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문제 정의
- 이 균주는 점질 다당으로 glucose 2분자와 galactose 3분자가 반복되어 구성된 kefiran을 생 산한다(Jeong, 2004). 본 연구는 산양유를 이용한 고점성 발효유 제조에 적용시킬 수 있는 산 생성과 EPS 생성력 이 높은 유산균을 선발할 목적으로 산양유 kefir 제품으로 부터 산 생성과 slime생성력이 우수한 균주를 분리 동정 하였으며, 이들의 생육 특성과 산 및 담즙산 내성을 조사 하여 고점성 산양유 요구르트 생산을 위한 기초 자료로 삼고자 하였다.
제안 방법
- 유단백질의 응고성은 분리된 특정균주를 MRS broth에서 37。(2로 24시간 동안 배양한 다음 10% 환원 탈지유에 2%씩 접종하였다. 이것을 4VC에서 12시간 동안 배양하여 커드의 형성정도를 관찰하고 발효유 제조용 starter로서 의 사용 가능성을 판단하였다.
- Clark 등(1996)의 방법을 응용하여 1 N HC1 을 증류수에 희석하여 MRS 중성 broth(pH 6.4)와 MRS 산성 broth(pH 1, 3, 4.5)를 준비하고, 37℃ MRS broth에서 24시간 동안 배양된 균주를 각각 IO’ cfu/mL 수준으로 접종하여 37℃ 에서 3시간 동안 배양하고, BCP한천배지로 생균수를 측정하였다.
- Kefir 분말제품으로부터 점질물 생성에 관여하는 유산균 을 분리 동정하였으며, 분리균의 배양 특성을 조사하였다. 국산 산양유 kefir제품으로부터 순수 분리된 우수한 점질 생성특성을 갖는 2개 균주를 형태 및 생리학적 특성과 16S rDNA염기서열을 기초로 분석한 결과, 각 균주는 99% 이상의 상동성으로 Str.
- 내담즙성은 Park 등(1996)의 방법에 준하여 시험하였다. MRS액체배지에 0.3% bile extract을 첨가하고, 각각 분리 된 균주들을 2%씩 접종하여 37P에서 24시간 동안 배양 하였으며, 배양종료 후 BCP한천배지에서 생균수를 측정하였다.
- 5 μM primers, 200 |1M deoxynucleoside triphosphate, 10 x PCR buffer 10㎕ 와 2 unit Taq DNA 중합효소 (Promega, US A)를 첨가하여 최종 부피를 100)1L로 하여 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초로 30 cycle 을 반복하였으며, 72。(2에서 5분간 반응 후 종료하였다. PCR 반응산물을 2% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였으며, 유전자 배열결정 quality를 좋게 하기 위하여 GeneAllR Gel SV kit(GeneAll Biotechnology, Korea)를사용하여 정제한 후 sequencing에 사용하였다. DNA의 sequencinge ABI 3730 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, Lane 등(1985)과 Hutter 등(2003)의 방법에 따라 수행하였다.
- DNA분리는 배양된 균체에서 Wizard Genomic DNA Prep. kit(Promega, USA)를 사용하여 chromosomal DNA 를 분리하였으며, 16S rDNA를 증폭시키기 위하여 forwardprimer(27 mf) : (5'-AGA GIT TGA TCC TGG CTC AG- 3')와 reverse primer(1492r) : (5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 조건은 0.
- 분리균의 유단백질 응고성을 확인하기 위하여 환원탈지 유에서의 커드형성 특성을 상업균주인 Str. thermophilus Body-1과 비교 조사하였다. Table 2에서와 같이 LFG-1 균 주는 상업균주와 유사한 수준으로 단백질 응고력이 우수하여 배양 12시간에 유단백질이 응고되었으나, LFG-2 균 주는 같은 배양시간 동안 비교적 낮은 수준의 유단백질 응고력을 보였다.
- 2)로 2분씩 3회 세척하여 1% osmium tetroxide용액으로 4℃에서 2시간 동안 처리하여 고정한 후 다시 3차 증류수로 실온에서 2회 세척하였다. 고정된 시료는 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 에탄올에 각 10분씩 그리고 100% 에탄올에서는 3회 각 10분씩 탈수하였다. 탈수 후 실온에서 100% propylene oxide로 15분간 2회 transition하여 metal stubs에 mounting하고, sputter coater(Agar Scientific Ltd.
- 국산 산양유 kefir 분말제품(DMJ Biotech. Co., Korea)으로부터 유산균을 분리하였으며, 멸균수에 용해시킨 뒤 MRS broth에서 30<>C로 48시간 배양하고, 배양액을 10배 희석법으로 희석한 후 CaCQ을 첨가한 MRS agai에 0.1 mL씩 평판도말하여 37℃에서 48시간 배양하고 투명환이 생성된 집락을 잠정적 젖산균으로 분리하였다. 분리된 균 주는 동일조건의 MRS agar에 백금이로 획선 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 호기 배양하여 투명환 생성이 우수한 균락을 임의 선택하고, 생리적, 생화학적 실험 및 현미경 관찰을 통하여 특징적인 균주를 최종 선발하여 사용하였다.
- MRS broth에 유산균을 접종한 후 30, 35, 37, 40, 45。(2에서 24시간 동안 각각 배양하면서 3시간 간격으로 시료를 취하고, Spectrophotometer(Shimadzu UV-1601, Japan)로 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한 시료를 십진 희석법으로 희석하여 평판배양법으로 BCP한천배 지에 0.1 mL씩 분주하고 3TC에서 72시간 동안 배양하여 생균수를 계수한 후 흡광도와 비교하여 증식정도를 측정하였다. pH의 변화는 10% 환원탈지유에 유산균을 접종한 후 37℃에서 3시간 간격으로 24시간 동안의 변화를 pH meter(Mettler model 345, England)를 이용하여 즉정하였다.
- 5 mL를 혼합 한 후 1 N folin시약 200 gL를 가하여 5분 동안 잘 흔들 어 청색 발색시켰다. 발색시킨 시료를 Spectrophotometer (Shimadzu UV-1601, Japan)로 540 nm에서의 흡광도를 측 정하였으며, 측정값을 준비해 둔 tyrosine standard의 값으 로 환산하여 유리된 tyrosine양을 계산하였다.
- 분리균을 동정하기 위하여 GenBank에 등록된 data와 비교하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 분리균의 16S rDNA 1.
- 분리균을 동정하기 위하여 GenBank에 등록된 data와 비교하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 분리균의 16S rDNA 1.5 Kb 단편의 염기서열은 forward와 reverse primer 를 이용하여 증폭하였으며, GenBank의 blast search의 database를 이용하여 염기서열을 비교 결정하였다. LFG-1과 LFG-2 균주의 16S rDNA의 부분적 염기서열을 Str.
- 분리균의 내산성은 위산과 유사한 pH 1, 3, 4.5의 조건 으로 37℃에서 3시간동안 유산균주의 생존여부를 관찰하였다. Fig.
- 분리균의 단백분해력 측정은 10% 환원탈지유를 단백분 해용 배지로 사용하였으며, 유리되는 tyrosine함량으로 나타내었다. 살균된 배지에 계대배양된 균주 1%를 접종한 후 4(TC에서 24시간 동안 배양하면서 일정시간별로 시료를 취하였으며, Hull(1947)의 방법을 다음과 같이 수정하여 실험하였다.
- 1 mL씩 평판도말하여 37℃에서 48시간 배양하고 투명환이 생성된 집락을 잠정적 젖산균으로 분리하였다. 분리된 균 주는 동일조건의 MRS agar에 백금이로 획선 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 호기 배양하여 투명환 생성이 우수한 균락을 임의 선택하고, 생리적, 생화학적 실험 및 현미경 관찰을 통하여 특징적인 균주를 최종 선발하여 사용하였다. 또한 비교를 위하여 상업용 균주로는 Str.
- 분리된 유산균의 최적 생장온도를 조사하기 위하여 MRS broth를 이용하여 각각 다른 온도에서 24시간 동안 배양 하면서 흡광도를 측정하여 균의 생장을 조사한 결과는 Fig. 5 및 6과 같다
- 분리한 유산균의 증식은 생균수와 pH의 변화로 측정하였다. MRS broth에 유산균을 접종한 후 30, 35, 37, 40, 45。(2에서 24시간 동안 각각 배양하면서 3시간 간격으로 시료를 취하고, Spectrophotometer(Shimadzu UV-1601, Japan)로 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 산양유 kefir 분말제품을 MRS broth를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하고, CaCQ가 첨가된 MRS Agar배지에서 투명환을 형성하는 집락을 산생성력을 가진 유산균으 로 판단하여 1차로 50 집락을 임의 선발하였다. 선발한 colony들을 다시 동일배지를 이용하여 3*>7C 에서 48시간 동안 배양하면서 투명환의 크기와 성장을 관찰하여 2차로 5 균주를 선발하였다.
- 산양유 kefir로부터 분리한 LFG-1과 LFG-2 균주의 내 담즙성과 내산성 측정은 bile extract 0.3%와 pH 1, 3, 4.5 의 조건에서 성장상태를 pH 6.4에서의 성장과 비교하였으며, 37℃에서 24시간 동안 실험한 결과는 Fig. 12와 같다.
- 분리균의 단백분해력 측정은 10% 환원탈지유를 단백분 해용 배지로 사용하였으며, 유리되는 tyrosine함량으로 나타내었다. 살균된 배지에 계대배양된 균주 1%를 접종한 후 4(TC에서 24시간 동안 배양하면서 일정시간별로 시료를 취하였으며, Hull(1947)의 방법을 다음과 같이 수정하여 실험하였다. 시료를 whatman(No.
- 산양유 kefir 분말제품을 MRS broth를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하고, CaCQ가 첨가된 MRS Agar배지에서 투명환을 형성하는 집락을 산생성력을 가진 유산균으 로 판단하여 1차로 50 집락을 임의 선발하였다. 선발한 colony들을 다시 동일배지를 이용하여 3*>7C 에서 48시간 동안 배양하면서 투명환의 크기와 성장을 관찰하여 2차로 5 균주를 선발하였다. 선발균을 10% 환원 탈지유에 배양 시킨 결과 대부분 37℃에서 10-22시간 동안에 단백질을 응고시켰으며, 그 중 1개 균주가 높은 점성을 가진 발효 물을 생산하는 특징을 보여 최종 선발하였다(LFG-1).
- 유단백질의 응고성은 분리된 특정균주를 MRS broth에서 37。(2로 24시간 동안 배양한 다음 10% 환원 탈지유에 2%씩 접종하였다. 이것을 4VC에서 12시간 동안 배양하여 커드의 형성정도를 관찰하고 발효유 제조용 starter로서 의 사용 가능성을 판단하였다.
- 고정된 시료는 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 에탄올에 각 10분씩 그리고 100% 에탄올에서는 3회 각 10분씩 탈수하였다. 탈수 후 실온에서 100% propylene oxide로 15분간 2회 transition하여 metal stubs에 mounting하고, sputter coater(Agar Scientific Ltd. SC502, USA)를 이용하여 금으로 도포한 다음 Scanning Electron Microscope(Philips XL30E, US A)로 관찰하였다.
대상 데이터
- thermophilusBody-1 및 Str. thermophilus TH3(Chr. Hansen, Denmark)를 사용하였다.
- DNA의 sequencinge ABI 3730 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, Lane 등(1985)과 Hutter 등(2003)의 방법에 따라 수행하였다. 분석결과는 NCBI blast(www.ncbi.nih.gov/blast/) 의 database를 이용하여 조사하였다.
- 선발균을 10% 환원 탈지유에 배양 시킨 결과 대부분 37℃에서 10-22시간 동안에 단백질을 응고시켰으며, 그 중 1개 균주가 높은 점성을 가진 발효 물을 생산하는 특징을 보여 최종 선발하였다(LFG-1). 이 선발균은 현미경 관찰을 통하여 구균으로 확인되었으며, 젖산과 점질생성력에서 유사한 경향을 보이며 형태가 다른 1개의 구균 균주(LFG-2)를 같이 선발하여 비교실험에 사용하였다. 선발한 분리균을 동정하기 위하여 생리적, 생 화학적 실험을 하였으며 결과는 Table 1과 같다.
이론/모형
- PCR 반응산물을 2% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였으며, 유전자 배열결정 quality를 좋게 하기 위하여 GeneAllR Gel SV kit(GeneAll Biotechnology, Korea)를사용하여 정제한 후 sequencing에 사용하였다. DNA의 sequencinge ABI 3730 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, Lane 등(1985)과 Hutter 등(2003)의 방법에 따라 수행하였다. 분석결과는 NCBI blast(www.
- 내담즙성은 Park 등(1996)의 방법에 준하여 시험하였다. MRS액체배지에 0.
- 유산균의 형태는 Williams와 Davies(1967)의 방법에 의하여 관찰하였으며, 순수 분리균을 MRS agar배지에서 37℃ 로 72시간 동안 배양하여 집락이 형성된 부분을 5x5 mm 크기로 절단하여 시료로 사용하였다. 시료 절편을 0.
성능/효과
- Bile extract 0.3% 첨가구에서 LFG-1 균주는 2.8xl08 cfu/ mL, LFG-2 균주는 LZxlO® cfu/mL로 무첨가구의 9.7xl08 cfu/mL, 5.5xl08 cfu/mL와 비교할 때 29-22%의 생장율을 보여 다소 억제되기는 하였으나, 모두 1俨 cfu/mL이상으로 내성이 강한 성장상태를 보였다. 이는 Joo(2003)의 bile extract 0.
- 2의 결과를 보였다. LFG-2 균주는 Fig. 8과 같이 37-40℃ 온도 범위에서 배양 9시간에 pH 4.85로 가장 빠른 저하를 보였으나 배양 24시간 후에도 최종 pH가 4.75로 다소 높은 값을 보였다.
- 55, Str. thermophilus T*] H 4.10, 그리고 LFG-1 균주는 4.30으로 나타나 다소 차이를 나타내었으며, LFG-2 균주는 pH4.84로 가장 높았다. 이는 최적 배양온도와 균주에 따른 산생성능력의 차이에 기인하는 것으로 생각된다.
- thermophilus Body-1 및 Str. thermophilus TH3과 거의 유사한 형태로 9시간까지 대수기를 보이며 1.6x109 cfu/mL수준까지 잘 증식하였으며, LFG-2 균주의 성장은 대수기 이후 정상기의 생균수가 2.5x108 cfWm止으로 다소 낮았다. 이러한 결과들은 kefir grains에서 분리한 Lc.
- Zac"s(LFG-2)는 낮은 응고력을 보였다. 모든 균주들은 0.3% bile extract 첨가조건에서 22- 29%의 내담즙성을 나타내었고, pH 3.0 이하에서는 대부분 사멸하는 약한 내산성을 보였으나 pH 4.5에서는 생장이 양호하여 요구르트와 같은 발효유 제품용 스타터로서 사용 가능성을 보였다.
- 선발 분리된 유산균을 전자현미경으로 관찰한 결과 2균주 모두 구균으로서 세포의 표면상태는 점질물이 없이 매끄러운 형태를 보였으나, 주변으로 다량의 점질물질이 생성되어 있음을 확인할 수 있었으며, Str. salivarius subsp.
- 선발한 colony들을 다시 동일배지를 이용하여 3*>7C 에서 48시간 동안 배양하면서 투명환의 크기와 성장을 관찰하여 2차로 5 균주를 선발하였다. 선발균을 10% 환원 탈지유에 배양 시킨 결과 대부분 37℃에서 10-22시간 동안에 단백질을 응고시켰으며, 그 중 1개 균주가 높은 점성을 가진 발효 물을 생산하는 특징을 보여 최종 선발하였다(LFG-1). 이 선발균은 현미경 관찰을 통하여 구균으로 확인되었으며, 젖산과 점질생성력에서 유사한 경향을 보이며 형태가 다른 1개의 구균 균주(LFG-2)를 같이 선발하여 비교실험에 사용하였다.
- 이들 균주는 모두 gram(+)구균이며, catalase test에서는 음성을 보였고 산소유무와 관계없이 잘 증식을 하였다. 리트머스 우유를 이용한 증식 시험에서 선발된 LFG-1 균주는 10。(2에서는 생장하지 않는 반면에 45。(2에서는 생장하였고, LFG-2 균주는 상대적으로 10。(2에서는 생장을 보인 반면에 45。(2에서는 생장하지 못하였으며, 두 균주 모두 spore는 형성하지 않았다.
후속연구
- Table 2에서와 같이 LFG-1 균 주는 상업균주와 유사한 수준으로 단백질 응고력이 우수하여 배양 12시간에 유단백질이 응고되었으나, LFG-2 균 주는 같은 배양시간 동안 비교적 낮은 수준의 유단백질 응고력을 보였다. 이러한 LFG-1 균주의 우수한 커드형성 능력은 발효유용 starter로서 적합하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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