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문제 정의
- 본 연구는 허혈성 뇌손상에 따른 기억과 인지능력 저하에 대한(GCMT)의 효과를 알아보고자 Morris 수중미로 (Morris water maze)를 사용하여 인지적 및 신경학적 운동행동평가와 조직 화학적기 법(histochemistry)을 이용하여 손상된 해마 부위에서 BDNF의 발현 양상을 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- CM仰에 대 한 연구로 聰明湯 추출물이 뇌신경교 성상세포의 TNF-a 생성을 억제한다는 보고와 본 연구와 처방이 비슷한 加味歸脾聰明湯이 노화 백서의 항산화 기능을 개선한다는 보고가 있다. 이러한 연구들을 토대로 GCMT가 허혈성 뇌신경 질환 동물에서 학습 및 기억의 인지능력에 개선을 보일 것이라는 가설을 세우고 본 연구를 진행하였다.
- 이에 본 연구자들은 허혈성 뇌손상에 따른 기억과 인지능력 저하에 대한 加減聰明湯(GCMT)의 효과를 입증하고자 Morris 수중미로(Morris water maze)를 사용하여 인지적 및 신경학적 운동행동평가와 조직화학적기법 (histochemistry)을 이용하여 손상된 해마 부위에서 BDN의 발현 양상을 관찰하여 인지능력과 운동기능회복에 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- GCMT 2첩 분량 (112 g)을 증류수 1, 200과 함께 전기 약탕기(대웅, 한국)으로 3시간 동안 가열하여 열수추출액을 얻은 다음, 거즈로 거른 여과얙흘 원심분리기(VS 6000CFN, vision, Korea)를 이용하여 5, 000 rpm에서 15분간 원심 분리 하여 상청 액을 취하였다. 얻어진 상청액은 減壓加溫法을 이용하여 powder 루 초제하여, 식이 위해 GCMT powder와 일반사료를 1 : 1000(g/kg)의 비율로 증류수(distilled water)에 녹여 4-5일 정도 완전 건조시켜 고형사료를 제조하였다.
- 냉각된 인공 뇌척수액에 담가두었다. 그 후 적출한 뇌를 2, 3/4-triphenyltertrazoliiim chloride (TTC, Sigma, Inc., St Louis, MO, USA) 를 포함하는 phosphate-btiffered saline (PBS) 에 30분간 담근 후/ 37℃에 20분간 배 양한 후 2% paraformaldehyde 용액에 고정하여 뇌경색 여부를 확인하였다.
- 염색을 실시하였다. 먼저, 뇌 조직절편을 0.01 M PBS로 여러 번 세척한 후 남아 있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 1% normal blocking serum sodium borohydride로 1시간 처리하였다. 면역 조직화학염색을 위한 전처리과정으로 0.
- 01 M PBS로 여러 번 세척한 후 남아 있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 1% normal blocking serum sodium borohydride로 1시간 처리하였다. 면역 조직화학염색을 위한 전처리과정으로 0.3%의 과산화수소(hydrogen peroxide) 용액에 20분간 처리하였다. 다시 0.
- 다시 PBS 로 세척하고 Novostain Super ABC Reagent로 30분간 배양하고 PBS로 세척하였다. 발색을 위해 DAB (Serotec Ltd, BUF021B, UK)에 10분 간 적용 후 Mayer7s Hematoxyline (Sigma, MHS-32/ USA)으로 대조 염색(counterstaining)을 실시하였으며/ 흐르는 물에 5분간 수세하고 슬라이드 표본을 건조시킨 후 통상의 탈수과정을 거쳐 봉입을 실시하였다. 봉입한 조직을 광학현미경(Olympus BX50, Olympus Optical Co.
- 5℃로 유지시킨 상태에서 Longa 등(1989)의방법을 이용하여 허혈을 유발하였다. 백서의목 정중부를 절개하고 좌측 총경동맥을 박리하여 총경동맥을 따라 근위부로 진행하여 외경동맥과 내경동맥을 분리한 후 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 총경동맥 분지부에 monofilament nylon (4.0호) 실끝을 뭉툭하게 하여 밀어 넣어 중대뇌동맥을 폐쇄한 후 봉합 및 소독을 하였다. 사육용 케이지에 넣어 24시간 동안 안정을 시켰다.
- 본 연구는《東醫寶鑑》의 聰明湯의 약물 중 국내에서 생산되고 있지 않은 遠地를 제외한 白朮, 當歸, 黃茂, 人蔘, 木香, 甘草 등을 첨가하여 加減聰明湯(GCMT)를 창방하였다. 이때, 加味된 白 朮, 當歸, 黃茂, 人蔘, 木香, 甘草 등은 心脾陽虛에 의 한 神志 질환에 많이 쓰이는 歸脾湯项의 일부에 해당된다.
- 발색을 위해 DAB (Serotec Ltd, BUF021B, UK)에 10분 간 적용 후 Mayer7s Hematoxyline (Sigma, MHS-32/ USA)으로 대조 염색(counterstaining)을 실시하였으며/ 흐르는 물에 5분간 수세하고 슬라이드 표본을 건조시킨 후 통상의 탈수과정을 거쳐 봉입을 실시하였다. 봉입한 조직을 광학현미경(Olympus BX50, Olympus Optical Co., Japan)을 이용하여 관찰하였다.
- 실험동물은 항온항습 장치가 부착된 사육실(온도 25+VC, 습도 55+10%, 12시간 dark/light)에서 생활습성을 유지하도록 하였다. 실험동물은 정상군(n=10), 대조군(n=10), 실험군(n=10)으로 구분하였고, 다시 각 군을 7일군과 14군으로 나누었다. 허혈성 뇌손상 유발 72시간 후에 대조군은 일반사료(CD)(삼양사, korea)와 실험군은사료(CMTD)를 처치하였다(Table 2).
- 실험동물은 항온항습 장치가 부착된 사육실(온도 25+VC, 습도 55+10%, 12시간 dark/light)에서 생활습성을 유지하도록 하였다. 실험동물은 정상군(n=10), 대조군(n=10), 실험군(n=10)으로 구분하였고, 다시 각 군을 7일군과 14군으로 나누었다.
- 실험에 사용된 백서는 허혈성 뇌손상 유발 전, 하루에 180초 간 4시행씩 6일간 훈련을 시켰다. 평가는 수조 안에 백서가 출발에서부터 도피대로 올라가는데 걸린 시간을 측정하고, 그 행적을 SMART JUNIOR 프로그램 (ParLab, Spain)을 이용하여 분석하였다.
- 취하였다. 얻어진 상청액은 減壓加溫法을 이용하여 powder 루 초제하여, 식이 위해 GCMT powder와 일반사료를 1 : 1000(g/kg)의 비율로 증류수(distilled water)에 녹여 4-5일 정도 완전 건조시켜 고형사료를 제조하였다.
- 있다. 이는 동물의 주변에 있는 단서들을 사용하여 기억력 즉 공간 기외부 정보를 학습하여 기억하고, 그 사실들의 시, 공간적 위치를 근거로 행동하는 능력인데, 본 연구에서는 백서들을 물로 채운 수조 내에 숨겨진 도피대(escape platform)를 찾는 것을 학습한 다음 자신의 위치를 학습하게 하여, 숨겨진 도피대를 찾게 하였다. Clark 등(1995)은 21, 해마의 신경이 손상된 백서는 수중미로 실험에서 학습수행과 기억력이 떨어진다고 보고하였다.
- 실험동물은 정상군(n=10), 대조군(n=10), 실험군(n=10)으로 구분하였고, 다시 각 군을 7일군과 14군으로 나누었다. 허혈성 뇌손상 유발 72시간 후에 대조군은 일반사료(CD)(삼양사, korea)와 실험군은사료(CMTD)를 처치하였다(Table 2).
- 허혈성 뇌손상 유발 백서 모델을 제작하기 위해 럼푼 (Rompun, 바이엘 코리아)과 염산 케타민(Ketamine HCL, 유한양행)을 1:1로 혼합하여 만든 전신 마취제를 복강내에 주사(3 /kg)하였다. 체온을 수술도중 37±0.
- 허혈성 뇌손상 유발 후의 공간학습 및 기억력 평가를 위하여 수중미로검사를 실시하였다. 시간에 따른 각 군의 도피대 도달 시간을 비교하기 위하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(7 일; p<0.
- 허혈성 뇌손상 후의 공간학습 및 기억력에 미치는 효과를 알아보기 위해 허혈성 뇌손상 유발 7일과 14일 후에 해마 (hippocampus) 에서 BDNF의 면역조직화학법을 적용하여 조직학적 소견을 비교 관찰하였다. 정상군은 7일과 14일에서 큰 변화가 없는 일정한 면역양성반응을 보였고, 대조군은 허혈성 뇌손상유발 7일에 감소된 면역양성반응을 보이다가 유발 14일에 다소 증가된 면역양성반응을 보였다.
- 허혈성 뇌손상 후의 효과를 알아보기 위해 허혈성뇌손상 유발 7일과 14일 후에 해마(hippocampus)에서 BDNF의 면역조직화학 염색을 실시하였다. 먼저, 뇌 조직절편을 0.
- 9% Na용액으로 관류 수세하였다. 혈액이 제거된 후에는 4% 중성 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류하여 조직 전고정을 실시하였고, 전고정된 실험동물로부터 뇌를 적출하여 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 후고정을 실시하였다. 후고정이 끝난 조직은 에탄올을 이용한 탈수 (dehydration) 과정 과 자일 렌 (xylene) 을 이용한 청명 (cleaning) 과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하였다.
- 효과를 관찰하기 위해 허혈성 뇌손상 유발 7일과 14일 후에 각 군당 10마리씩을 전신 마취제인 럼푼(Romp 바이엘코리아)으로 복강주사(0.6 mg/kg)하여 마취한 후' 심장관류를 통해 0.9% Na용액으로 관류 수세하였다. 혈액이 제거된 후에는 4% 중성 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류하여 조직 전고정을 실시하였고, 전고정된 실험동물로부터 뇌를 적출하여 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 후고정을 실시하였다.
- 혈액이 제거된 후에는 4% 중성 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류하여 조직 전고정을 실시하였고, 전고정된 실험동물로부터 뇌를 적출하여 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 후고정을 실시하였다. 후고정이 끝난 조직은 에탄올을 이용한 탈수 (dehydration) 과정 과 자일 렌 (xylene) 을 이용한 청명 (cleaning) 과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하였다. 제작된 파라핀 블록(paraffin block)은 미세절단기(Sakura 2040, Japan)를 이용하여 5 두께로 박절한 후 슬라이드를 제작하여 면역조직화학 염색을 실시하였다.
대상 데이터
- Four trials per day over 6d were performed for the acquisition test. Rats were treated with ChongMyeong-Tang(Experiment group: 7lh day; n=5, 14lh day; n=5) for 14 days after induction of ischemic brain injury. The normal group(7lh day; n=5, 14th day; n=5), control group(7lh day; n=5, 14th day; n=5) were commercial dieted for 14 days induction of ischemic brain injury.
- 본 실험에서 체 250+50 g의 Sprague-Dawley계 백서 (8〜10주령, 웅성, 대한실험동물) 총 30마리를 사용하였다. 실험동물은 항온항습 장치가 부착된 사육실(온도 25+VC, 습도 55+10%, 12시간 dark/light)에서 생활습성을 유지하도록 하였다.
- 본 연구에 사용한 허혈성 뇌손상 모델은 일;시적으로 뇌에 공급되는 혈관들을 차단한 후 재관류시 킨 것으로, 주로 해마부분신경 세포의 손상을 입게되는데 5-7일이 지나면 apoptosis와 비슷한 세포손상과 인지 및 학습 장애가 일어난다. 해마가 손상된 실험동물들은 방사형 미로(radial arm maze)와 모리스수중미로와 같은 공간 기억문제를 학습하는 능력의 보인다.
- maze test)를 실시하였다. 수조는 직경이 150 cm, 높이가 50 cm인 원형 통으로 온도가 25±1℃로 유지되는 물을 28 cm 높이로 채웠다. 수중미로의 주변은 비디오카메라 실험대, 그리고 실험대 위에 있는 수온 조절용 장치 등 공간 단서들을 일정하게 유지시켰다.
- 실험에 사용된 加減聰明湯 (Gagam-ChongMyeong-Tang GCMT)의 약재 구성은《東醫寶鑑》의 처방을 국내산 한약재위주로 적절히 가감하였다. 포함된 약재는 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 후 .
- 후고정이 끝난 조직은 에탄올을 이용한 탈수 (dehydration) 과정 과 자일 렌 (xylene) 을 이용한 청명 (cleaning) 과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하였다. 제작된 파라핀 블록(paraffin block)은 미세절단기(Sakura 2040, Japan)를 이용하여 5 두께로 박절한 후 슬라이드를 제작하여 면역조직화학 염색을 실시하였다.
- 적절히 가감하였다. 포함된 약재는 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 후 .정선하여 사용하였다(Table 1).
데이터처리
- The normal group(7lh day; n=5, 14th day; n=5), control group(7lh day; n=5, 14th day; n=5) were commercial dieted for 14 days induction of ischemic brain injury. Tested by repeated measures ANOVA(##; p<0.01, ###; p<0.01, ) and Turey's multiple range test. 1)7th day *; p<0.
- for windows을 사용하였다. 각 군의 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, 허혈성 뇌손상 유발 확인 검정은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였고,(CMT)의 공간학습 및 기억력 유의성 검정은 반복측정 분산분석(repeated measure analysis of variance)을 실시하였고/ 사후검정은 Tukey's mtdtiple range test를 실시하였다. 분석 시 유의수준=0.
- 위하여 수중미로검사를 실시하였다. 시간에 따른 각 군의 도피대 도달 시간을 비교하기 위하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(7 일; p<0.01, 14일; p<0.001). 사후검정을 통한 각 군 비교에서는 대조군과 정상군(7일; p<0.
- 79^, 그리고. 실험군은 11.6±0.97점으로 각 군에서의 72시간 후에 나타나는 신경학적 점수를 비교하기 위하여 일원 배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.01). 사후검정을 통한 각 군 비교에서는 정상군과 대조군(p<0.
- 4시행씩 6일간 훈련을 시켰다. 평가는 수조 안에 백서가 출발에서부터 도피대로 올라가는데 걸린 시간을 측정하고, 그 행적을 SMART JUNIOR 프로그램 (ParLab, Spain)을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 공간학습 및 기억력 평가를 위해 수중미로검사(Morris water maze test)를 실시하였다. 수조는 직경이 150 cm, 높이가 50 cm인 원형 통으로 온도가 25±1℃로 유지되는 물을 28 cm 높이로 채웠다.
- 체온을 수술도중 37±0.5℃로 유지시킨 상태에서 Longa 등(1989)의방법을 이용하여 허혈을 유발하였다. 백서의목 정중부를 절개하고 좌측 총경동맥을 박리하여 총경동맥을 따라 근위부로 진행하여 외경동맥과 내경동맥을 분리한 후 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 총경동맥 분지부에 monofilament nylon (4.
- 허혈성 뇌손상 유발 72시간 후 Garcia '(1995)이 제시한 신경학적 '검사를 시행하였다. 정상군은 12.
성능/효과
- 이상의 실험결과를"종합해 보면, 허혈성 뇌손상 백서에서 공간 학습 능력 및 기억력 손상을 회복하는데 기여하였으며, 학습 및 기억의 인지능력과 관련된 해마의 신경영양인자 활성화에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보아 학습 및 기억의 인지능력 개선에 임상적 활용 가치가 높은 것으로 사료된다.
- 2, 3/4-triphenyltertrazolium chloride (TTC) 염색 결과 정상적 인 세포에서는 미 토콘드 리 아 내의 탈수소효소(dehydrogenase) 와 반응하여 붉게 보이지만 뇌허혈에서는 탈수소효소가 소실되어 염색이 되지 않아 백색으로 보여 비가역적 뇌손상유무를 확인할 수 있었다. 손상을 많이 받은 부위로는 대뇌 전두부인 대뇌피질 두정 엽, 선조체, 해마 등이었다(Fig.
- Morris 수미로(Morris water maze)에서 허혈성 뇌손상 유발 후 일반사료를 식이한 대조군에 비해 (GCMT) 사료를 식이한 실험군은 7일째와 14일째에 각각 유의하게(p<0.01) 호전된 차이를 확인할 수 있었다. 조직화학적기법을 통한 해마 부위에서 BDNF의 발현 양상은 허 혈성 뇌손상 유발 후 일반사료를 식이한 대조군에 비해 (GCMT) 사료를 식이한 실험군은 7일째에서부터 14일째까지 현저하게 증가되느 현역 양상반응을 확인할 수 있었다.
- 7일째와 14일째 각의 .사후검정 결과, GCMT 사료식이군이 허혈성 뇌손상 유발 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<0.01). 이는 공간 인지기억 학습수행 능력에 대한 증진 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 001). 사후검정을 통한 각 군 비교에서는 대조군과 정상군(7일; p<0.05, 14일; p<0.001), 대조군과 실험군(7 일; p<0.01, 14일; p<0.01) 사이에서 유의한 차이를 나타냈다 (Table 4)(Fig. 2, 3).
- 01). 사후검정을 통한 각 군 비교에서는 정상군과 대조군(p<0.05), 정상군과 실험군(p<0.01) 사이에서 유의한 차이를 나타낸 반면, 대조군과 실험군 사이에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다(Table 3).
- 정상군은 7일과 14일에서 큰 변화가 없는 일정한 면역양성반응을 보였고, 대조군은 허혈성 뇌손상유발 7일에 감소된 면역양성반응을 보이다가 유발 14일에 다소 증가된 면역양성반응을 보였다. 실험군은 대조군에 비해 허혈성 뇌손상 유발 7일에 증가된 면역양성반응을 보이다가 유발 14일에 상당히 증가된 면역양성반응을 보였다(Fig. 4).
- 소견을 비교 관찰하였다. 정상군은 7일과 14일에서 큰 변화가 없는 일정한 면역양성반응을 보였고, 대조군은 허혈성 뇌손상유발 7일에 감소된 면역양성반응을 보이다가 유발 14일에 다소 증가된 면역양성반응을 보였다. 실험군은 대조군에 비해 허혈성 뇌손상 유발 7일에 증가된 면역양성반응을 보이다가 유발 14일에 상당히 증가된 면역양성반응을 보였다(Fig.
- 01) 호전된 차이를 확인할 수 있었다. 조직화학적기법을 통한 해마 부위에서 BDNF의 발현 양상은 허 혈성 뇌손상 유발 후 일반사료를 식이한 대조군에 비해 (GCMT) 사료를 식이한 실험군은 7일째에서부터 14일째까지 현저하게 증가되느 현역 양상반응을 확인할 수 있었다.
- 해마부위에서의 신경영양인자 BDNF의 면역조직화학 염색을 통한 면역반응검사는 정상군은 일정한 면역양성반응을 보였고, 대조군은 허혈성 뇌손상 유발 7일째에 크게 감소되었다가 14 일째에 다소.증가된 면역양성반응을 보인 반면, 실험군은 7일째와 14일째에 증가된 면역양성반응을 보였다.
후속연구
- 이상의 결과들에서 (GCMT) 사료가 허혈성 뇌손상 이후 학습 및 기억의 인지능력에 중요한 역할을 하는 해마 부위에서 BDNF의 발현 활성화에 상당한 영향을 미치는 것으로 생각되며, 향후 이에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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