시료를 만들었다. 각각의 표준혈장 200)iL에 내부표춘물질로 에날라프릴 (lpig/mL) 35μL를 넣고 흔들어 섞은 뒤 500 |1Le] acetonitrile을 가하고, 20초간 진탕한 후, 10분 동안 12,000 rpm에서 원심분리 시켰다.
- 두 종류의 라미프릴 제제인 (주)태평양제약의 “라미프린® 정, , 과:한독약품의 “트리테이스프로텍트®정, , 이 그 생체이용률에 있어 생물학적으로 동등함을 평가하기 위해 건강한 성인 남자 26명을 대상으로 2x2 라틴방격법에 따라 라미프릴 1정(라미프릴로써 10mg)을 경구 투여한 후, 12시간에 걸쳐 총 14시점에서 채혈하고 LC-MS/MS를 이용하여 혈장 중 약물의 농도를 측정하여 얻은 결론은 다음과 같다.
- 7 kg (60-95)이었다. 모든 지원자들에게 시험에 대한 목적, 방법, 이상약물반응 발생 가능성 및 이에 대한 대책 등을 설명하고 참가동의서를 받은 후 생물학적동등성 시험을 실시하였다.
- 시험당일 피험자들의 상완 정맥부위에 heparin-locked( 150 unit/mL) angio catheter(보인메디카, 구미, 한국)를 설치하고 blank 혈액으로 각각 10mL 씩을 채혈한 후, 대조약 또는시험약 각각 1정(라미프릴로써 10mg)을 물 240mL와 함께투약하였다. 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2 min 간격으로 하였다.
- 약물투약은 2시기 2제품의 라틴방격법에 따른 교차시험법으로 투약계획을 세우고 26명의 피험자를 군당 13인씩 무작위로 A, B 2군으로 나누고 제 1 기 때 A군에는 대조약인 “ 트리테이스프로텍트®정”을 B군에는 시험약인, 라미프린®정 , , 을 투여하였고, 제 2기 때에는 그 반대로 투여하였다. 투여량은 각 제제 모두 1정(라미프릴로써 10 mg)으로 하였다.
- 남은 잔사에 50% 메탄올 수용액 300 μL로 재조성시킨 후 이 중 20 μL의 상등액을 취하여 LC-MS/MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 면적비에 대한 라미프릴의 면적비를 가지고 검량선을 작성하였으며 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 86 hi으로 나타났다. 위의 보고에서 확인한 라미프릴과 라미프릴렛의 반감기를 근거로 생물학적동등성시험기준 제 18조 제 4항 휴약 기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약 기간을 두고자 휴약기간을 7일로 하였다.
- 시료를 처리하여 실시하였다. 이에 따라 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 라미프릴의면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈장 중 라미프릴의 농도를 산출하였다.
- 또한, 동일 농도 범위에서 라미프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 표준편차를 라미 프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 1Q으로 하여 검토한 결과정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 0.2ng/mL로 정하였다.
- 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2 min 간격으로 하였다. 채혈은 라미프릴제제의 혈중소실반감기(약 2.55 hr)을 토대로 반감기의 3배 이상인 12 hr동안 실시하였고, 채혈 횟수는 약물 투약 직전과 투약 후 0.16, 0.33, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 12 hr 의 총 14시점에서 실시하였다.
- 혈장 시료의 처리 및 혈중 농도의 계산 - 혈장 시료의 분석은 피험자로부터 시간별로 채취하여 -70℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후, 이 혈장 200 μ1-를 취하여 상기 검량선 작성을 위한 시료 처리법과 동일한 방법으로 시료를 처리하여 실시하였다. 이에 따라 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 라미프릴의면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈장 중 라미프릴의 농도를 산출하였다.
대상 데이터
- Co.(Springfield, NJ, 미국)로부터 구입하여 사용하였으며, 기타 그 외의 시약들은 1등급 시약들을 사용하였다.
- 0(Varian, Palo Alto, CA, 미국)을 이용하였다. 또한, 원심분리기(MR 300, 한일과학산업사, 인천, 한국), 탁상용 혼합기 (Maxi Mix H, Thermolyne, Iowa, 미국)를 사용하였다.
- 라미프릴과 내부표준물질인 에날라프릴의 precusor ionepositive ion mode에서 [M+H]*으로 검출되어, 라미프릴은 m/z 342.2 및 에날라프릴은 m/z 329.3의 ion을 precusor ion 으로 선정하였다. 선정한 precusor ion의 product ion scan을 통하여 가장 많이 검출되는 라미프릴 및 에날라프릴의 product ione 각각 m/z 112.
- 3의 ion을 precusor ion 으로 선정하였다. 선정한 precusor ion의 product ion scan을 통하여 가장 많이 검출되는 라미프릴 및 에날라프릴의 product ione 각각 m/z 112.1 및 m/z 256.0 (Figure 1)의 ion으로 선정하였다.
-
재료 및 시약
시험에 사용된 약물은 라미프릴을 10mg 함유한 정제로써, 시험약인, 라미프린®정(제조번호: J54707001, 사용기한: 2007. 1. 17)”과 대조약인 “트리테이스프로텍트®정(제조번호 : 1419297, 사용기한: 2010. 5. 31)”은 (주)태평양제약으로부터 얻었다.
- 피험자는 시험 당시 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험 기준7에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인남성으로서 병력이 없고 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원자를 모집 공고하고 지원신청서를 받아 지원자 32인을 모집하였고, 선정기준에 모두 합당하고 제외기준에 해당되지 않는 자로서 생물학적동등성시험에 적합한 건강한 사람으로 판정된 26명을 피험자로 선정하였다. 피험자로 선정된 사람들의 평균 나이는 만 23.
데이터처리
- 남자를 대상으로 시험하였다. 두 라미프릴 제제의 혈장 중 농도 곡선하 면적 (AUCt)과 최고 혈장 중 농도(Cmax)를 분산분석 (ANOVA, analysis of variance) 및 90% 신뢰구간을 이용한 통계 검정을 통해 생물학적동등성을 비교, 판정하고자 하였다.
이론/모형
- 1% formic acid 수용액과 acetonitrile의 혼합액(58:42, v/v)을, 유속은 210μL/min, 주입량은 20μL 로 LC-MS/MS에 주입하였다. 라미프릴의 검출은 MS/MS MRM(multiple reaction monitoring)방법으로 검출하고, electrospray ionization(ESI)의 방법으로 이온화를 하였으며, nebulizing gas, turbo gas 및 sheathe gas로는 질소를 이용하였고, collision gas로는 argorr을 사용하였다. Nebulizer의 온도는 350℃로 설정하고, 압력은 20.
- 혈장 중의 라미프릴을 acetonitrile을 이용한 제단백법을이용하여 추출하고, LC-MS/MS를 이용하여 .분석한 결과 Figure 2과 같이 라미프릴은 약 1.
- 혈장'중 라미프릴의 농도를 측정하기 위하여 이미 보고된8,9) 분석법을 참조하여 생체시료를 분석하였다.
성능/효과
- 이상의 결과를 종합해보면 시험약인 "라미프린®정”은 대조약인 “트리테이스프로텍트®정”에 대하여 생물학적동등성시험의 판단 기준인 2항목(AUG, Gg)에서 모두 동등한 것으로 나타나 이 두 제제는 생물학적으로 둥등하다고 사료되었다.
- 1. LC-MS/MS를 이용하여 혈장 중 라미프릴의 농도를 빠른 시간 내에 0.2ng/mL(정량한계농도)까지 측정함으로써 생체이용률의 시험에 이용할 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖는 분석조건을 확립할 수 있었다.
- 2. 두 약물의 분산분석 결과 로그변환한 AUG, AUCU Cmax에 대한 결과를 보면 유의수준(a)=0.05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으나, 개체 내 변동 중 제제간 변동을살펴본 결과 AUG와 AUCinf의 경우 두 제제가 유의적인차이가 있는 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고 로그변환한 AUG, AUCinf, Cmax의 90% 신뢰 한계가 모두 log 0.
- 약 15%로 보고되었다.6)경구 투여 후 미 대사 체로 배설되는 라미프릴의 양은 약 23%정도이며 대부분 라미 프릴렛과 라미 프릴렛의 glucuronide 포합체로 배설되었다?)
- 260 보다 작아 교차 시험이제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 개체 내 변동에서기간별(period effect) 변동의 경우 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, AUG와 AUG* 경우 제제별(formulation effect) 변동에서 F 값이 각각 5.274 및 4.800으로 F 분석표의 한계값인 4.260 보다 크게 나와 유의적인 차이가 있는것으로 나타났다.
- 공혈장, 0.2(정량한계 농도), 2, 5, 20, 50, 100 및 200 ng/mL의 혈장표준액을 분석하였을 때, y=0.0124x-0.00068 (r=0.9998)로 0.2~200 ng/mL의 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 얻을 수 있었다. 또한, 동일 농도 범위에서 라미프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 표준편차를 라미 프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다.
- 05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으나, 개체 내 변동 중 제제간 변동을살펴본 결과 AUG와 AUCinf의 경우 두 제제가 유의적인차이가 있는 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고 로그변환한 AUG, AUCinf, Cmax의 90% 신뢰 한계가 모두 log 0.8 ~ log 1.25 이내에 포함되어 생물학적동등성 시험기준을 만족하였다.
- 또한, 피험자로부터 산출한 약물속도론적 파라미터(AUG, AUGnf, Gnax, Tmax 및 S)의 평균값을 Table II에 나타내었다. 대조약 및 시험약의 AUG의 평균값은 70.30±42.27 및 77.45±44.78 (ng・hr/mL)로 대조약에 비해그 차가 10.2% 였으며, AUdfe 각각 71.99±43.55 및78.96±45.64(ng・hr/mL)로 두 제제의 차이가 9.7% 였다. 대조약 및 시험약의 #의 평균값은 63.
- 2~200 ng/mL의 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 얻을 수 있었다. 또한, 동일 농도 범위에서 라미프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 표준편차를 라미 프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 1Q으로 하여 검토한 결과정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 0.
- 모든 피험자들에게 시험 전 10일간, 시험기간 중 및 휴약기간 중에는 음주나 항생제 및 진통제를 포함한 일체의 약물의 복용을 금지시켰다. 시험 전 저녁부터 모두 동일하게 12시간을 이상을 절식시키고, 물 이외의 음료수는 제한하였다.
- 즉, 두 제제는 분산분석 결과 통계적으로 유의적인 차이를 나타내었으나, 생물학적동등성시험 기준에 의거한 90% 신뢰구간으로 판정하였을 때 두 제제는 생물학적으로 동등함을 알 수 있었다.
- 한편, 로그변환한 평균치 차의 AUCt, AUCtaf 및 Cmax에대한 90% 신뢰한계는 각각 log 1.03~log 1.19, log 1.02-log 1.19 및 log0.98log 1.17로 나타나 생물학적동등성시험기준인 log 0.8에서 log 1.25이내인 조건을 만족하였다.
- 혈장 중 라미프릴에 대한 본 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다(Table I).
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