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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 LC-MS-MS를 이용하여 리시노프릴의 두 가지 제제인 현대약품공업(주)의 “제스트릴®정”을 대조약으로, 헥살코리아 주식회사의 “리시헥살®정”을 시험약으로 하여 두 약물이 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 생물학적 동등성 시험기준10)에 따라 건강한 성인 남자를 대상으로 시험하였다. 두 리시노프릴 제제의 혈장 중 농도 곡선하 면적 (AUG), 최고혈장 증 농도(Cmax)와 최고 혈장 중 농도 도달시간(Tmax) 등을 분산분석 (ANOVA, analysis of variance)및 90% 신뢰구간을 이용한 통계 검정을 통해 생물학적 동등성 시험을 비교, 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 표준편차로 나타내었다. 생물학적동등성시험기준10)에 의하여 두 제제의 동등성을 평가하고 Tmax를 제외한 파라미터들에 대해 로그 변환한 후, Equiv TestTM를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하고 각 변동요인 간에 유의성 여부를 검토하였으며 90% 신뢰한계를 구함으로써 현대약품공업(주)의 "제스트릴®정”과 헥살코리아의 "리시헥살®정”의 생물학적 동등성 여부를 판정하였다.
- 5 psi로 전압은 1650 V에서 분석하였다. MRM mode로 리시노프릴(m/z)은 406.484.0(22.0 V), 에날라프릴 (m/강은 377.4 → 234.0(17.0 V)을 모니터링 하였다.
- 검량선 작성을 위하여 리시노프릴 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 100μg/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 공혈장으로 희석하여 리시노프릴의 혈장 중 농도가 각각 2(정량한계 농도), 5, 20, 50, 100 및 200ng/mL 농도가 되도록 혈장시료를 만들었다. 각각의 표준혈장 0.
- 두 종류의 리시노프릴 제제인 헥살코리아주식회사의 “리시헥살®정”과 현대약품(주)의 “제스트릴®정, , 이 그 생체이용률에 있어 생물학적으로 동등함을 평가하기 위해 건강한 성인 남자 28명을 대상으로 2x2 라틴방격법에 따라 리시노프릴 2정(리시노프릴로써 20 mg)을 경구 투여한 후, 72시간에 걸쳐 총 14시점에서 채혈하고 LC-MS-MS를 이용하여 혈장 중 약물의 농도를 측정하여 얻은 결론은 다음과 같다.
- 투여량은 각 제제 모두 2정(리시노프릴로써 20 mg)으로 하였다. 또한, 리시노프릴을 경구투여 하였을 때 Tmax는 약 6.9 ±1.0시간이며, 반감기는 14.2±7.9시간으로 보고되어 있어4)생물학적 동등성 시험기준 제 18조 제 4항 휴약 기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약 기간을 두고자 7일로 하였다.
- 0(Varian, Palo Alto, CA, 미국)을 이용하였다. 또한, 원심분리기 (MF-300, 한일과학산업사, 인천, 한국), 탁상용 혼합기 (Maxi . Mix H, Thermolyne, Iowa, 미국)를 사용하였다.
- 4kg이었다. 모든 지원자들에게 시험에 대한 목적, 방법, 이상 약물 반응 발생 가능성 및 이에 대한 대책 등을 설명하고 참가동의서를 받은 후 생물학적동등성 시험을 실시하였다.
- 시험당일 피험자들의 상완 정맥부위에 heparin-locked( 150 unit/mL) angio catheter(보인메디카, 구미, 한국)를 설치하고 blank 혈액으로 각각 10mL씩을 채혈한 후, 대조약 또는 시험약 각각 2정 (리시노프릴로써 20 mg)을 물 240 mL 함께 투약하였다. 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2분 간격으로 하였다.
- 약물투약은 2시기 2제품의 라틴방격법에 따른 교차 시험법으로 투약계획을 세우고 28명의 피험자를 군당 14인씩 무작위로 A, B 2군으로 나누고 제 1기 때 A군에는 대조약인 “제스트릴®정”을 B군에는 시험약인 “리시헥살®정”을 투여하였고, 제 2기 때에는 그 반대로 투여하였다. 투여량은 각 제제 모두 2정(리시노프릴로써 20 mg)으로 하였다.
- 질소기류 하에 증발시킨 후 잔사에 70μLL의 1 mM ammonium fbrmate를 가하여 재용해한 후 IOrL를 취하여 HPLC에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 면적비에 대한 리시노프릴의 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였으며, 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 또한, 동일 농도 범위에서 리시노프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 표준편차를 리시 노프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 10으로 하여 검토한 결과 정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 2ng/mL로 정하였다.
- 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2분 간격으로 하였다. 채혈은 약물의 혈중소실반감기(14.2±7.9시간)을 토대로 반감기의 3배 이상인 72시간 동안 실시하였고, 채혈 횟수는 약물 투약 직전과 투약 후 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 24, 36, 48 및 72시간의 총 14 시점에서 실시하였다.
- 투약하였다. 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2분 간격으로 하였다. 채혈은 약물의 혈중소실반감기(14.
- 혈장 중 리시노프릴의 농도를 측정하기 위하여 이미 보고된1.4.11.12) 분석법을 참조하여 검량선 작성과 생체시료를 분석하였다.
- 혈중 약물 분석을 위해 펌프(Prostar 210/215, Varian, Palo Alto, CA, 미국), 자동주입기(Prostar 410, Varian, Palo Alto, CA, 미국)등으로 구성된 HPLC system(Varian, Palo Alto, CA, 미국)의 HPLC장치를 사용하였으며, 검출기로는 1200L MS/MS(Varian, Palo Alto, CA, 미국)를, 데이터 처리는 Star Chromatography Workstation 6.0(Varian, Palo Alto, CA, 미국)을 이용하였다. 또한, 원심분리기 (MF-300, 한일과학산업사, 인천, 한국), 탁상용 혼합기 (Maxi .
대상 데이터
-
재료 및 시약
시험에 사용된 약물은 리시노프릴을 10mg 함유한 정제로써, 시험약인 “리시헥살쩡(제조번호 32336, 유효기한: 2005. 3. 11)”은 헥살코리아로부터, 대조약인 “제스트릴®정(제조번호: 36004, 유효기간: 2006. 6. 10)"은 현대약품공업(주)으로부터 얻었다.
- 에날라프릴은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, 미국)의 것을 구입하였고, HPLC 장치에 사용한 아세토니트릴과 메탄올 및 정제수는 Fisher Scientific Co. (Springfeild, NJ, 미국)로부터 구입하여 사용하였으며, 기타 그 외의 시약들은 1등급 시약들을 사용하였다.
- 분석용 컬럼은 YMC Hydrosphere C*(입자경 3㎛,50 x2.1 mm, YMC, Kyoto, Japan)를 이용하였으며 이동상으로는 1 mM ammonium fbrmate와 메탄올의 혼합액(25:75, v/ V)을, 유속은 200jiL/min, 주입량은 10μL 로 LC-MS-MS에 주입하였다. 리시노프릴의 검출은 MS-MS MRM(multiple reaction monitoring)방법으로 검줄하고, electro-spray ionization (ESI)의 방법으로 이온화를 하였으며, nebulizing gas, turbo gas 및 curtain gas로는 질소를 이용하였고, collision gas로는 argon을 사용하였다.
- 피험자는 시험 당시 식품의약품안전청이 고시한 생물학적 동등성 시험 기준10)에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성으로서 병력이 없고 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원자를 모집 공고하고 지원신청서를 받아 지원자 43인을 모집하였고, 선정기준에 모두 합당하고 제외기준에 해당되지않는 자로서 생물학적동등성시험에 적합한 건강한 사람으로 판정된 28명을 피험자로 선정하였다. 피험자로 선정된 사람들의 평균 나이는 만 25.
데이터처리
- 두 리시노프릴 제제의 혈장 중 농도 곡선하 면적 (AUG), 최고혈장 증 농도(Cmax)와 최고 혈장 중 농도 도달시간(Tmax) 등을 분산분석 (ANOVA, analysis of variance)및 90% 신뢰구간을 이용한 통계 검정을 통해 생물학적 동등성 시험을 비교, 평가하고자 하였다.
- 제 1기 및 제 2기 시험을 통해 얻은 피험자들의 대조약과 시험약의 시간대별 혈장 중 농도 데이터를 국립독성연구원로부터 제공받은 K-BEtest 통계프로그램을 이용하여 72시간까지의 AUGt, 무한대까지의 혈장 중 농도 곡선하 면적 (AUCinf), Cmax 및 Tmax을 구한 후, 측정치와 계산치를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 생물학적동등성시험기준10)에 의하여 두 제제의 동등성을 평가하고 Tmax를 제외한 파라미터들에 대해 로그 변환한 후, Equiv TestTM를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하고 각 변동요인 간에 유의성 여부를 검토하였으며 90% 신뢰한계를 구함으로써 현대약품공업(주)의 "제스트릴®정”과 헥살코리아의 "리시헥살®정”의 생물학적 동등성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- 1 mm, YMC, Kyoto, Japan)를 이용하였으며 이동상으로는 1 mM ammonium fbrmate와 메탄올의 혼합액(25:75, v/ V)을, 유속은 200jiL/min, 주입량은 10μL 로 LC-MS-MS에 주입하였다. 리시노프릴의 검출은 MS-MS MRM(multiple reaction monitoring)방법으로 검줄하고, electro-spray ionization (ESI)의 방법으로 이온화를 하였으며, nebulizing gas, turbo gas 및 curtain gas로는 질소를 이용하였고, collision gas로는 argon을 사용하였다. Nebulizer의 온도는 350℃로 설정하고, 압력은 21.
성능/효과
- 1. LC-MS-MS를 이용하여 혈장 중 리시노프릴의 농도를 빠른 시간 내에 2ng/tnL(정량한계농도)까지 측정함으로써 생체 이용률의 시험에 이용할 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖는 분석조건을 확립할 수 있었다.
- 2. 두 약물의 분산분석 결과 로그변환한 AUC1, AUCinf, Cmax에 대한 결과를 보면 유의수준(α) = 0.05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으며, 90% 신뢰한계가 모두 log 0.8~log 1.25이어야 하는 생물학적동등성 시험기준을 만족하였다.
- AUC1, AUCinf, Cmax 에 대한 결과를 보면 유의수준 (a)=0.05 일때, 군간 순서 효과 검정에 대한 F 비(FG)가 F 분석표의 한계값인 F(l, 26)=4.225 보다 작아 교차 시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었으며, 개체내 변동에서 기간별(period effect) 변동 및 제제별(formulation effect) 변동 모두 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 공혈장, 2(정량한계 농도), 5, 20, 50, 100 및 200ng/mL 의 혈장표준액을 분석하였을 때, y=0.00675x-0.0000267 (r2=0.9994)로 2~200ng/mL의 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 얻을 수 있었다. 또한, 동일 농도 범위에서 리시노프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 표준편차를 리시 노프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다.
- 9994)로 2~200ng/mL의 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 얻을 수 있었다. 또한, 동일 농도 범위에서 리시노프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 표준편차를 리시 노프릴과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 10으로 하여 검토한 결과 정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 2ng/mL로 정하였다.
- 로그변환한 평균치 차의 AUG1, AUGinf 및 Cmax에 대한 90% 신뢰한계는 각각 log 0.9245~log 1.0603, log 0.9270- log 1.0601 및 log 0.9548~log 1.1009로 나타나 생물학적 동등성 시험 기준인 log0.8에서 log 1.25이내인 조건을 만족함으로써 리시노프릴의 두 제제가 생물학적으로 동등함을 알 수 있었다.
- 모든 피험자들에게 시험 전 10일간, 시험기간 중 및 휴약기간 중에는 음주나 항생제 및 진통제를 포함한 일체의 약물의 복용을 금지시켰다. 시험 전 저녁부터 모두 동일하게 12시간을 이상을 절식시키고, 물 이외의 음료수는 제한하였다.
- 이상의 결과를 종합해보면 시험약인 “리시헥살®정”은 대조약인 “제스트릴®정”에 대하여 생물학적동등성시험의 판단기준인 2항목(AUC1, Cmax)에서 모두 동등한 것으로 나타나이 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 사료되었다.
- 혈장 중 리시노프릴에 대한 본 LC-MS-MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다 (TableⅠ).
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