[논문]대승기탕(大承氣湯)이 중대뇌동맥 폐쇄 흰쥐의 신경세포 자연사에 미치는 영향

최은빈; 김연섭

[국내논문] 대승기탕(大承氣湯)이 중대뇌동맥 폐쇄 흰쥐의 신경세포 자연사에 미치는 영향
Effect of Daeseungki-tang on Apoptotic Neuronal Cell Death of MCAO Rats 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.22 no.2, 2008년, pp.403 - 409

최은빈 (경원대학교 한의과대학 해부경혈학교실) , 김연섭 (경원대학교 한의과대학 해부경혈학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

In Oriental medicine daeseungki-tang is one of the prescription that is used clinically for constipation of paralytics. The objective of the study was to observe the effect of daeseungki-tang on apoptotic neuronal cell death. In the present study, middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats were treated with daeseungi-tang for 5 days and the edema percentage of cerebral hemisphere of MCAO rats were investigated primary. Secondary, appearances of Bax, Bcl-2,-factors that is related to apoptotic neuronal cell death - and HSP72 in the brain of MCAO rats were investigated via immunohistochemistry. Daeseungki-tang significantly decreased edema percentage of the cerebral hemisphere of MCAO rats. Daeseungki-tang significantly decreased Bax positive cells, but did not change the apperances of Bcl-2 positive cells in the penumbra of the cerebral cortex and the caudoputamen of MCAO rats. Daeseungki-tang significantly decreased HSP72 positive cells in the penumbra of the cerebral cortex, but not in the caudoputamen of MCAO rats. Based on the present results, it can be suggested that treatment with daeseungki-tang may decrease edema of the cerebral hemisphere and restrain apoptotic neuronal cell death in the penumbra of the cerebral cortex.

주제어

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문제 정의

본 연구에서는 이러한 大承氣湯이 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 뇌 허혈 손상에서 나타나는 뇌부종과 신경세포의 자연사에 어떠한 효능을 나타내는지를 관찰하였다. 흰쥐에 중대뇌동맥을 일시적으로 폐쇄하여 뇌경색을 유발한 다음 5일간 大承氣湯을 경구투여하고 뇌조직의 부종을 측정하였으며, 뇌신경세포의 자연사에 관련된 인자인 Bax 와 Bcl-2 및 HSP72의 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한바 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.
이에 비하여 중대뇌동맥 폐쇄 후 大承氣湯을 투여한 sample 군은 뇌부종 비율이 약 120%로 감소하여 controle 비하여 유의한 뇌부종의 감소 효능을 나타내었다. 이러한 결과는 大承氣湯의 사하작용이 뇌조직의 수분이동 및 BBB 손상에 유의한 효능을 갖는다는 것을 추측하게 한다.
효능을 나타내는지를 관찰하였다. 흰쥐에 중대뇌동맥을 일시적으로 폐쇄하여 뇌경색을 유발한 다음 5일간 大承氣湯을 경구투여하고 뇌조직의 부종을 측정하였으며, 뇌신경세포의 자연사에 관련된 인자인 Bax 와 Bcl-2 및 HSP72의 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한바 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.

제안 방법

면역조직화학적으로 염색된 Bax, Bcl-2 및 HSP72 발현의 변화를 정량적으로 관찰하기 위하여, 면역조직화학적으로 염색된 뇌 조직의 영상을 CCD 카메라를 통하여 영상분석시스템에 저장하고 “NIH Image J" software 를 사용하여, 뇌경색이 유발된 대뇌반구 쪽 대뇌피질의 뇌경색 경계부위 (cortex penumbra) 와 선조체 (caudoputamen) 에서 동일한 일정면적 내에서 양성반응 신경세포 수를 측정하고 100,000 m2 당 세포 수를 계산하였다.
투여 5일 후에 각각 실험동물을 희생시켜 관련 지표들을 관찰하였으며, 각 군 당 실험동물은 8마리씩 배정하였다.
大承氣湯이 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 뇌허혈 손상에서 나타나는 뇌부종과 신경세포의 자연사에 어떠한 효능을 나타내는지를 관찰하기 위해서 흰쥐에 중대뇌동맥을 일시적으로 폐쇄하여 뇌경색을 유발한 다음 5일간 大承氣湯을 경구투여하고 뇌 조직의 부종을 측정하였으며, 뇌신경세포의 자연사에 관련된 인자인 Bax 와 Bcl-2 및 HSP72의 발현을 면역조직화학 염색을 통하여 관찰한 바 아래와 같은 결과들을 얻었다.
국소뇌허혈은 총경동맥으로 나일론 수술실을 삽입하여 중대뇌동맥의 기시부를 폐쇄하는 방법을 사용하였다. 마취는 70% N₂O 와 30% O₂ 의 혼합가스에 5% isoflurane 으로 마취를 시작하여 수술 도중에는 1.
그러므로 일차적으로 大承氣湯이 뇌부종에 어떠한 효능이 있는가를 실험적으로 관찰하였다. 실험 결과, 중대뇌동맥을 폐쇄하지 않은 sham 군은 좌우 대뇌반구가 면적에서 큰 차이가 없었으나, 중뇌동맥을 폐쇄한 contr이군은 손상측 대뇌반구가 정상 측 대뇌반구에 비하여 약 136%의 심한 뇌부종이 발생하였다.
뇌 조직 절편을 digital camera로 촬영, 저장한 다음 “NIH Image J” software 를 사용하여 각각의 뇌 절편으로부터 정중선을 기준으로 손상측과 정상측의 대뇌반구 면적을 측정하고, 정상측 대뇌반구 면적에 대한 손상측 대뇌반구의 면적비율로 계산하였다.18)
이후 조직을 PBS 로 씻어내고, abidin-biotin immuno-peroxidase 의 방법 (ABC Vectastain Kit) 에 따라 각각 한 시간씩 반응시 켰다. 다음 diaminobenzidine tetrachloride(Sigma, USA) 에서 5-10 분간 발색 반응시키고, 조직을 poly-L-lysine 코팅된 슬라이드에 붙인 후 그3시간 건조시킨다음 탈수, 봉합하여 조직표본을 제작하였다.
실험군은 뇌허혈을 유발하기 위한 준비수술과정은 시행하였으나 중대뇌동맥을 폐쇄시키지 않은 정상대조군(Sham), 일시적인 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 국소뇌허혈 손상을 유발시킨 대조군 (Control) 및 대조군과 동일한 상태에서 大承氣湯 물추출엑기스를 5일간 경구투여한 大承氣湯투여군 (Sample) 으로 나누었다. 大承氣湯 투여 5일 후에 각각 실험동물을 희생시켜 관련 지표들을 관찰하였으며, 각 군 당 실험동물은 8마리씩 배정하였다.
실험동물을 pentobarbital sodium 복강주사로 깊게 마취한 다음 개흉하고 심 장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline(PBS) 과 4% paraformaldehyde 로 중분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation 하고, sucrose 용액에 담가 침전시켰다.
실험동물을 pentobarbital sodium 복강주사로 깊게 마취한 다음 단두로 희생시키고, 즉시 뇌를 적출하여 흰쥐용 brain matrix(ASI, USA) 를 사용하여 2 mm 두께의 뇌조직 절편으로 만들었다. 뇌 조직 절편을 digital camera로 촬영, 저장한 다음 “NIH Image J” software 를 사용하여 각각의 뇌 절편으로부터 정중선을 기준으로 손상측과 정상측의 대뇌반구 면적을 측정하고, 정상측 대뇌반구 면적에 대한 손상측 대뇌반구의 면적비율로 계산하였다.
실험동물의 1회 투여량은 흰쥐 체중 100 g 당 체중비례 계산량의 5배인 120 mg으로 하였다. 약물투여는 뇌경색 유발 3시간 전 1회 및 뇌경색 유발 후 1일 1회 5일간 경구투여 하였다.
전경부의 피부를 절개하고 총경동맥과 외경동맥 및 내경동맥의 분지 부위를 찾아 주위조직을 잘 정리하였다. 외경동맥에 나일론 수술실을 삽입할 수 있도록 입구를 만들고 절단한 다음, 총경동맥의 혈류를 일시적으로 차단한 상태에서, 약 4 cm 길이의 나일론 수술실 (4-0 monofilament, Ethicon, Edinburgh, Scotland) 을 내경동맥을 통하여 약 20 mm 까지 천천히 삽입하여 중대뇌동맥의 기시부가 폐쇄되도록 하였다. 나일론 수술실의 삽입부 끝은 약 0.
이차적으로 뇌신경세포의 자연사에 관련된 인자인 Bax 와 Bcl-2 및 HSP72의 발현을 면역조직화학 염색을 통하여 관찰하였다. Bax 는 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)와 함께 세포자연사를 조절하는 인자이다.
5C 로 조절하였다. 전경부의 피부를 절개하고 총경동맥과 외경동맥 및 내경동맥의 분지 부위를 찾아 주위조직을 잘 정리하였다. 외경동맥에 나일론 수술실을 삽입할 수 있도록 입구를 만들고 절단한 다음, 총경동맥의 혈류를 일시적으로 차단한 상태에서, 약 4 cm 길이의 나일론 수술실 (4-0 monofilament, Ethicon, Edinburgh, Scotland) 을 내경동맥을 통하여 약 20 mm 까지 천천히 삽입하여 중대뇌동맥의 기시부가 폐쇄되도록 하였다.

대상 데이터

다음 뇌를 -40C 의 dry ice-isophentan 용액으로 동결시키고 조직절편을 제작할 때까지는 -80C 에 보관하였다. 뇌조직은 cryocut으로 50 ㎛ 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
본 실험에 사용한 약물은 大承氣湯 (Daeseungki-tang, DSK) 으로 처방의 내용은 아래와 같다. 약물의 조제는 일반적인 물추출엑기스 제조방법에 의하여, 10첩 분량 200 g 을 3, 000 ml 의 물과 함께 냉각기가 장착된 전탕기에서 2시간동안 전탕한 다음 여과하고 rotary evaporator 로 감압 농축 후 동결건조하여 1첩 분량 당 14.
실험동물은 바이오지노믹스(주)에서 구입한 10주령, 약 250 g 전후의 Sprague-Dawley 계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 흰쥐는 온도(21~23℃), 습도(40~60%), 조명(12시간 명/암)이 자동 적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료가 자유롭게 공급되었으며, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.

성능/효과

가지 원인에 의하여 유발되는 아주 중요한 합병증이다.28) 뇌부종의 진행은 두개강 내압을 증가시켜 뇌를 압박하게 되고, 뇌 조직에 혈액 및 산소공급에 장애를 일으키고, 뇌조직을 연화시킴으로써 결과적으로 뇌의 압박에 의한 사망이나 뇌신경세포의 사망을 유발하게 된다.29, 30) 이러한 뇌부종 발생의 기전에는 뇌혈관 장벽 (blood-brain barrier, BBB) 의 손상에 의한 혈관과 뇌조직 사이의 수분이동 장애가 가장 큰 원인이다.
실험적으로 관찰하였다. 실험 결과, 중대뇌동맥을 폐쇄하지 않은 sham 군은 좌우 대뇌반구가 면적에서 큰 차이가 없었으나, 중뇌동맥을 폐쇄한 contr이군은 손상측 대뇌반구가 정상 측 대뇌반구에 비하여 약 136%의 심한 뇌부종이 발생하였다. 이에 비하여 중대뇌동맥 폐쇄 후 大承氣湯을 투여한 sample 군은 뇌부종 비율이 약 120%로 감소하여 controle 비하여 유의한 뇌부종의 감소 효능을 나타내었다.
이상의 결과를 보아, 大承氣湯은 뇌부종을 감소시키고 대뇌피질 뇌경색 경계영역에서 신경세포 자연사를 억제하는 작용이 있는 것으로 판단된다.
4-3, arrow heads). 이에 비하여 중대뇌동맥 폐쇄 후 大承氣湯을 투여한 sample 군에서는 대뇌피질의 뇌경색 경계부위에서 38.1±6.7개의 Bax 양성반응 신경세포가 관찰되어 contr이군에 비하여 유의성 (P<0.05) 있는 감소를 나타내었으며, 세포형태가 위축된 Bax 양성반응 신경세포 (Fig. 4, 5, arrow heads) 와 함께 비교적 정상적인 형태를 유지하는 Bax 발현이 미약한 신경세포(Fig. 4, 5, arrows) 도 다수 관찰되었다. 선조체에서는 24.
35) 본 연구에서는 대뇌피질 뇌경색의 경계부위 (penumbra) 와 선조체 (caudoputamen)에서 Bax 양성반응을 나타낸 신경세포 수를 측정한 바, 중대뇌동맥을 폐쇄한 contr 이 군은 대뇌피질의 뇌경색 경계부위와 선조체에서 강한 Bax 양성반응 신경세포들이 현저히 증가하였으며, Bax 에 강한 양성반응을 나타낸 신경세포들은 모두 그 형태가 위축되어 있는 양상을 나타내었다. 이에 비하여 중대뇌동맥 폐쇄 후 大承氣湯을 투여한 sample 군에서는 대뇌피질의 뇌경색 경계부위와 선조체 모두에서 contr이군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었으며, 세포 형태가 위축된 Bax 양성반응 신경세포와 함께 비교적 정상적인 형태를 유지하는 Bax 발현이 미약한 신경세포도 다수 관찰되었다. 그러나 大承氣湯 투여는 대뇌피질의 뇌경색 경계부위와 선조체 모두에서 Bcl-2 발현에는 유의한 영향을 미치지 못하였다.

후속연구

본 연구의 결과들을 총괄적으로 살펴보면, 大承氣湯은 중대뇌동맥 폐쇄에 따른 뇌부종 형성을 억제하며, 신경세포의 자연사를 억제하고 뇌경색 손상의 확대를 억제하는 효능이 있을 것으로 생각된다. 이러한 결과들은 大承氣湯의 사하작용이 뇌경색에 유의하게 작용할 수 있음을 추측하게 하는 매우 기초적인 자료이며, 보다 더 구체적인 실험연구를 수행할 기본 자료가 된다고 생각한다.
생각된다. 이러한 결과들은 大承氣湯의 사하작용이 뇌경색에 유의하게 작용할 수 있음을 추측하게 하는 매우 기초적인 자료이며, 보다 더 구체적인 실험연구를 수행할 기본 자료가 된다고 생각한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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