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문제 정의
- 산수유 (CF), 백복령(BBR) 및 목단피(MDB) 추출물은 α-glucosidase 활성 감소를 유도했다. 따라서 모든 추출물은 혈당 상승을 억제할 수 있는 항당뇨 기능성식품이나 약품 개발을 위한 기능성 천연 소재로 이용될 수 있을 가능성을 제시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 전통적으로 한방에서 당뇨 치료에 사용되어온 한약재 물 추출물의 항산화 활성과 세포내 당 이용을 증가시킬 수 있거나 당 흡수를 지연시키는 key enzyme들의 활성 능력을 검토하여, 이들 한약재 물 추출물을 이용하여 제2형 당뇨병을 가진 사람들에게 당뇨 증상을 개선해 줄 수 있는 천연 기능성 식․의약 소재를 탐색하는데 그 목적이 있다.
- 본 연구에서는 제2형 당뇨병를 가진 GK 흰쥐(GotoKakizaki) 간에서 추출한 cytosol과 심장에서 추출한 mitochondria를 이용한 모델계에서 당대사 관련 효소인 glucokinase(GCK), pyruvate dehydrogenase(PDH), acetylCoA carboxylase(ACC) 및 glucosidase 활성에 대한 한약재의 물 추출물의 항당뇨 효과를 연구하였다. 그리고 역시 그들의 물 추출물의 free radical 소거활성을 DPPH 방법으로 알아보았다.
제안 방법
- Pyruvate dehydrogenase의 활성 측정은 Furuta와 Hashimoto(12)의 방법에 따라 측정하였다. 50 mM KH2PO4 (pH 8.0), 1 mM MgCl2, 2.5 mM NAD+ , 0.13 mM CoA, 0.2 mM thiamin pyrophosphate, 0.32 mM dithiothreitol, 2 mM pyruvate를 첨가 후 30℃에서 3분간 incubation 시킨 후 한약재 물 추출물과 mitochondria를 넣고 340 nm에서 3분간 측정하여 NADH의 산화를 통해 pyruvate dehydrogenase의 활성을 측정하였다.
- 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM MgCl2, 3.75 mM glutathione, 0.75 mg bovine serum albumin, 0.125 mM pH 8.0, NADH, 0.125 mM acetyl-CoA, 0.5 mM potassium phosphoenolpyruvate, 6 μg lactate dehydrogenase, 15 μg pyruvate kinase, 3.75 mM ATP를 첨가하여 37℃에서 2분간 incubation 시킨 후 25 mM KHCO3을 넣고 다시 1분간 incubation 한 뒤 한약재 물 추출물과 cytosol을 넣은 후 340 nm에서 3분간 측정하여 NADH가 NAD+ 로 환원되는 것을 통해 acetyl CoA carboxylase의 활성을 측정하였다.
- DPPH 소거활성은 Singh와 Rajini(10)의 방법을 변형하여 DPPH의 환원성을 이용하여 측정하였다. 다양한 농도(1, 0.
- 본 연구에서는 제2형 당뇨병를 가진 GK 흰쥐(GotoKakizaki) 간에서 추출한 cytosol과 심장에서 추출한 mitochondria를 이용한 모델계에서 당대사 관련 효소인 glucokinase(GCK), pyruvate dehydrogenase(PDH), acetylCoA carboxylase(ACC) 및 glucosidase 활성에 대한 한약재의 물 추출물의 항당뇨 효과를 연구하였다. 그리고 역시 그들의 물 추출물의 free radical 소거활성을 DPPH 방법으로 알아보았다. Free radical 소거활성은 산수유(CF), 목단피 (MDB), 천화분(CHB) 그리고 산약(SY)의 물 추출물이 강했고 반면에 백목령(BBR), 숙지황(SGH)과 택사(TS)는 낮은 소거작용을 나타내었다.
- 다양한 농도(1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.025 g/mL) 한약재 물 추출물 900 μL에, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도가 517 nm에서 약 1.0이 되도록 농도를 조절한 DPPH용액 300 μL를 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응하였다.
- 숙지황(SGH) 물 추출물은 대조군과 비교하여 오히려 α-glucosidase 활성을 촉진시켰다 (Fig. 5).
- 이들 상징액을 여과한 후 회전 진공 증발기로 감압·농축하여 완전 건조시킨 다음 이들 고형분은 제 용해 후 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거활성을 위해 사용하였고, 농축하지 않은 시료를 각항당뇨 관련 효소 활성 실험을 위하여 사용할 때는 각 시료의 수율에 근거하여 최종 농도가 0.1 g/100 mL가 되도록 농도를 조정하여 사용하였다.
- 더하여 본 연구에서는 60℃에서 24시간 물로 추출하여 시료로 사용하였으나, Lee 등(28)은 온도단계별 물로 추출하여 시료로 사용하였다. 즉 차가버섯을 80℃에서 8시간 물로 추출한 추출물(1차 추출물), 그 잔사에 물을 첨가하여 100℃에서 8시간 추출한 추출물(2차 추출물) 그리고 2차 추출한 후 남은 잔사에 물을 첨가하여 120℃에서 8시간 추출한 3차 추출물을 각각 항산화 실험을 위한 시료로 사용하였다. 이들 추출물들의 항산화력을 비교한 결과 1차 추출물의 항산화력이 가장 낮았고, 3차 추출물의 항산화력, 페놀화합물 및 플라보노이드 함량이 가장 높았다고 보고하였다.
- Sharma 등(11)의 방법을 이용하여 glucokinase의 활성도를 측정하였다. 즉, 44 mM sodium glycylglycinate(pH 7.5), 0.75 mM NADP+ , 7.5 mM MgCl2, 3 mM ATP, 0.2 unit glucose-6-phosphate dehydrogenase(3.9 unit/mg, 0.0052 g/100 mL), 100 mM glucose를 첨가하여 28℃에서 incubation 한 뒤 한약재 물 추출물과 cytosol을 넣은 뒤 340 nm에서 3분간 측정하여 NADPH의 산화를 통해 glucokinase의 활성을 측정하였다.
- 즉, synthetic substrate인 2 mM p-nitrophenyl αD-glucopyranoside를 0.1 M PIPES buffer(pH 6.8)에 첨가한 후 α-glucosidase와 한약재 물 추출물을 넣고 그 혼합액에 enzyme solution을 첨가 후 37℃에서 30분간 반응시키고 0.64% N-(1-naphthyl) ethylenediamine solution(pH 10.7) 을 첨가하여 반응을 종결시켜 substrate인 p-nitrophenyl αD-glucopyranoside로부터 유리되어 나오는 반응생성물인 p-nitrophenol을 400 nm에서 측정하여 α-glucosidase 활성의 억제정도를 확인하였다.
- 항당뇨병 관련 효소 활성 측정을 위해서 GK 흰쥐 (Goto-Kakizaki)로부터 간과 심장을 적출한 후 생리식염수에 세척하였고, 완충액(20 mM HEPES, 140 mM KCl, pH 7.4)을 넣고 균질화한 후 4℃에서 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상징액을 얻었다. 그 상징액을 4℃에서 15분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하여 상징액과 침전물을 얻었으며, 그 중 상징액은 다시 4℃에서 38,000 rpm으로 1시간 동안 초원심분리(Beckman, USA)하여 상징액인 cytosol과 침전물인 microsome을 분리하였다.
대상 데이터
- 한약재[목단피(Paeonia suffruticosa ANDR), 백복령(Poria cocos Wolff), 산수유(Corni fructus), 산약(Discorea japonica Thunb), 천화분(Trichosanthes kirilowii Maxim), 택사 (Alisma canaliculatum) 및 숙지황(Rehmannia glutinosa Libo.)]은 춘천 소재 재료상으로부터 제공받아 건조하였다. 건조된 한약재를 분쇄한 후 10.
데이터처리
- Data values are expressed as mean±SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with control at * p＜0.05 and ***p＜0.001 by Student t-test. CF: Corni fructu, BBR: Backbocreng, MDB: Mokdan bark, CHB: Chenhwabon, SGH: Shuckgihwang, TS: Taecsa, SY: Sanyack.
- Data values are expressed as mean±SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with control at ***p＜0.001 by Student t-test. CF: Corni fructu, BBR: Backbocreng, MDB: Mokdan bark, CHB: Chenhwabon, SGH: Shuckgihwang, TS: Taecsa, SY: Sanyack.
- Data values are expressed as mean±SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with control at **p＜0.01 and ***p＜0.001 by Student t-test. CF: Corni fructu, BBR: Backbocreng, MDB: Mokdan bark, CHB: Chenhwabon, SGH: Shuckgihwang, TS: Taecsa, SY: Sanyack.
- 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 대조군과 각 처리군의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하였다.
이론/모형
- α-glucosidase 활성억제 측정은 in vitro에서 기질과의 반응역학분석(kinetic analysis) 방법으로 억제율을 측정하였다.
- Acetyl-CoA carboxylase는 Tanabe 등(13)의 spectrophotometric 방법을 이용하여 활성도를 측정하였다. 50 mM Tris-HCl(pH 7.
- Pyruvate dehydrogenase의 활성 측정은 Furuta와 Hashimoto(12)의 방법에 따라 측정하였다. 50 mM KH2PO4 (pH 8.
- Sharma 등(11)의 방법을 이용하여 glucokinase의 활성도를 측정하였다. 즉, 44 mM sodium glycylglycinate(pH 7.
성능/효과
- 백복령(BBR), 목단피 (MDB), 숙지황(SGH) 및 택사(TS) 물 추출물은 GCK를 유의적으로 변화시키지 못하였다. PDH 활성은 택사(TS)를 제외한 모든 처리군에서 현저하게 증가하였고, ACC 활성은 산수유(CF), 천화분(CHB), 숙지황(SGH), 택사(TS) 및 산약 (SY)에서 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며, 산수유와 산약의 증가율은 각각 258%와 359%였다(Fig. 3, 4). 7개 한약재의 물 추출물의 α-glucosidase 저해활성은 Fig.
- 4% DPPH radical 소거활성을 나타내었으므로 해송이 버섯 열수 추출물보다는 높은 항산화력을 나타내었고, 산수유물 추출물이 높은 항산화력을 가진 것은 Kim 등(15)의 보고와 일치하였다. 그러나 감초의 에탄올 추출물과 비교할 수 있는 농도로 실험을 하지는 않았지만 산수유와 목단피의 물 추출물을 제외하고 25 mg/100 mL에서 60%이하의 DPPH radical 소거활성을 나타내었고, 산수유 역시 57% 소거활성을 나타냈으므로 목단피를 제외한 모든 시료에서 감초보다 낮은 항산화력을 보였다.
- 그러나 본 연구결과 7개의 한약재 물 추출물 중 산수유, 백목령 그리고 목단피만 α-glucosidase 활성 저해효과를 나타내었다.
- 간에서 GCK가 활성화되면 혈당은 에너지 생산을 위해 사용되거나 간에 글리코겐으로 저장되기 때문에 혈당이 감소하게 된다(20). 본 실험에서 산수유와 천화분이 실험한 7종류 한약재 물 추출물 중 높은 GCK 활성을 보였다. 산수유와 천화분의 GCK 활성 증가는 이들 추출물이 당뇨증상을 개선해 줄 수 있는 천연 기능성 식·의약 소재일 가능성을 시사해 주고 있다.
- 1에 나타내었다. 본 연구 결과에 따르면 산수유(Corni fructu, CF), 백복령(Backbocreng, BBR), 목단피(Mokdan bark, MDB), 천화분(Chenhwabon, CHB), 숙지황(Shuckgihwang, SGH), 택사(Taecsa, TS) 및 산약(Sanyack, SY) 물 추출물 중 고농도인 1 g/100 mL과 0.5 g/100 mL에서는 산수유(CF), 목단피(MDB) 및 산약 (SY)은 90%이상의 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었고, 모든 농도군에서 소거활성을 비교해 본 결과 산수유 (CF)와 목단피(MDB)가 7개의 한약재 물 추출물 중 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었다. 산수유(CF) 물 추출물은 농도 의존적으로 DPPH radical 소거활성이 감소하였으나, 목단피(MDB) 물 추출물은 0.
- 5 g/100 mL에서는 산수유(CF), 목단피(MDB) 및 산약 (SY)은 90%이상의 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었고, 모든 농도군에서 소거활성을 비교해 본 결과 산수유 (CF)와 목단피(MDB)가 7개의 한약재 물 추출물 중 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었다. 산수유(CF) 물 추출물은 농도 의존적으로 DPPH radical 소거활성이 감소하였으나, 목단피(MDB) 물 추출물은 0.025 g/100 mL 농도에서도 여전히 90%이상의 높은 DPPH radical 소거활성을 가지고 있어, 활성비교를 위하여 사용한 L-ascorbic acid와 비슷한 수준의 항산화 활성을 보였다. 백복령(BBR)은 모든 농도에서 항산화력을 나타내지 않았고, 숙지황(SGH)과 택사 (TS) 역시 가장 고농도에서 각각 45.
- 간 cytosol의 GCK 활성은 산수유 (CF)와 천화분(CHB)에서 다른 추출물보다 더 강했다. 심장 미토콘드리아의 PDH 활성은 택사(TS)를 제외하고 모든 추출물에서 대조군과 비교하여 높았다. 간 cytosol의 ACC 활성은 대조군보다 산수유(CF), 천화분(CHB), 숙지황(SGH), 택사(TS) 그리고 산약(SY) 추출물에서 높았다.
- 74 mg/100 mL로 알려져 있다(16). 이들 결과와 비교하여볼 때 본 연구에서 사용한 산수유, 목단피, 천화분 및 산약물 추출물 0.5 g/100 mL에서 각각 100.6, 95.8, 87.5 그리고 92.4% DPPH radical 소거활성을 나타내었으므로 해송이 버섯 열수 추출물보다는 높은 항산화력을 나타내었고, 산수유물 추출물이 높은 항산화력을 가진 것은 Kim 등(15)의 보고와 일치하였다. 그러나 감초의 에탄올 추출물과 비교할 수 있는 농도로 실험을 하지는 않았지만 산수유와 목단피의 물 추출물을 제외하고 25 mg/100 mL에서 60%이하의 DPPH radical 소거활성을 나타내었고, 산수유 역시 57% 소거활성을 나타냈으므로 목단피를 제외한 모든 시료에서 감초보다 낮은 항산화력을 보였다.
후속연구
- 이들 추출물들의 항산화력을 비교한 결과 1차 추출물의 항산화력이 가장 낮았고, 3차 추출물의 항산화력, 페놀화합물 및 플라보노이드 함량이 가장 높았다고 보고하였다. 따라서 다음 진행되어질 연구에서는 본 연구에서 사용한 물 추출물을 온도단계별로 추출하여 항산화력 및 당뇨 관련 효소활성에 대한 농도별 영향을 알아보므로 최적화된 추출법과 적당한 투여 농도의 확립이 필요할 것으로 생각된다.
- 즉 1차적으로 glucokinase (GCK) 활성을 증가시켜 글루코오스(glucose)를 glucose6-phosphate로 전환하게 하여야 하고(3,4), 2차적으로 pyruvate dehydrogenase-a(PDHa) 또는 PDH phosphatase 등을 활성화시켜 흡수된 당의 이용을 비가역적으로 촉진시키는 기능을 가지고 있어야 하며 또한 식사 후 carnitine palmitoyl transferase를 저하시키거나 acetyl-CoA carboxylase(ACC)를 활성화시킬 수 있고 더하여 α-glucosidase를 저해하므로 이당류인 maltose 분해를 억제하여 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 혈당을 효율적으로 감소시킬 수 있다면 당뇨 개선을 위한 좋은 기능성 소재일 것이다(5,6).
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