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문제 정의
- 이에 본 연구자들은 加減聰明湯 (GCMT) 을 구강 투여한 흰쥐의 국소뇌혈류량(regional Cerebral Blood Flow, rCBF) 및 평균 동맥혈압 (Mean Artery Blood Pressure, MABP) 의 변화를 관찰하고, 이러한 변화와 관련된 기전을 알아보기 위하여 Indomethacin과 methylene blue를 전치치 한 다음 rCBF와 MABP 의 변화를 살펴 보았다. 또한, 흰쥐에 허혈을 유발한 다음 GCMT 를 투여하면서 뇌혈류 개선 양상을 관찰하였다.
가설 설정
- 10). 이런 연구를 근거로 하여 본 연구진은 GCMT 가 정상 동물에서 국소뇌혈류량을 개선하는 효과가 있고, 허혈이 유발된 동물에서 좀더 안정적인 뇌혈류 개선을 보일 것이라는 가설을 세우고 본 연구를 진행 하였다.
제안 방법
- GCMT 2첩 분량 (112 g) 을 증류수 1, 200 과 함께 전기 약탕기(대웅, 한국)으로 3시간 동안 가열하여 열수추출액을 얻은 다음, 거즈로 거른 여과액을 원심분리기(VS 6000CFN, vision, Korea) 를 이용하여 5,000 rpm 에서 15분간 원심분리하여 상청액을 취하였다. 얻어진 상청액은 減壓加溫法을 이용하여 powder 로 조제 하였다.
- A) 으로 마취시킨 후 체온이 37~38 C 로 유지될 수 있도록 heat pad 위에 복와위로고정시켰다. GCMT 투여 용량 (1 m/k, 5 m/k, 10 m/k, 20 ㎎/㎏, i.p.)에 따른 MABP 변화는 흰쥐의 대퇴동맥에 삽입된 polyethylene tube 에 연결된 pressure transducer (Grass, U.S.A.) 를 통하여 MacLab과 macintosh computer로 구성된 data acquisition system으로 각각 30분 동안 측정하였다미.
- 인도메타신은 prostaglandin 의 생성효소인 cyclooxygenase 를억제하는 약물이며, Cyclooxygenase 에 의한 최종 산물인 prostaglandin 은 강력한 혈관 확장 물질 중의 하나이다18). GCMT 투여로 유의성 있게 증가된 국소 뇌혈류량이 뇌혈관의 직경 확장에 의한 것인지에 대하여 알아보고자 혈관 확장 억제제를 전처 치하였다. Cyclooxygenase 의 억제제인 인도메타신을 전 처치한 후 GCMT 를 투여한 결과, IDM 군의 국소 뇌혈류량은 대조군의 국소 뇌혈류량은 특별한 변화를 보이지 않았다(Fig.
- GCMT가 rCBF 및 MABP 변화에 미친 작용 기전을 알아보기 위하여 혈관 확장 인자 억제제인 Indomethacin(1 ㎎/㎏, i.p., IDM, Sigma I7378)과 methylene blue (0.01 ㎎/㎏, i.p., MTB, Sigma M9140) 를 사용하여 전처치한 후 GCMT 투여 용량 (1 mg/ kg, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, i.p.) 에 따라 변화되는 rCBF 및 MABP 를 각각 30분 동안 측정하였다12).
- 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지하도록 하였다. Laser doppler flowmeter (Transonic Instrument, U.S.A.)용 needle probe (직경 0.8 m)를 대뇌 (두정엽) 피질 표면에 수직이 되도록 stereotaxic micro manipulator를 사용하여 뇌연막 동맥에 조심스럽게 근접시켰다. 일정시간 동안 안정시킨 후 실험 절차에 따라 GCMT 를 용량별 (1 /kg, 5 kg, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, i.
- 이에 본 연구자들은 加減聰明湯 (GCMT) 을 구강 투여한 흰쥐의 국소뇌혈류량(regional Cerebral Blood Flow, rCBF) 및 평균 동맥혈압 (Mean Artery Blood Pressure, MABP) 의 변화를 관찰하고, 이러한 변화와 관련된 기전을 알아보기 위하여 Indomethacin과 methylene blue를 전치치 한 다음 rCBF와 MABP 의 변화를 살펴 보았다. 또한, 흰쥐에 허혈을 유발한 다음 GCMT 를 투여하면서 뇌혈류 개선 양상을 관찰하였다.
- ) 를 투여한 실험군과 GCMT 를 투여하지 않은 대조군으로 분류하였다. 뇌 허혈을 유발시킨 120분 후 혈류를 재관류시켜 변동되는 국소 뇌 혈류량을 상기 방법으로 240분 동안 측정하였다12).
- 120분 후 내경동맥내에 삽입되어 있는 단선조 나일론 봉합사를 MCA 기저부로 부터 제거해 줌으로써 혈액을 재관류시켰다1히. 뇌허혈를 유발시킨 후 실험 절차에 따라 GCMT (10 ㎎/㎏, i.p.) 를 투여한 실험군과 GCMT 를 투여하지 않은 대조군으로 분류하였다. 뇌 허혈을 유발시킨 120분 후 혈류를 재관류시켜 변동되는 국소 뇌 혈류량을 상기 방법으로 240분 동안 측정하였다12).
- 의 변화를 살펴 보았다. 또한, 흰쥐에 허혈을 유발한 다음 GCMT 를 투여하면서 뇌혈류 개선 양상을 관찰하였다.
- 또한, 흰쥐에 허혈을 유발한 다음 GCMT 를 투여하면서 뇌혈류 개선 양상을 종합적으로 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- artery, MCA) 폐색법을 이용하였다. 병태 모델은 정상 흰쥐의 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고, 내 .외경동맥의 분지점으로부터 내경동맥내로 외경동맥을 통하여 3-0 단선조 나일론 봉합사를 삽입함으로써 MCA 기저부를 폐색시켰다.
- 본 연구진은《東醫寶鑑》의 聰明湯의 약물 중에 국내에서 생산되고 있지 않은 遠地를 제외하고, 人蔘, 黃芪, 白朮, 當歸, 木 香 甘草 등을 첨가하여 加減聰明湯(GCMT)를 창방하였다. 이때, 加味된 人蔘, 黃芪, 白朮, 當歸, 木香, 甘草 등은 心脾陽虛에 의한 제반 神志 질환에 가장 많이 쓰이는 歸脾湯의 일부에 해당한다.
- 병태 모델은 정상 흰쥐의 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고, 내 .외경동맥의 분지점으로부터 내경동맥내로 외경동맥을 통하여 3-0 단선조 나일론 봉합사를 삽입함으로써 MCA 기저부를 폐색시켰다. 120분 후 내경동맥내에 삽입되어 있는 단선조 나일론 봉합사를 MCA 기저부로 부터 제거해 줌으로써 혈액을 재관류시켰다1히.
- )에 고정시키고 정중선을 따라 두피를 절개하여 두정골을 노출시킨 후 bregma 의 4~ 6 m 측방, -2~ 1 m 전방에 직경 5~6 의 두개창 수술을 시행하였다. 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지하도록 하였다. Laser doppler flowmeter (Transonic Instrument, U.
- 8 m)를 대뇌 (두정엽) 피질 표면에 수직이 되도록 stereotaxic micro manipulator를 사용하여 뇌연막 동맥에 조심스럽게 근접시켰다. 일정시간 동안 안정시킨 후 실험 절차에 따라 GCMT 를 용량별 (1 /kg, 5 kg, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, i.p.) 로 투여한 다음 변화되는 rCBF를 각각 30분 동안 측정하였다11).
- 측정 흰쥐를 750 ㎎/㎏ 의 urethane (Sigma, U.S.A) 으로 마취시킨 후 체온이 37~38 C 로 유지될 수 있도록 heat pad 위에 복와위로고정시켰다. GCMT 투여 용량 (1 m/k, 5 m/k, 10 m/k, 20 ㎎/㎏, i.
- 흰쥐를 stereotaxic frame (DKI, U.S.A.)에 고정시키고 정중선을 따라 두피를 절개하여 두정골을 노출시킨 후 bregma 의 4~ 6 m 측방, -2~ 1 m 전방에 직경 5~6 의 두개창 수술을 시행하였다. 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지하도록 하였다.
대상 데이터
- 동물은 체중 300 g 내외의 雄性 Sprague-Dawley계 흰쥐를 (주) 다물 사이언스에서 구입하여 사용하였다. 동물은 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12시간 dark/light) 에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 다물 사이언스에서 구입하여 사용하였다. 동물은 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12시간 dark/light) 에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 실험에 사용된 加減聰明湯 (Gagam-ChongMyeong-Tang, GCMT) 의 약재 구성은《東醫寶鑑》8)의 처방을 국내산 한약재 위주로 적절히 가감하였다. 포함된 약재는 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였으며, 구성은 Table 1과 같다.
- 가감하였다. 포함된 약재는 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였으며, 구성은 Table 1과 같다. 2
데이터처리
- GCMT가 rCBF 및 MABP에 미치는 효과를 각각 30분 단위로 합산 통계 처리하였고, 그에 대한 통계처리 방법은 student's t-test에 의하였으며, p-value는 0.05 미만인 경우 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 뇌 허혈 유발은 Longa 등의 방법에 따라 중대뇌동맥 (middle cerebral artery, MCA) 폐색법을 이용하였다. 병태 모델은 정상 흰쥐의 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고, 내 .
- 취하였다. 얻어진 상청액은 減壓加溫法을 이용하여 powder 로 조제 하였다. 감압가온은 70C에서 24시간동안 지속되었다.
성능/효과
- 4. 뇌허혈 유발 흰쥐의 국소 뇌혈류량 변동에 미치는 개선 효과 뇌 허혈 상태 대조군의 국소 뇌혈류량은 정상 상태의 50% 정도로 감소하여 120분 동안 뇌혈류가 잘 차단되었음을 보였다. 이러한 차단은 재관류에 의해서 회복되는 경향을 보였다.
- GCMT 투여로 유의성 있게 증가된 국소 뇌혈류량이 뇌혈관의 직경 확장에 의한 것인지에 대하여 알아보고자 혈관 확장 억제제를 전처 치하였다. Cyclooxygenase 의 억제제인 인도메타신을 전 처치한 후 GCMT 를 투여한 결과, IDM 군의 국소 뇌혈류량은 대조군의 국소 뇌혈류량은 특별한 변화를 보이지 않았다(Fig. 2). 그러나 guanylate cyclase 의 억제제인 메틸렌블루를 전처치한 후 GCMT 를 투여한 결과, MTB 군의 국소 뇌혈류량은 대조군의 국소 뇌 혈류량보다 유의성있게 감소되었다 (Fig.
- 회복 경향은 매우 불안정 하였으나 기저치에 비하여서는 증가된 상태를 유지하였다. GCMT를 투여한 후, 이와 동일한 방법으로 뇌 허혈과 재관류를 유도하고 국소 뇌혈류량을 관찰한 결과 대조군의 불안정한 국소 뇌혈류량의 변화에 비해 유의성 (P<0.001) 있게 안정적으로 개선되었다 (Fig. 4).
- 2). 그러나 guanylate cyclase 의 억제제인 메틸렌블루를 전처치한 후 GCMT 를 투여한 결과, MTB 군의 국소 뇌혈류량은 대조군의 국소 뇌 혈류량보다 유의성있게 감소되었다 (Fig. 2). 상기한 결과를 정리해보면, GCMT 의 국소 뇌혈류랑 및 평균 혈압 상승을 메틸렌블루가 효율적으로 억제한 것으로 보인다.
- 9%였다. 그러나, 메틸렌블루를 전처치한 후 GCMT를 용량별로 투여한 MTB 군의 평균 동맥 혈압은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다 (Fig. 3).
- 않았다. 메틸렌블루를 전처치한 후 GCMT 를 용량별로 투여한 MTB 군의 국소 뇌혈류량은 대조군에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다. 대조군의 국소 뇌혈류량 기저치를 100%로 환산하였을 때, GCMT 1, 5, 10, 20 ㎎/㎏를 투여한 군의 rCBF는 각각 102.
- 심각하게 발생된다19). 본 논문의 결과에서 GCMT 군은 재관류 후 불안정한 증가 상태를 보였던 대조군의 국소 뇌혈류량에 비하여 보다 유의성 있게 안정화되었고, 재관류 4시간 후에는 기저치와 비슷한 국소 뇌혈류량을 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해서 볼 때 정상 흰쥐에서 국소 뇌혈류량을 유의성 있게 변화시킨 GCMT 가 뇌허혈시에도 국소 뇌혈류량의 변동을 유의하게 개선시킴으로써 허혈로 인한 뇌손상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다 (Fig.
- 본 논문의 결과에서 GCMT 는 정상 흰쥐에서 국소 뇌 혈류량을 농도에 비례하여 증가시키는 경향을 보였다. 20 ㎎/㎏의 GCMT 는 통계적으로 유의한 국소 뇌혈류량의 증가를 보였다.
- 2). 상기한 결과를 정리해보면, GCMT 의 국소 뇌혈류랑 및 평균 혈압 상승을 메틸렌블루가 효율적으로 억제한 것으로 보인다. 이러한 결과는 GCMT의국소 뇌혈류랑 및 평균혈압 상승의 기전에는 guanylate cyclase 관련 기전이 관여한다는 강력한 증거로 해석되었다.
- 평균 동맥혈압에는 특별한 영향을 미치지 않았다. 상승된 국소뇌혈류량은 메틸렌블루의 전처치를 통하여 억제되었고, 인도메타신 전처치는 특별한 영향을 미치지 않았다. 인도메타신 전처치에 의하여 평균 동맥 혈압은 유의한 감소를 보였다.
- 상기한 결과를 정리해보면, GCMT 의 국소 뇌혈류랑 및 평균 혈압 상승을 메틸렌블루가 효율적으로 억제한 것으로 보인다. 이러한 결과는 GCMT의국소 뇌혈류랑 및 평균혈압 상승의 기전에는 guanylate cyclase 관련 기전이 관여한다는 강력한 증거로 해석되었다.
- 본 논문의 결과에서 GCMT 군은 재관류 후 불안정한 증가 상태를 보였던 대조군의 국소 뇌혈류량에 비하여 보다 유의성 있게 안정화되었고, 재관류 4시간 후에는 기저치와 비슷한 국소 뇌혈류량을 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해서 볼 때 정상 흰쥐에서 국소 뇌혈류량을 유의성 있게 변화시킨 GCMT 가 뇌허혈시에도 국소 뇌혈류량의 변동을 유의하게 개선시킴으로써 허혈로 인한 뇌손상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다 (Fig. 4).
- 상승된 국소뇌혈류량은 메틸렌블루의 전처치를 통하여 억제되었고, 인도메타신 전처치는 특별한 영향을 미치지 않았다. 인도메타신 전처치에 의하여 평균 동맥 혈압은 유의한 감소를 보였다. 허혈 모델 동물에서 재관류 후 불안정한 증가 상태를 보였던 대조군의 국소 뇌혈류량을 유의성 있게 안정화시켰다.
- 인도메타신을 전처치한 후 GCMT 를 처리한 IDM 군의 평균 동맥 혈압은 GCMT 를 단독으로 투여한 경우에 비하여 통계적으로 유의한 감소를 보였다. 대조군의 국소 뇌혈류량 기저치를 100%로 환산하였을 때, GCMT 1, 5, 10, 20 ㎎/㎏ 를 투여한 군의 rCBF는 각각 98.
- 감압가온은 70C에서 24시간동안 지속되었다. 최종적으로 얻어진 powder 는 14.3g 으로 수율은 12.8%였다.
- 인도메타신 전처치에 의하여 평균 동맥 혈압은 유의한 감소를 보였다. 허혈 모델 동물에서 재관류 후 불안정한 증가 상태를 보였던 대조군의 국소 뇌혈류량을 유의성 있게 안정화시켰다.
후속연구
- 이상의 결과들에서 加味聰明湯은 정상 동물 및 허혈 동물에서 국소뇌혈류량을 증가시킬 수 있으므로, 노화에 의한 痴呆 예방, 健忘症에 대한 예방 및 치료 보조제로서의 가능성을 제시하는 바이며, 추후 노화나 건망증 동물 모델을 활용한 후속 연구가 필요하리라 생각된다.
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