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문제 정의
- 또한 ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides (EBIFs) 에의한 rat의 간독성모델에서 1A1/2 및 3A isoenzyme의 발현이 증가한다는 보고가 있었다31). 따라서 본 연구에서는 산수유추출물이 사염화탄소를 통하여 유발되는 cytochrome P450 isoform 중 간독성모델과 관련있는 것으로 알려진 1A1, 3A1 및 2E1의 발현을 조절하는지 살펴보기 위하여 RT-PCR 과 western blot 을 이용하여 mRNA 및 단백질의 발현정도를 비교하였다. Chang cell 을 통한 세포실험에서도 CYP1A1은 유의성을 확인하지 못했으며 (Fig.
- 이와 같이산수유 열수추출물의 CCl4 로 유도된 간손상에 대한 보호작용을 in vitro 에서 실험한 결과 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.
- 현재까지 발표된 문헌에는 산수유의 간독성 보호작용에 대한 보고가 없지만, 산수유가 補肝腎하는 효능이 있고 補肝하는약물로 분류되었으며 또한 항산화활성 등 여러가지 약리 작용이 보고되고 있어서 간독성에 대한 보호작용을 할 것으로 기대되어본 연구를 진행하게 되었다.
제안 방법
- CCL가 Chang cell의 세포생존에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 96 well plate에 Chang cell을 5x103의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 XTT 방법에 의하여 측정한 결과 Fig. 1과 같은 결과를 얻었다. 처리한 CCZ 의 농도에 비례하여 Chang cell 의 생존율이 감소하였는데, 특히 CCl4 100 mM 의 농도에서 대략 50% 정도의 생존율을 나타내었다.
- 정도를 간접적으로 측정하였다. CCl4와 산수유추출물의 적정 처리농도를 확인하기 위하여, 세포생존율을 XTT Assay로 검사하여 CCl4는 100 mM, 산수유추출물은 100 g/ml의 농도를 적정 처리농도로 확인하였다. 위의 농도로 인간정상간세포주인 Chang cell 에 처리하였을 때, CCZ 만을 처리한 군에서 세포배양액에서의 GOT, GPT 활성치가 정상대조군에 비하여 모두 4-5 배정도 상승하였으나, CCZ 와 산수유추출물을 동시에 처리한 군에서는 정상과 비슷한 활성치를 나타내어 CCl4 투여군에 비하 여유 의성 있는 감소를 나타내었다.
- Collagen coated dish 에서 10% FBS DMEM, 371, 5% CO2 상태에서 70~80% confluence가 되도록 배양한 Chang cell에 serum free DMEM으로 교체한 후, CCl4 및 산수유추출물을 각각 100 mM 및 100 g/ml 씩 처리하여 6시간 이후에 배지를 제거하고 PBS로 washing 한 후 mRNA를 추출하였다. 그 다음 Table 1에서 언급한 human CYP1A1 gene의 sense와 antisense primer 를 이용하여 RT-PCR 을 시행하여 그 산물을 0.
- Collagen coated dish 에서 10% FBS DMEM, 37C, 5% CO2 상태에서 70~80% confluence가 되도록 배양한 Chang cell에 serum free DMEM으로 교체한 후, CCl4 및 산수유추출물을 각각 100 mM 및 100 g/ml씩 처리하여 6시간 이후에 배지를 제거하고 PBS로 washing 한 후 mRNA를 추출하였다. 그 다음 Table 1에서 언급한 human CYP1A1 gene 의 sense 와 antisense primer 를 이용하여 RT-PCR 을 시행하여 그 산물을 0.
- Collagen coated dish 에서 10% FBS DMEM, 37℃, 5% CO2 상태에서 70~80% confluence가 되도록 배양한 Chang cell에 serum free DMEM으로 교체한 후, CCl4 및 산수유추출물을 각각 100 mM 및 100 g/ml 씩 처리하여 6시간 이후에 배지를 분리하여 GOT 및 GPT를 측정하였다(Table 2). 정상대조군은 4.
- Collagen coated dish 에서 10% FBS DMEM, 37℃, 5% CO2 상태에서 70~80% confluence가 되도록 배양한 Chang cell에 serum free DMEM으로 교체한 후, CCl4 및 산수유추출물을 각각 100 mM 및 100 g/ml 씩 처리하여 6시간 이후에 배지를 제거하고 PBS 로 washing 한 후 단백질을 추출하였다. 단백질을 전기영동 하여 nitro-cellulose membrane에 이동시킨 다음, human CYP2E1 에 특이적인 1차 항체와 anti-rabbit IgG를 이용하여 western blot을 시행하여 ECL 방법으로 신호를 검출하여 Fig.
- 1% Tween20 in TBS)를 이용하여 상온에서 1시간 incubation 하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하였다. TBS-T로 10분간 2회 washing 후 anti-CYP2E1 antibody (0.5% BSA added TBS-T 로 1:1000으로 희석하여 사용)를 primary antibody로 하여 4C 에서 overnight inbubation 하여 항원항체 반응을 일으킨 후, TBS-T 로 10분간 2회 washing 하고 2차 항체로 HRP-conjugated anti-rabbit IgG (0.5% BSA added TBS-T 로 1:2000으로 희석하여 사용)로 상온에서 1시간 incubation 한 다음 ECL solution 을 사용하여 암실에서 X-ray film 에 약 3시간 감광시킨 후 develop 하여 단백질의 발현양상을 분석하였다. 또한 CYP2E1의 단백질 발현을 분석한 것과 동일한방법으로 GAPDH 에 대한 western blot 을 시행하여 단백질의 발현을 정량하였다.
- 5 mM dNTP 1 11, LA taq polymerase 1 11 를첨가한 다음 sterile distilled H2O 로 total volume 50 11 가 되도록 PCR tube에서 혼합한 후, 95C에서 5분간 95C에서 1분 간 denaturation 후 68C에서 1분간 annaling시키고, 72C에서 1분 30초 동안 35 cycle 반응시킨 다음 72C 에서 5분 동안 elongation 한다. 각각의 PCR product는 10 1 씩 1.2% ETBR stained agarose gel 상에서 loading 하여 전기영동을 시행하여 분석하였다. Cytochrome P450 isoform 각각의 PCR을 위하여 사용된 sense, antisense primer는 아래의 표와 같다(Table 1).
- PBS로 washing 한 후 mRNA를 추출하였다. 그 다음 Table 1에서 언급한 human CYP1A1 gene 의 sense 와 antisense primer 를 이용하여 RT-PCR 을 시행하여 그 산물을 0.5% agarose gel 에서 전기영동하여 Fig. 3의 결과를 얻었다. CC14 를 처리하지 않은 정상 대조군 (Lane 1)보다 CC14 만 처리한 대조군 (Lane 2) 및 산수유추출물을 함께 처리한 군 (Lane 3)에서 CYP1A1의 발현이 증가하지만 유의성은 없었다.
- PBS로 washing 한 후 mRNA를 추출하였다. 그 다음 Table 1에서 언급한 human CYP1A1 gene의 sense와 antisense primer 를 이용하여 RT-PCR 을 시행하여 그 산물을 0.5% agarose gel 에서 전기영동하여 Fig. 4의 결과를 얻었다. CCZ 를 처리하지 않은 정상대조군에서는 CYP2E1의 mRNA 가 거의 발현하지 않고 있으나 (Lane 1), CCl4 만 처리한 대조군에서는 CYP2E1 이 매우 높은 농도로 발현하고 있음을 알 수 있다.
- PBS 로 washing 한 후 단백질을 추출하였다. 단백질을 전기영동 하여 nitro-cellulose membrane에 이동시킨 다음, human CYP2E1 에 특이적인 1차 항체와 anti-rabbit IgG를 이용하여 western blot을 시행하여 ECL 방법으로 신호를 검출하여 Fig. 5 의 결과를 얻었다. CCl4 를 처리하지 않은 정상대조군에서 비하여 CCl4 만 처리한 대조군에서 CYP2E1 단백질이 낮은 농도로 발현이 증가하고 있음을 알 수 있으며 (Lane 1, 2), CC» 와 함께 산수유추출물을 처리한 군에서는 CYP2E1의 발현이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있다.
- 따라서 산수유 추출물이 CCl4 로 유도된 실험적 간손상에 있어서 간보호활성을 가짐을 확인할 수 있었으며, 그 기전을 확인하기 위하여 in vitro에서 CCl4를 CCb-로 전환하는 효소인 cytochrome P450의 발현조절에 대하여 실험하였다.
- 5% BSA added TBS-T 로 1:2000으로 희석하여 사용)로 상온에서 1시간 incubation 한 다음 ECL solution 을 사용하여 암실에서 X-ray film 에 약 3시간 감광시킨 후 develop 하여 단백질의 발현양상을 분석하였다. 또한 CYP2E1의 단백질 발현을 분석한 것과 동일한방법으로 GAPDH 에 대한 western blot 을 시행하여 단백질의 발현을 정량하였다.
- 배양된 세포에 serum free DMEM 으로 교체한 후, contr이군과 CCl4 (100 mM) 처리군, CCl4 (100 mM)와 산수유 100 g/ml 처리군으로 하여 농도별로 처리하여 6시간 동안 배양한다. 6시간이 지난 후 배지는 따로 분리하여 1000 rpm 으로 5분간 원심분리하여 cell debris 를 제거한 후 -70C 에 보관하였다가 이후의 실험에 사용하였다.
- cDNA 합성은 RNA PCR kit (AMV) 를 사용하였다. 본 실험에서는 Total RNA 1 g/ l를 주형으로 사용하였으며, MgCL (2.5 mM), 10xRNA PCR buffer, RNase free distilled H2O, dNTP (10 mM), AMV reverse transcriptioase XL, Oligo dT (2.5 pmol/ l)가 되 게 넣고 total volume을 20 11가 되 게 해 서 혼합한 후 RT 반응을 수행하였다. 즉 30C 에서 10분간 반응시키고 42 C 에서 30분간 annaling 시켜 신장할 수 있도록 만들어 주고 99 C 에서 5분, 5C에서 5분간 1 cycle을 실시한다.
- 본 연구에서는 이러한 효소활성을 in vitro 에서 실험하여 간 손상의 정도를 간접적으로 측정하였다. CCl4와 산수유추출물의 적정 처리농도를 확인하기 위하여, 세포생존율을 XTT Assay로 검사하여 CCl4는 100 mM, 산수유추출물은 100 g/ml의 농도를 적정 처리농도로 확인하였다.
- 냉동보관한 단백질을 얼음위에서 녹여 20 g이 되도록 계산하여 loading한 후 10% SDS-PAGE 로 전기영동하여 분리시켰다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane으로 electroblotting에 의해 transfer 시킨 후, 5% skim milk를 함유한 TBS-T (0.1% Tween20 in TBS)를 이용하여 상온에서 1시간 incubation 하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하였다. TBS-T로 10분간 2회 washing 후 anti-CYP2E1 antibody (0.
- 사염화탄소 (CC14)로 유발된 간손상 모델을 통하여 산수유의 간 보호 활성 및 사염화탄소의 활성화에 관여하는 효소인 cytochrome P450의 발현조절에 대하여 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻게 되었다. Human normal hepatocyte 인 Chang cell 을이 용한 in vitro 실험에서는 CCI4 100 mM 및 산수유추출물 100 g/ml의 농도에서 6시간 배양하였을 때, GOT와 GPT가 모두 CCl4 만 처리한 군에 비하여 산수유추출물을 동시에 처리한 군에서 유의한 감소를 나타내었다.
- 산수유추출물이 Chang cell 의 세포생존에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 96 well plate 에 Chang cell 을 5×103의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 XTT 방법에 의하여 측정한 결과 Fig. 2와 같은 결과를 얻었다. 처리한 산수유주줄물의 농도에 비례하여 Chang cell의 생존율이 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었으며, 특히 CC14 100 g/ml의 농도에서도 60% 이상의 생존율을 나타내었다.
- 이와 같이 산수유는 補肝腎하는 효능이 있을 것으로 생각되어 본 연구에서는 인간 정상 간세포주인 Chang cell을 이용하여 GOT, GPT 및 cytochrome P450의 발현을 검사하였다. 이와 같이산수유 열수추출물의 CCl4 로 유도된 간손상에 대한 보호작용을 in vitro 에서 실험한 결과 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.
대상 데이터
- In vitro 실험에 사용된 세포주는 normal liver hepatocyte cell line인 Chang cell (ATCC CCL-13)을 사용하였다. Chang celle DMEM 배지에 10% FBS, penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 i g/ml)과 sodium bicarbonate (3.
- cDNA 합성은 RNA PCR kit (AMV) 를 사용하였다. 본 실험에서는 Total RNA 1 g/ l를 주형으로 사용하였으며, MgCL (2.
- 실험에 사용된 산수유는 경북 경주지방에서 재배한 것으로, 성심한약재(경북 경주)에서 구입하여 동국대학교 본초학 교실에서 검증한 후 정선하여 사용하였다. 산수유 300 g에 증류수 1.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계적인 분석은 SAS (The SAS System for Windows, version 6.12, SAS Institute, U.S.A.) 을 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군간의 유의성을 검증할 때에는 Student's t-test로 p-값이 0.
- ) 을 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군간의 유의성을 검증할 때에는 Student's t-test로 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- GOT 및 GPT 활성측정은 Reitman-Frankel 의 방법13)에 따라 조제된 시약 Kit(아산제약)를 사용하여 측정하였다. GOT, GPT 기질액 1.
- 실험에 사용하였다. 단백질의 정량은 앞에서 언급한 바와 같이 Bradeford의 방법에 따라 시행하였다. 냉동보관한 단백질을 얼음위에서 녹여 20 g이 되도록 계산하여 loading한 후 10% SDS-PAGE 로 전기영동하여 분리시켰다.
성능/효과
- CCZ 를 처리하지 않은 정상대조군에서는 CYP2E1의 mRNA 가 거의 발현하지 않고 있으나 (Lane 1), CCl4 만 처리한 대조군에서는 CYP2E1 이 매우 높은 농도로 발현하고 있음을 알 수 있다. (Lane 2) 또한 CCZ 와 함께 산수유추출물을 처리한 군에서는 CYP2E1의 발현이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있다. (Lane 3) 이것으로 보아 rat liver 에서와 마찬가지로 human normal hepatocyte 인 Chang cell 에서도 CYP2E1은 CCl4에 의하여 발현량이 매우 증가하며, 산수유추출물에 의해서 발현이 억제되는 것을 알 수 있다.
- (Lane 2) 또한 CCZ 와 함께 산수유추출물을 처리한 군에서는 CYP2E1의 발현이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있다. (Lane 3) 이것으로 보아 rat liver 에서와 마찬가지로 human normal hepatocyte 인 Chang cell 에서도 CYP2E1은 CCl4에 의하여 발현량이 매우 증가하며, 산수유추출물에 의해서 발현이 억제되는 것을 알 수 있다. 6
- 5 의 결과를 얻었다. CCl4 를 처리하지 않은 정상대조군에서 비하여 CCl4 만 처리한 대조군에서 CYP2E1 단백질이 낮은 농도로 발현이 증가하고 있음을 알 수 있으며 (Lane 1, 2), CC» 와 함께 산수유추출물을 처리한 군에서는 CYP2E1의 발현이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있다. (Lane 3).
- 따라서 본 연구에서는 산수유추출물이 사염화탄소를 통하여 유발되는 cytochrome P450 isoform 중 간독성모델과 관련있는 것으로 알려진 1A1, 3A1 및 2E1의 발현을 조절하는지 살펴보기 위하여 RT-PCR 과 western blot 을 이용하여 mRNA 및 단백질의 발현정도를 비교하였다. Chang cell 을 통한 세포실험에서도 CYP1A1은 유의성을 확인하지 못했으며 (Fig. 3), 2E1 isoform 은 mRNA 및 단백질 수준에서 모두 CCZ 에 의하여 발현이 증가하였고 산수유추출물에 의하여 발현이 감소함을 알 수 있었다(Fig. 4-5). 이러한 결과는 Wong 등32)이 CYP2E1 유전자를 결실시킨 생쥐에는 사염화탄소를 투여하여 도정 상대 조 군과는 달리 GOT, GPT 수치가 증가하지 않으며 간 손상이 발생하지 않음을 보고한 것과 일치하는 것으로 CCl4 를 통하여 유도된 간손상모델에서는 cytochrome P450 isoform 중에서 2E1 이 핵심적인 역할을 하는 것을 알 수 있으며, 산수유추출물이 2E1 의 발현을 억제함으로써 간보호작용을 나타내는 것으로 생각할 수 있다.
- 처리한 산수유주줄물의 농도에 비례하여 Chang cell의 생존율이 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었으며, 특히 CC14 100 g/ml의 농도에서도 60% 이상의 생존율을 나타내었다. 따라서 산수유추출물 자체에 의한 Chang cell의 세포독성은 매우 약함을 알 수 있으며, 이후의 실험에서는 100 g/ml 의 농도를 기준으로 사용하였다.
- Human normal hepatocyte 인 Chang cell 을이 용한 in vitro 실험에서는 CCI4 100 mM 및 산수유추출물 100 g/ml의 농도에서 6시간 배양하였을 때, GOT와 GPT가 모두 CCl4 만 처리한 군에 비하여 산수유추출물을 동시에 처리한 군에서 유의한 감소를 나타내었다. 또한 cytochrome P450 isoform 중에서 1A1은 영향이 없으며, 2E1의 발현이 CCl4만 처리한 군에 비하여 산수유추출물을 함께 처리한 군에서 현저히 감소함을 알 수 있었다.
- CCl4와 산수유추출물의 적정 처리농도를 확인하기 위하여, 세포생존율을 XTT Assay로 검사하여 CCl4는 100 mM, 산수유추출물은 100 g/ml의 농도를 적정 처리농도로 확인하였다. 위의 농도로 인간정상간세포주인 Chang cell 에 처리하였을 때, CCZ 만을 처리한 군에서 세포배양액에서의 GOT, GPT 활성치가 정상대조군에 비하여 모두 4-5 배정도 상승하였으나, CCZ 와 산수유추출물을 동시에 처리한 군에서는 정상과 비슷한 활성치를 나타내어 CCl4 투여군에 비하 여유 의성 있는 감소를 나타내었다.
- 이상의 결과에서 산수유는 CCl4 로 유발된 간손상에 대하여 보호 활성이 있음을 in vitro에서 확인할 수 있었으며, 그 기전은 간 조직 내 항산화계의 활성화 및 CYP2E1의 발현억제에 의한 것으로 생각된다.
- 이상의 결과에서 산수유는 CCl4 로 유발된 실험적 간손상 모델에서 in vivo 및 in vitro 에서 간보호활성을 가지고 있음을 확인하였으며, 그 기전으로는 간세포 내 항산화계 활성증가와 CCl4 의 biotransformation에 관여하는 cytochrome P450 특히 2E1 isoform 의 발현조절과 관련된 것임을 시사한다.
- 1과 같은 결과를 얻었다. 처리한 CCZ 의 농도에 비례하여 Chang cell 의 생존율이 감소하였는데, 특히 CCl4 100 mM 의 농도에서 대략 50% 정도의 생존율을 나타내었다. 따라서 CCl4에 의한 Chang cell 의 세포 손상을 유발함에 있어서 100 mM의 농도를 기준으로 사용하였다.
- 2와 같은 결과를 얻었다. 처리한 산수유주줄물의 농도에 비례하여 Chang cell의 생존율이 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었으며, 특히 CC14 100 g/ml의 농도에서도 60% 이상의 생존율을 나타내었다. 따라서 산수유추출물 자체에 의한 Chang cell의 세포독성은 매우 약함을 알 수 있으며, 이후의 실험에서는 100 g/ml 의 농도를 기준으로 사용하였다.
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