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문제 정의
- 이들은 사람과 환경 내에 많이 분포하고 환경의 변화에 안정하여 지표 미생물로의 기본 조건을 충족시키며 오염원에 대한 특이성을 가지고 있어 수질을 평가하는데 널리 이용되고 있다.財본 연구를 통해 시화호로 유입하는 지표수에서 미생물학적인 수질오염의 평가와 비교를 실시해보고 환경적인 특성을 고찰해보자 한다.
- 본 연구는 시화호 수질오염의 원인인 지표수를 환경적 특성 별로 선정하여 각각의 유입수에서 미생물 지표를 이용하여 수질을 검사해보고 서로 간의 오염 정도를 비교 분석하는데 가장 큰 목적이 있다. 이런 미생물학적인 접근 및 평가는 인간의 삶과 밀접한 수질의 관리에 중요한 자료로 사용될 수 있기 때문에 의미 있는 연구이다.
- 본 연구는 시화호 주변의 5곳의 지표수를 채취 지점으로 선정하고, 이틀에 걸친 채수 과정을 통해 미생물학적인 측면에서 분석한 연구 결과이다. 각각의 지표수를 비교 및 평가하고 이를 통한 시화호 수질 관리를 위 한보다 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서는 충분한 표본을 통한 연구가 필수적이지만, 본 연구에서는 그렇지 못하여 제한점으로 남는다.
- 수질오염을 평가하는데 있어서 미생물지표를 이용하여 수질을 관리하고 평가하려는 노력이 오래 전부터 시도되어왔고, 이미 세계 각국은 오염 정도를 파악할 수 있는 기준을 마련하고 보다 정확하고 믿을 수 있는 수질관리를 위한 연구를 진행하고 있다. 현재 우리나라 먹는 물 수질 기준 목록에는 총대장균군(Total coliform), 분원성 대장균군(Fecal coliform), 분원성 연쇄상구균(Enterococcus), 대장균(E.
- 표본 수집은 직접 채수 방법과 필터를 이용한 흡착 방법으로 나눌 수 있다. 직접 채수는 Coliler普와 Enterolerts(IDEXX, USA)를 이용한 총대장균군, 분원성 대장균군, 대장균, 장내 연쇄상구균을 검사하기 위한 목적으로, 각각의 지점에서 채 수통에 1 留 담아서 바로 4℃ 아이스박스에 보관하여 채수 당일에 실험실로 이동하였다. 필터를 이용한 방법은 coliphageS- 검사하기 위하여 실시되었고 5" Virocap™ 카트리지 필터 (Scientific Methods Inc.
제안 방법
- 5 m幽 넣고 2XTSB와 혼합하여 18~24시간 동안 37。€에서 배양한 후 플라크 수를 세어 검사한다. 비교군으로서 MS2 coliphage를 51 증류수에 lOOflO" PFU/mZ)를 접종하고 숙주 대장균인 C3000을 이용하여 동일한 방법으로 진행하였다. 비교군의 결과를 통해 회수율을 계산하여 각각의 표본 수에서의 coliphage를 비교하였다.
- 16S rDNA 유전자의 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 유전자 증폭 : 분리한 16S rDNA를 ABI 2320의 중합효소연쇄반응기 (DNA thermal cycler, Applied Biosystems 2720)를 이용하여 유전자 증폭을 수행하였다. 중합효소연쇄반응을 위해서 Bioneer Taq DNA polymerase(Korea, cat.
- Colilert®와 Enterolert® kit를 이용하여 총대장균군, 분원성대장균군, 대장균, 장내 연쇄상구균의 정성 검사와 정량검사를 실사하였다. 이는 효소발색법(Defined Substrate Technology(DST))의 원리를 기본으로 하고 있고, 우리나라에서는 2002년 7월 1일 먹는 물 수질 공정 시험방법에 등재되었다.
- 이를 ampicillin이 포함된 LB broth 배지에 도말하여 10~12시간 정도 배양한다. PCR 산물과 TA 벡터가 cloning 된 재조합 벡터를 2X cracking(5 N NaOH 20 叫 10% SDS 50 uZ, sucrose 200 mg, 증류수 930 nZ) 방법으로 처리한 후 0.5 gg/m/ 의 ethidium bromide가 포함된 1% ethidium bromide stained agarose gel에서 100 V로 전기영동한 후 image analyzer로 확인하였다. 확인된 샘플은 plasmid miniprep kit(Labopass mini plasmid DNA purification kit, Korea, cat.
- 계통학적 분석 (phylogenetic analysis) : 16S rDNA의염 기서열을 Lasergene6 program(DNASTAR Inc., USA)을 이용하여 계통학적 분석을 실시하였다. 미국국가생물 공학센터 (NCBI) BLAST search를 통해 보고된 대장균 및 장내 연쇄상구균의 유전자 염기서열정보를 토대로, Megalign program에서 Crustal W 방법으로 정렬된 결과를 얻었고, 같은 program에서 neighborjoining analysis를 이용하여 계통수(phylogenetic tree) 를 구성하였다屮
- 계통학적 분석을 통한 대장균과 장내연쇄상구균의 군집을 확인하였다. 정왕천과 반월천에서 얻은 대장균은 서로 유사성이 높지 않은데 반해, 정왕천, 반월천, 안산천의 장내연쇄상구균의 유사성은 매우 높은 것으로 확인되 었다.
- 5로 맞춰준다. 농축된 용액에 다른 미생물을 제거하기 위해 0.22 μm 주사기 필터를 이용해 정제한 후 최종 용량을 확인한다. 농축된 표본을 1(尸~1(广까지 희석하여 각각 3mf씩 튜브에 담는다.
- 대장균과 장내 연쇄상구균의 16s rDNA를 이용한 계통학적 분석을 하기 위해 계통수(phylogenetic tree)를제작하였다. 대장균의 경우, 반월천과 정왕천에서의 분리한 대장균의 염기서열을 확인하여 이미 알려진 다른 염 기서열정보와 분석을 실시하였고, 장내 연쇄상구균의 경우는 정왕천, 안산천, 반월천에서 각각 분리한 균을 통해 대장균과 같은 방법으로 계통연구를 실시하였다.
- 대장균의 경우, 반월천과 정왕천에서의 분리한 대장균의 염기서열을 확인하여 이미 알려진 다른 염 기서열정보와 분석을 실시하였고, 장내 연쇄상구균의 경우는 정왕천, 안산천, 반월천에서 각각 분리한 균을 통해 대장균과 같은 방법으로 계통연구를 실시하였다. 반월천과 정왕천의 대장균은 비교 대장균과의 차이를 보이고 있는데, 정왕천의 대장균이 반월천보다 다수의 대장균들과 높은 유사성을 보이고 있다.
- , USA)을 이용하여 계통학적 분석을 실시하였다. 미국국가생물 공학센터 (NCBI) BLAST search를 통해 보고된 대장균 및 장내 연쇄상구균의 유전자 염기서열정보를 토대로, Megalign program에서 Crustal W 방법으로 정렬된 결과를 얻었고, 같은 program에서 neighborjoining analysis를 이용하여 계통수(phylogenetic tree) 를 구성하였다屮
- 방법은 정성검사와 동일하게 진행되나 검사용 플라스틱 용기 대신에 Quanti-Tray®/2000i- 사용하는데 기포가 생기지 않도록 용액을 넣고 sealer로 봉합한 후위와 동일한 배양조건에서 배양한다. 배양 후 Quanti-Tray®/2000 색의 수를 통해 제공된 최적확수시험법 (Most Probable Number, MPN) 표를 참조하여 결과를 판독한다.
- 비교군으로서 MS2 coliphage를 51 증류수에 lOOflO" PFU/mZ)를 접종하고 숙주 대장균인 C3000을 이용하여 동일한 방법으로 진행하였다. 비교군의 결과를 통해 회수율을 계산하여 각각의 표본 수에서의 coliphage를 비교하였다.”
- 5℃, 24시간 배양조건으로 진행되며 양성은 UV 상에서 파란색 형광을 나타낸다. 정량검사는 우선 표본수를 10배, 100배, 1000배 희석한 후 각각 100血씩 사용하였다. 방법은 정성검사와 동일하게 진행되나 검사용 플라스틱 용기 대신에 Quanti-Tray®/2000i- 사용하는데 기포가 생기지 않도록 용액을 넣고 sealer로 봉합한 후위와 동일한 배양조건에서 배양한다.
- 정성검사에서는 모두 대부분 양성으로 나와 예상했던 바와 같이 오염이심화된 상태를 보여주고 있다. 정량검사의 경우 표본 100mZ 과 10배 (10mZ), 100배 (Im/), 1000배(0.1 mZ) 로희석하여 표본마다 총 4개씩 검사를 실시하였다. 표본 수마다 희석된 4개의 결과의 평균값으로 각각의 지표수의 오염 정도를 비교 분석하였다.
- 증폭을 수행하였다. 중합효소연쇄반응을 위해서 Bioneer Taq DNA polymerase(Korea, cat. E-2011-2) 를 사용하였고, PCR reaction n血x에 표본을 첨가하는 방법으로 시행하였는데, mix는 총 20 叫로 구성되어 있으며, 여기에 5昭 표본이 첨가된다. PCR에 사용된 프라이머(lOpmol)는 forward가 63f(5, -CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3'), reverse가 1387r(5'- GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3) 이며 COSMO Co.
- 3 kb의 단편을 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 정제를 위해서 QIAquick Gel Extraction Kit(USA, cat no. 28706)을 사용하였으며, 실험방법은 제조자의 지시를 따라 진행되었다. 정제된 DNA는 -20°。에서 보관하였다.
- 1 mZ) 로희석하여 표본마다 총 4개씩 검사를 실시하였다. 표본 수마다 희석된 4개의 결과의 평균값으로 각각의 지표수의 오염 정도를 비교 분석하였다. 정왕천이 총대장균군(1986300 CFU/100m/), 분원성 대장균군(202 CFU/ 100 nV), 대장균(179645 CFU/lOOmT), 장내연쇄상구균 (3408 CFU/lOOmT) 모두에서 가장 높은 값을 보이고있어 시화호로 유입하는 지표수 중에 오염도가 가장 높았다.
- 4), 장내 연쇄상구균은 동화천을 제외한 4곳에서 확인하였다. 하지만 BLAST search 결과에서 대장균의 경우 정왕천과 반월천의 16S rDNA만 대장균과 유사한 strain으로 확인되었고, 장내연쇄상구균의 경우 배수갑문을 제외한 정왕천, 안산천, 반월천의 16S rDNA만 장내 연쇄상구균과 유사한 strain也로 확인되어 이 16S rDNA들로만계통분석을 실시하였다.
- 5 gg/m/ 의 ethidium bromide가 포함된 1% ethidium bromide stained agarose gel에서 100 V로 전기영동한 후 image analyzer로 확인하였다. 확인된 샘플은 plasmid miniprep kit(Labopass mini plasmid DNA purification kit, Korea, cat. CMP 0112)로 제조자의 지시에 따라 플라스미드를 추출하여 DNA 염기서열을 분리하였다.
대상 데이터
- 크게 4곳으로 나눌 수 있다. 각각의 유입수를 대표하여 표본수를 선정하였는데, 배수갑문을 통과하여 시화호로 유입이 시작되는 부분, 공단을 통과하여 흐르는 토구 중 시화공단과 반월공단 중간에 위치한 정왕천 하류 그리고 안산시에서 흘러 들어오는 안 산천 하류에서 채수하였다. 또한 동화천, 삼 화천, 반월천은 갈대 습지를 통과하여 시화호로 유입하는 지천으로, 동화천에서는 습지를 통과하기 전 지점과 반월천에서는 습지를 통과한 후 지점을 선정하여 총 5곳에서 채수하였다 (Fig.
- 각각의 유입수를 대표하여 표본수를 선정하였는데, 배수갑문을 통과하여 시화호로 유입이 시작되는 부분, 공단을 통과하여 흐르는 토구 중 시화공단과 반월공단 중간에 위치한 정왕천 하류 그리고 안산시에서 흘러 들어오는 안 산천 하류에서 채수하였다. 또한 동화천, 삼 화천, 반월천은 갈대 습지를 통과하여 시화호로 유입하는 지천으로, 동화천에서는 습지를 통과하기 전 지점과 반월천에서는 습지를 통과한 후 지점을 선정하여 총 5곳에서 채수하였다 (Fig. 1).
- 시료 수집은 2007년 6월 19일과 20일 동안 실시하였고, 기온이 높지 않은 오전 시간에 주로 채수하였다. 표본 수집은 직접 채수 방법과 필터를 이용한 흡착 방법으로 나눌 수 있다.
이론/모형
- 직접 채수는 Coliler普와 Enterolerts(IDEXX, USA)를 이용한 총대장균군, 분원성 대장균군, 대장균, 장내 연쇄상구균을 검사하기 위한 목적으로, 각각의 지점에서 채 수통에 1 留 담아서 바로 4℃ 아이스박스에 보관하여 채수 당일에 실험실로 이동하였다. 필터를 이용한 방법은 coliphageS- 검사하기 위하여 실시되었고 5" Virocap™ 카트리지 필터 (Scientific Methods Inc., USA)를 이용하였다. 필터가 들어있는 필터 용기에 호스와 peristaltic pump (Masterflex®L/S, Cole-Parmer Inc.
- TA Vector cloning 및 DNA sequencing : DNA 염기서열 분석을 위한 Hgation 과정은 pGEM-T Easy Vector system(Promega, USA, cat. A1360)을 이용하였다. Ligation mix는 다음과 같이 이루어진다.
- 콜리 파지는 Single Agar Layer(SAL) 방법으로 검사하였다 W SAL 방법에 앞서 탈리, 침전, 농축 3가지 단계를 거치게 되는데, 우선 4。(2로 보관하여 가져온 필터를 필터용기에 넣고 호스를 양쪽으로 연결하여 호스의 두 입구를 1.5% beef extract buffer 1 /가 담긴 비커에 담근다.
성능/효과
- 최종 농축 양은 3mZ이고 10에서 10000배 희석하여 배양하였다. 플라크 결과로 평균값을 구하여 "에 들어 있는 콜리 파지의 양을 추적하였는데, 비교군을 통해 얻은 검출의 회수율은 1.9%이었다. 검출 결과 정왕천에서 male-specific coiphage는 5X Itf-lX 10* PFU/L, somatic coliphage는 IX 105 PFU/ L 이상을 나타내어 가장 높은 농도를 보이고 있으며 이는 박테리아 지표 미생물의 결과와 일치한다.
- 16S rDNA의 중합 효소 연쇄반응의 결과 대장균은 5 곳 모두에서 DNA 단편을 확인하였고(Fig. 4), 장내 연쇄상구균은 동화천을 제외한 4곳에서 확인하였다. 하지만 BLAST search 결과에서 대장균의 경우 정왕천과 반월천의 16S rDNA만 대장균과 유사한 strain으로 확인되었고, 장내연쇄상구균의 경우 배수갑문을 제외한 정왕천, 안산천, 반월천의 16S rDNA만 장내 연쇄상구균과 유사한 strain也로 확인되어 이 16S rDNA들로만계통분석을 실시하였다.
- Colilert®와 Enterolert® kit는 세계 여러 나라에서 미생물학적 수질을 평가하는데 기준으로 사용되고 있으며, 이번 실험의 결과 또한 신뢰할 수 있는 미생물학적 수질평가 검사라 할 수 있다. 정왕천는 모든 지표 미생물의 측정값에 있어서 다른 유입수보다 높게 나타났다.
- Male-specific coliphage가 IX 103 PFU/L 이하로 검출 되었던 곳과 SXIOeIXIO4 PFU/L에서 검출되었던 곳으로 나누어 살펴볼 때, 총대장균군과 분원성 대장균군의 경우, 검출 농도가 높게 나오는 곳에서 콜리 파지의 농도도 더 높았다. 하지만 대장균과 장내 연쇄상구균의 검출 농도와 콜리 파지의 농도와는 연관성이 없었다.
- 본 연구에서 콜리 파지 검사에서는 회수율이 1.9%로 낮아 정왕천과 동화천에서만 검출이 가능하여서 전반적인 비교가 힘들지만, 정왕천에서의 높은 검출농도는 박테리아에서의 결과와 같이 가장 높게 나타났고, 이 역시 공단지역의 오염이 심각함을 지적해준다. 일반적으로 somatic coliphage는 사람과 가축에서 모두 나타나고 있으며, male-specific coliphage는 사람보다 가축에서 더 높은 농도를 보이고 있는데, 정왕천과 동화천을 비교한 결과 서로 다른 양상을 보이고 있어 동화천이 가축농가가 밀집한 지대에서 유입하는 하천임을 예측할 수 있다.
- 9%이었다. 검출 결과 정왕천에서 male-specific coiphage는 5X Itf-lX 10* PFU/L, somatic coliphage는 IX 105 PFU/ L 이상을 나타내어 가장 높은 농도를 보이고 있으며 이는 박테리아 지표 미생물의 결과와 일치한다. 배수갑문, 안산천과 반월천에서는 콜리 파지 검출에 실패했고, 정왕천과 동화천에서만 coliphage의 양을 확인할 수 있었다.
- 동화천과 반월천을 통해 갈대 습지 통과 전후를 때비교했을 때, 총대장균군과 분원성 대장균군은 통과 전인 동화천(187680 CFU/100mZ, 50 CFU/100mZ)에서 높게 나타났으나, 대장균과 장내 연쇄상구균은 통과 후인 반월천(106 CFU/100m/, 83 CFU/100mZ)에서 더 높게 나타났다(Fig. 2). 갈대 습지는 시화호로 유입되는 오염원을 제거하기 위해 조성되었다.
- 이로써 상류지대에 농업지대와 가축 농가가 많다는 것과, 시화호에 분변에 의한 오염이 있음을 예측할 수 있다. 또한 갈대습지를 통과하기 전인 동화천과 후인 반월천을 비교했을 때 갈대 습지의 분원성미생물 정화능력을 확인할 수 있다.
- 하지만 동화천에서는 malespecific coliphage가 somatic coliphage보다 높게 나타나 분변 오염의 근원이 가축 농가에 있음을 예상할 수 있다. 또한 콜리 파지의 농도는 총대장균군과 분원성 대장균군의 검출 농도가 높을수록 높은 것으로 나타났다.
- 확인하였다. 정왕천과 반월천에서 얻은 대장균은 서로 유사성이 높지 않은데 반해, 정왕천, 반월천, 안산천의 장내연쇄상구균의 유사성은 매우 높은 것으로 확인되 었다.
- 정왕천을 제외하고, 분원성 대장균군은 안산천과 배수갑문보다 동화천과 반월천에서 검출 농도가 높았다. 이로써 상류지대에 농업지대와 가축 농가가 많다는 것과, 시화호에 분변에 의한 오염이 있음을 예측할 수 있다.
- 표본 수마다 희석된 4개의 결과의 평균값으로 각각의 지표수의 오염 정도를 비교 분석하였다. 정왕천이 총대장균군(1986300 CFU/100m/), 분원성 대장균군(202 CFU/ 100 nV), 대장균(179645 CFU/lOOmT), 장내연쇄상구균 (3408 CFU/lOOmT) 모두에서 가장 높은 값을 보이고있어 시화호로 유입하는 지표수 중에 오염도가 가장 높았다. 정왕천은 반월공단과 시화공단의 중간에 위치하고 있는 토구로 공단을 대표하는 채 수지점이다.
- 부가적인 신장반응단계 (additional extension stiep)를 72<>C에서 10분간 수행한 후, 중합 효소 연쇄반응 산물을 얻을 수 있다. 증폭된 산물은 0.5 jig/mZ의 ethidium bromide가 포함된 1% ethidium bromide stained agarose gel에서 50 V 로 전기영동하여 DNA image analyzer로 확인하였고 1.3 kb의 단편을 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 정제를 위해서 QIAquick Gel Extraction Kit(USA, cat no.
후속연구
- 측면에서 분석한 연구 결과이다. 각각의 지표수를 비교 및 평가하고 이를 통한 시화호 수질 관리를 위 한보다 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서는 충분한 표본을 통한 연구가 필수적이지만, 본 연구에서는 그렇지 못하여 제한점으로 남는다. 그러므로 향후 충분한 표본의 수를 통한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 각각의 지표수를 비교 및 평가하고 이를 통한 시화호 수질 관리를 위 한보다 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서는 충분한 표본을 통한 연구가 필수적이지만, 본 연구에서는 그렇지 못하여 제한점으로 남는다. 그러므로 향후 충분한 표본의 수를 통한 연구가 이루어져야 할 것이다. 더 나아가 microbial source tracking 연구 목적을 위해서 시화호 주변 지역의 오염원과 시화호 수질의 평가 및 관계에 대한 포괄적인 연구가 필요하다.
- 그러므로 향후 충분한 표본의 수를 통한 연구가 이루어져야 할 것이다. 더 나아가 microbial source tracking 연구 목적을 위해서 시화호 주변 지역의 오염원과 시화호 수질의 평가 및 관계에 대한 포괄적인 연구가 필요하다.
- '》방조제 건설 후(1995년)부터 시화호 종합관리계획 실시 이후 (2002년)까지의 물환경정보시스템 자료에 의하면 COD, BOD 값이 감소함에 따라 총대장균군도 같이 감소함을 보이고 있다. 이는 수질 오염을 측정하는 지표 물질 간에 연관성을 의미하며, 이번 연구의 지표 미생물 자료는 기존의 다른 방법과 더불어 시화호 수질 관리에 있어서 의미 있는 자료를 제공할 수 있다고 판단된다.
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