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문제 정의
- 따라서 본 연구는 H2O2 에 의하여 결막세포주 내에서 일어난 손상정도를 확인하고 이러한 과정 중에 세포 고사를 조절하는 유전자들의 변화를 관찰함으로써 활성산소에 의한 결막 세포주에서의 반응을 알아보고자 하였고, 천연항산화제로 알려져 있는 EGCG의 보호효과 및 기전을 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 활성산소가 결막 세포주에 미치는 영향 정도를 평가하고 천연물인 녹차추출물 EGCG의 항산화 작용과 자유라디칼 소거작용 및 이에 의한 산화적 세포 독성억제 효과 등을 검토하였다. 활성산소는 인체의 대사과정 중 미토콘드리아 내에서 전자전달계에 의해 소량 생성되며, 또는 세포질, 대식세포, 백혈구에서도 생성되며20 이외에도 세포 호흡과정이나 여러 종류의 호르몬, 성장인자, 사이토카인 및 신경전달물질 등이 세포막 수용체를 통해, 신호를 전달하는 과정에서 발생한다21.
제안 방법
- EGCG ((-)-epigallocatechin-3-gallate, (2R, 3R)-2-(3, 4, 5-Trihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3, 5, 7-triol 3-(3, 4, 5-trihydroxybenzoate: Sigma, USA)은 배양액에 녹인 후 일정 량으로 분주된 clone 1-5c-4 세포주에 40 eM부터 200 mM까지 농도별로 처리 후 24시간 배양하여 대조군과 처리군의 세포독성 정도를 비교하였다.
- (Chungbuk, Korea)의 Accu-Perp® Genomic DNA extraction kit를 사용하였다. 玦。2에 의해 세포사멸이 유도된 세포에서 EGCG의 세포보호에 대한 생화학적인 변화는 DNA 분절화를 통해 확인하고자 아갈로스 겔 전기영동을 시행하여 밴드 양상을 관찰하고 사진을 촬영하였다.
- 배양하였다. 세포 내 활성산소를 측정하기 위해 25 pM의 DCFH-DA를 첨가하여 15분 배양하고, 100 pM H2O2 처리한 후 0분, 15분 30분에 걸쳐 흥분파장을 485 nm, 방출파장을 535 nm로 고정 하여 형 광분광광도계 (Fluoroskan Ascent FL600, UK)를 이용하여 fluorescence 를 측정하였다. 실험결과는 DCFH-DA 를 처리하지 않은 well에서 측정된 fluorescence 값으로 보정하였다19.
- Clone 1-5c-4 세포주를 96-well plate에서 24시간 동안 배양한 후 EGCG을 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 100 eM 이 하의 EGCG 농도에서는 세포증식 저해가 30%를 넘지 않는 것으로 나타났으며 , 100 WM에서는 71.
- Clone 1-5c-4 세포주에 IC50값에 가까운 농도인 100 eM 의 H2O2를 6시간 처리 하였을 때 생존율이 IC50값 이하로 나타났기 때문에 EGCG의 보호효과 유무를 알아보기 위해 clone 1-5c-4 세포주를 24시간 동안 배양한 후 100 eM의 EGCG를 2시간 동안 전처리 하고, 100 mM의 H2O2를 후처리한 다음 6시간 후에 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 전처리하지 않은 실험군은 58 + 3.
- h2o2에 의한 세포고사 정도와 egcgI 세포 보호 효과를 아갈로스 겔 전기영동을 통해 DNA 분절화 현상을 관찰하였다. 100 mM의 H2O2를 6시간 단독 처리 했을 때 DNA 분절화가 일어났으나 EGCG를 첨가한 실험군에서는 EGCG! 처리농도 의존적으로 DNA 분절화 현상이 점차 억제되었다 (Fig.
- H2O2로 유발된 세포사멸을 대해 보호효과를 나타낸 EGCG의 항산화 활성도를 측정하였다. EGCG의 농도별로 각각 1, 10, 50, 100, 500 炒!씩 반응시켰을 때, 남아있는 라디칼의 양은 농도에 따라 각각 100.
- 활성산소종은 세포고사의 과정에서 중요한 요소로 작용되어지므로 EGCG의 처리로 인한 세포고사를 억제하는 작용기전을 mRNA 발현수준에서 확인하였다. bcl-2 계열의 단백질은 세포고사를 조절하는 중요한 인자로, 구조적으로 유사하지만 생물학 기능에 따라 세포고사를 억제시키는 군(bcl-2, bcl-xL)과 항진시키는 군(bax)으로 나뉜다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 사람의 결막세포인 clone 1-5c-4 세포주를 한국 세포주 은행 (Korean cell line bank, Korea)으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 10%의 fetal bovine serum(FBS), fungizone, antibiotics를 함유한 RPMI 1640 (Gibco, USA) 배양액을 사용하였다.
- 분양 받아 실험에 사용하였다. 10%의 fetal bovine serum(FBS), fungizone, antibiotics를 함유한 RPMI 1640 (Gibco, USA) 배양액을 사용하였다. 세포는 37oC, 5% CO2로 조정된 CO2 항온기 (Forma Scientific, USA) 에서 배양하였다.
- DNA extractione Bioneer Co.(Chungbuk, Korea)의 Accu-Perp® Genomic DNA extraction kit를 사용하였다. 玦。2에 의해 세포사멸이 유도된 세포에서 EGCG의 세포보호에 대한 생화학적인 변화는 DNA 분절화를 통해 확인하고자 아갈로스 겔 전기영동을 시행하여 밴드 양상을 관찰하고 사진을 촬영하였다.
데이터처리
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8. 자료의 통계정리
통계학적 유의성 검정은 Student t-test 방법을 사용했으며, 유의수준 p<0.05 의 범위 내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- EGCG의 자유라디칼 제거효과를 알아보기 위한 항산화 활성 검정은 Abe18 의 방법에 의하여 안정한 라디칼인 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazy l(DPPH: Sigma, USA) 에 대한 소거 능을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 메탄올에 용해한 후, 1.
- 세포고사에 관련된 mRNA 변화를 관찰하기 위해 역전사 중합효소반응 (RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction)을 실시하였다. cDNA를 합성은 reverse transcription kit(Promega, US A)를 사용하였고 사용된 primer 는 bcl-2, bcl-xL, bax 이다.
- 2. Effects of concentration of EGCG on the viability of clone 1-5c-4 cell line assessed with the MTT assay that was determined by measuring optical density at 570 nm.
성능/효과
- 후 EGCG을 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 100 eM 이 하의 EGCG 농도에서는 세포증식 저해가 30%를 넘지 않는 것으로 나타났으며 , 100 WM에서는 71.1 + 4.3%의I 세포 생존율을 나타냈다. EGCG의 처리농도 의존적으로 세포 독성이 더 강해지는 것을 관찰하였다 (Fig.
- 3%의I 세포 생존율을 나타냈다. EGCG의 처리농도 의존적으로 세포 독성이 더 강해지는 것을 관찰하였다 (Fig. 2).
- 그 결과, 대조군의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 전처리하지 않은 실험군은 58 + 3.99% 이하의 세포생존율을 나타낸 반면, EGCG를 각각의 농도 1, 10, 50, 100 mM 처 리한 실험군에서는 농도별로 각각 68.2, 78.3, 88, 90.7% 생존율을 나타내어 농도 의존적으로 세포생존율이 증가되었음을 알 수 있었다 (Fig. 3).
- EGCG! 처리농도 의존적으로 DNA 분절화 현상이 점차 억제되었다 (Fig. 4).
- 1, 10, 50, 100, 500 炒!씩 반응시켰을 때, 남아있는 라디칼의 양은 농도에 따라 각각 100.23, 97.85, 58.81, 57.14, 47.23%를 나타내었으며 EGCG의 농도 의존적인 자유 라디칼의 소거효과가 관찰되었다 (Fig. 5).
- 처리 즉시 측정값은 EGCG 의 처리군과 무처리군의 값이 큰 차이를 나타내지 않았지만, 15분 경과 시 EGCG의 처리농도 별로 1, 10, 50, 100 mM의 경우 대조군에 비해 각각 89%, 74.1%, 41.1%, 40%로서 농도별로 ROS 생성량이 점차 감소되었다. 즉, EGCG 의 처리농도 의존적으로 ROS 생성량은 감소되었고, 산화적 스트레스 억제 효과를 보여주었다 (Fig.
- 1%, 40%로서 농도별로 ROS 생성량이 점차 감소되었다. 즉, EGCG 의 처리농도 의존적으로 ROS 생성량은 감소되었고, 산화적 스트레스 억제 효과를 보여주었다 (Fig. 6).
- 세포 내 존재하는 라디칼의 양은 EGCG의 농도에 따라 감소하여 EGCG의 농도 의존적으로 자유라디칼의 소거효과가 있음을 알 수 있었다. H2O2의 농도와 노출 시간에 따른 세포생존정도는 처 리농도 100 剛(24시간)일 때 65.
- 62%의 세포생존율을 나타내었다. 동일 시간동안 H2O2 를 노출시킨 각각의 세포에 대해 망막색소상피세포에서는 400 剛일 때 60%의 생존율을23, 뇌신경세포에서는 약 400 mM일 때 50%의 생존율을24, 난소세포에서는 500 mM 일 때 51%의 세포생존율을25 나타내어 상대적으로 결막 세포주는 저농도에서 산화적 손상을 많이 받았음을 알 수 있었다. EGCG의 보호효과를 알아보기 위해 EGCG를 농도별로 전 처리한 결과 처리농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다.
- 동일 시간동안 H2O2 를 노출시킨 각각의 세포에 대해 망막색소상피세포에서는 400 剛일 때 60%의 생존율을23, 뇌신경세포에서는 약 400 mM일 때 50%의 생존율을24, 난소세포에서는 500 mM 일 때 51%의 세포생존율을25 나타내어 상대적으로 결막 세포주는 저농도에서 산화적 손상을 많이 받았음을 알 수 있었다. EGCG의 보호효과를 알아보기 위해 EGCG를 농도별로 전 처리한 결과 처리농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다. H2O2 의 단독 처리군인 58%의 생존율을 비교했을 때, H2O2로 유도된 세포손상에 대하여 보호 효과를 나타냈음을 관찰하였다.
- EGCG의 보호효과를 알아보기 위해 EGCG를 농도별로 전 처리한 결과 처리농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다. H2O2 의 단독 처리군인 58%의 생존율을 비교했을 때, H2O2로 유도된 세포손상에 대하여 보호 효과를 나타냈음을 관찰하였다. 세포 내 존재하는 ROS양은 EGCG 구조상 특징과 관련이 있다.
- 세포손상정도는 DNA 분절화 현상을 통해 관찰할 수 있었다. 본 실험결과 H2O2에 의해 DNA 분절화 현상을 나타냈었으며 EGCG의 처리 농도 의존적으로 DNA 분 절화 현상이 점차 감소함을 관찰할 수 있었다.
- Bax는 bcl-2와 heterodimer를 형성하고 있어 상호간에 기능이 억제하는데, 분리되면 직접 혹은 간접적인 경로를 통해 세포고사를 촉진하는 것으로 알려져 있다28. 본 실험 결과 역시 EGCG의 농도별 처리에 의해 bcl-2와 bcl-xL의 mRNAe 발현이 증가되었으나, 이와 반대로 bax mRNA 의 발현은 감소하였다. 따라서 EGCG는 자유라디칼에 의한 노화 및 암에 관련된 안과질환의 예방제로서, 또는 약물로서 첨가하는데 있어 응용가능성이 높은 물질로 판단된다.
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결론
결막 세포주는 100 mM 농도의 H2O2에 의해 세포 고사가 유도됐음을 확인하였다. 다른 세포주와 비교하였을 때 저농도에서의 세포고사 발생은 안구의 외안부에 위치한 결막 세포가 자외선이나 각종 약물에 의해 발생되는 산소라디칼의 영향에 쉽게 노출될 수 있음을 의미한다.
후속연구
- 천연 항산화제로 알려진 EGCG는 자유라디칼 소거작용을 통해, 세포내 ROS의 농도를 감소시키는 항산화 활성을 보여 이로 인해 산소 라디칼에 의한 산화적 손상에 대한 세포보호 기능이 있음을 나타냈다. 따라서 EGCG를 첨가하는 사용 허용범위와 이와 더불어 콘택트렌즈에서 소독제로 사용되는 H2O2의 허용범위농도를 조절할 수 있는 기초 자료로 활용될 것으로 판단된다.
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