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문제 정의
- 螟蚣의 성기능 개선 효과를 규명하기 위하여 흰쥐의 음경해면체에서 음경 발기에 관련된 인자 및 음경 발기능에 미치는 영향을 검토하였다. 흰쥐에 30일간 ethan이을 음용시켰을 때 음경해면체 조직 중의 nitrite, c-GMP 함량 및 nitric oxide synthase 활성이 현저하게 감소되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 정상 수준으로 회복되었다.
- 螟蚣추출물의 성기능 개선 효능을 직접적으로 검토하기 위하여 음경해면체 전기 자극에 의한 발기능에 미치는 영향을 검토하였다. 대표적인 NOS 억제제인 L-NAME42)를 흰쥐의 음경해면체 조직 중에 농도별로 주입하고 20분 후에 음경해면체 조직 중의 nitrite 와 c-GMP 함량이 L-NAME 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
- 16). 따라서 저자는 螟蚣이 발기부전에 효과를 나타낼 것으로 기대하고 본 실험을 시도하였다.
- 이에 저자는 螟蚣이 성기능 개선에 효능이 있을 것으로 기대하고 그 효과를 규명하기 위하여 흰쥐에 장기간 ethan이을 음용 시켜 발기부전을 유도하고 음경해면체내의 nitrite, c-GMP 함량 및 음경 발기에 관련된 효소들의 활성에 미치는 영향을 검토하고 전기 자극에 의한 음경 발기능에 미치는 영향을 관찰하여유의성 있는 결과를 얻었으므로 보고하고자 한다.
가설 설정
- for 10 animals. a) Significantly different from normal. b) Significantly different from ethanol-treated group (*:p<0.
제안 방법
- 효소 반응 후 생성된 c-GMP의 양을 측정하기 위하여 중성 aluminium oxide column chromatography를 실시하였다. Column에 반응액을 넣은 후 0.05 M Tris HCl buffer (pH 7.4) 5 ml를 가하여 관류시키고 column을 통해서 모아진 c-GMP 함유 관류액을 다시 dowex 1-X2 column 을 통해서 0.05 N formic acid 용액과 4 N formic acid 함유 0.2 M ammonium formate 용액으로 관류시켜서 관류액을 모은 다음 이것을 이용하여 방사능을 측정하여 함량을 산정하였다. 방사능 측정은 lipuid scintillation spectrometer (Beckman, LS-233)를 이용하였다.
- Ether 를 이용하여 흡인 마취시킨 실험동물을 예리한 가위로 하복부를 절개하여 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하고 음경해면체를 적출하였다. 적출한 음경해면체를 생리식염수로 깨끗하게 세척한 후, 남아 있는 이물질 및 혈액을 여지로 제거하였다.
- Griess 시액은 1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylene diamine 및 2.5% 인산을 혼합하여 제조하였으며, 효소원 200ul에 동량의 griess 시액을 실온에서 10분간 반응 시켜 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Nitrite 양의 측정은 sodium nitrite 를 이용한 표준 곡선을 이용하여 산출하였고, 흰쥐 조직 g 당 nitrite의 양을 mole로 환산하여 나타내었다.
- Guanylate cyclase 활성 및 c-GMP 함량은 Nakazawa 등의 방법 31)을 약간 변경하여 측정하였다. 효소 활성 측정은 표준 반응액 중에 60 nmole [3H]GTP (0.
- 그 후 해면체 내압이 기저치로 떨어지고 15분 후에 동일 강도의 전기 자극을 가하여 발기능을 측정하였다. L-NAME를 이용한 음경 발기능의 측정은 해면체 내압이 기저치로 떨어진 다음 10 분 경과 후에 L-NAME 를 농도별로 해면체내에 주입하였으며, 15분 후에 같은 강도의 전기자극으로 음경 발기를 일으켜 약물농도에 따른 음경 발기능을 관찰하였다.
- 5% 인산을 혼합하여 제조하였으며, 효소원 200ul에 동량의 griess 시액을 실온에서 10분간 반응 시켜 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Nitrite 양의 측정은 sodium nitrite 를 이용한 표준 곡선을 이용하여 산출하였고, 흰쥐 조직 g 당 nitrite의 양을 mole로 환산하여 나타내었다.
- 일으켰다. 그 후 해면체 내압이 기저치로 떨어지고 15분 후에 동일 강도의 전기 자극을 가하여 발기능을 측정하였다. L-NAME를 이용한 음경 발기능의 측정은 해면체 내압이 기저치로 떨어진 다음 10 분 경과 후에 L-NAME 를 농도별로 해면체내에 주입하였으며, 15분 후에 같은 강도의 전기자극으로 음경 발기를 일으켜 약물농도에 따른 음경 발기능을 관찰하였다.
- 배정하였다. 대조군과 실험군은 25% ethanol 용액을 물 대신 30일 동안 섭취시켜 인위적으로 만성 알코올 중독에 의한 발기부전을 유도하였으며, 정상군은 동량의 물을 섭취케 하였다. 실험군은 흰쥐의 체중 kg 당 50 mg 의 螟蚣추출물을 ethanol 투여개시일부터 1일 1회 30일간 경구 투여하였으며, 대조군은 동량의 0.
- 25 ml 을 가하여 반응을 종료시켰다. 반응종료액을 원심분리하여 상징액을 취한 다음 흡광광도계를 이용하여 파장 400 nm 에서 흡광도의 변화를 읽고 표준 검량선에 준하여 효소의 활성도를 산정하였다. 효소 활성도는 1분당 1 mg 의 단백질이 생성시킨 p-nitrophen이의 량을 nmole 로 나타내었다.
- 골반신경 및 음경해면체 신경을 박리하였다. 신경자극을 위하여 백금전극을 음경해면체 신경에 설치하여 전기자극기 (SEN-7103, Nihon Kohden, Japan)와 연결하였다. 또한 음경 포피를 절개하여 음경해면체를 노출시킨 후 해면체 내압을 측정하기 위하여 26 G 주사바늘을 일측 음경해면체 내에 유치하였다.
- 대조군과 실험군은 25% ethanol 용액을 물 대신 30일 동안 섭취시켜 인위적으로 만성 알코올 중독에 의한 발기부전을 유도하였으며, 정상군은 동량의 물을 섭취케 하였다. 실험군은 흰쥐의 체중 kg 당 50 mg 의 螟蚣추출물을 ethanol 투여개시일부터 1일 1회 30일간 경구 투여하였으며, 대조군은 동량의 0.5% carboxymethylcellulose 용액을 투여하였다.
- 실험동물을 해면체신경 절제 실험과 같은 방법2이을 이용하여 골반신경 및 음경해면체 신경을 박리하였다. 신경자극을 위하여 백금전극을 음경해면체 신경에 설치하여 전기자극기 (SEN-7103, Nihon Kohden, Japan)와 연결하였다.
- 실험동물의 조직 효소원에 50 mM Hepes (pH 7.4) 용액과 L-arginine, NADPH, EDTA, CaCL, dithiothreitol, calmodulin 및 NBT 를 가하여, 37°C 에서 5 분간 반응시켜 585 nm 에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효소의 활성도는 파장 585 nm 에서 측정한 흡광도 수치에 사용한 단백질의 함량을 나눈 값으로 산정하였다.
- 또한 음경 포피를 절개하여 음경해면체를 노출시킨 후 해면체 내압을 측정하기 위하여 26 G 주사바늘을 일측 음경해면체 내에 유치하였다. 압력측정용 침은 silicon관, Sorenson transpac (Abbot critical care system, USA) 을 통해 차등증폭기 (DA 100, Biopac system, USA), Data Acquisition (MP 100, Biopac system, USA)으로 연결하였고, 측정치들은 Data Analysis program (Acqknowledge 1.5.5 program, Biopac system, USA) 및 Mackintosh IIsi Computer 을 이용하여 기록 분석하였다. 압력 전달관의 혈액 응고 방지를 위해 heparinized saline (5,000 IU/ml) 으로 간헐적인 관류를 시행하였다.
- 음경 발기능 관찰은 동물마다 정상 음경발기의 기준을 정하기 위하여 해면체 신경자극 (frequency : 1 Hz, intensity : 3-5 V, pulse duration : 1 msec) 을 1분간 가하여 음경 발기를 일으켰다. 그 후 해면체 내압이 기저치로 떨어지고 15분 후에 동일 강도의 전기 자극을 가하여 발기능을 측정하였다.
- 반응 후 반응을 종료시키기 위하여 끓는 물에서 2분간 가열하고 찬물에 식혔다. 효소 반응 후 생성된 c-GMP의 양을 측정하기 위하여 중성 aluminium oxide column chromatography를 실시하였다. Column에 반응액을 넣은 후 0.
- 방사능 측정은 lipuid scintillation spectrometer (Beckman, LS-233)를 이용하였다. 효소 활성은 [3H] GTP으로부터 nonradioactive form 의 c-GMP로 trap 된 radioactivity 를 측정하여 활성을 산정하였으며 cpm 으로 나타내었다. 한편 음경해면체 조직중의 c-GMP 농도 측정시에는 상기 방법으로 실험을 행한 다음 함량 단위를 c-GMP pmoles/mg protein/min 으로 환산하여 나타내었다.
- 4) 용액과 L-arginine, NADPH, EDTA, CaCL, dithiothreitol, calmodulin 및 NBT 를 가하여, 37°C 에서 5 분간 반응시켜 585 nm 에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효소의 활성도는 파장 585 nm 에서 측정한 흡광도 수치에 사용한 단백질의 함량을 나눈 값으로 산정하였다.
- 흰쥐를 정상군, 발기부전을 유도한 대조군, 발기부전을 유도한 후 螟蚣추출물을 투여한 실험군으로 나누었으며, 각 군당 10 마리씩 배정하였다. 대조군과 실험군은 25% ethanol 용액을 물 대신 30일 동안 섭취시켜 인위적으로 만성 알코올 중독에 의한 발기부전을 유도하였으며, 정상군은 동량의 물을 섭취케 하였다.
- 흰쥐의 음경 발기능 기준을 정상화시키는 전처치를 시행한 후 L-NAME 을 농도별로 음경해면체내에 주입 후 20분 정도 경과한 다음 음경해면체 조직을 적출하여 nitrite 함량을 관찰하였다.
대상 데이터
- Cyclic GMP, [3H]GTP는 Radiochemical center사의 제품을, guanosine, bovine serum albumin, calmodulin, dithiothreitol, ethylene diamine tetra sodium salt, L-N-Nitroarginine methyl ester (L-NAME), L-arginine, naphtylethylene diamine, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form, nitroblue tetrazolium, sodium citrate, sulfanilamide, sodium nitrite, thiobarbituric acid sodium salt 는 Sigma 사의 제품을 사용하였으며, potassium phosphate mono and dibasic 및 2-mercaptoethanole Wako사의 제품을, neutral ammonium oxide는 Woelm사의 제품을, kieselgel G는 Merck사의 제품을, 5, 5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), trichloroacetic acid 는 Nakarai 사의 제품을 사용하였다. 그 외 본 실험에 사용한 시약은 시중에서 구입한 특급품 내지 일급품을 사용하였다.
- 螟蚣을 시중 (태원당약업사, 대구, 한국)에서 구입하고 정선하여 사용하였다.
- 사의 제품을 사용하였다. 그 외 본 실험에 사용한 시약은 시중에서 구입한 특급품 내지 일급품을 사용하였다.
-
3) 동물
동국대학교 한의과대학 동물사에서 동일 조건하에 사육된 외관상 건강한 체중 200 g 내외의 웅성 Spra잉ue-Dawley 계 흰쥐 (오리엔트, 대구, 한국)를 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성 검정은 Student's t-test 를 이용하여 행하였으며, p value 가 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Nitric oxide synthase 활성 측정은 비색법 (colorimetric assay)으로 NADPH diaphorase 활성도 측정법을 이용하였다 30). 실험동물의 조직 효소원에 50 mM Hepes (pH 7.
- Nitrite (NO2') 함량은 비색법으로 Griess reaction에 준하여측정하였다3히. Griess 시액은 1% sulfanilamide, 0.
- Phosphodiesterase 활성은 Razzell의 방법32)에 준하여 측정하였다. 0.
- 단백질의 정량은 Lowry 등의 방법쾌에 준해 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 행하였다.
- 2 M ammonium formate 용액으로 관류시켜서 관류액을 모은 다음 이것을 이용하여 방사능을 측정하여 함량을 산정하였다. 방사능 측정은 lipuid scintillation spectrometer (Beckman, LS-233)를 이용하였다. 효소 활성은 [3H] GTP으로부터 nonradioactive form 의 c-GMP로 trap 된 radioactivity 를 측정하여 활성을 산정하였으며 cpm 으로 나타내었다.
성능/효과
- 대표적인 NOS 억제제인 L-NAME42)를 흰쥐의 음경해면체 조직 중에 농도별로 주입하고 20분 후에 음경해면체 조직 중의 nitrite 와 c-GMP 함량이 L-NAME 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 또한 L-NAME 주입에 의해 음경 해면체 내압이 현저하게 감소되었으나 螟蚣추출물을 30일 동안 투여한 경우에 유의성 있게 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
- 006 pmoles/mg 이었다. 동일 조건에 L-NAME 농도를 달리하면서 주입한 후 c-GMP 함량을 관찰하였을 때 10-7 M 인 경우 0.119±0.006 pmoles/mg, 10-6 M인 경우는 0.117±0.007 pmoles/mg, 10-5 M 인 경우는 0.110±0.005 pmoles/mg 으로 음경 해면 체내로 주입량이 많아질수록 c-GMP 함량이 감소되었으며특히 L-NAME 주입량이 10-4 M 되게 하였을 때는 0.086±0.005 pmoles/mg으로 현저하게 감소되었다 (Fig. 7).
- 대표적인 NOS 억제제인 L-NAME42)를 흰쥐의 음경해면체 조직 중에 농도별로 주입하고 20분 후에 음경해면체 조직 중의 nitrite 와 c-GMP 함량이 L-NAME 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 또한 L-NAME 주입에 의해 음경 해면체 내압이 현저하게 감소되었으나 螟蚣추출물을 30일 동안 투여한 경우에 유의성 있게 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 장기간 알코올을 음용시킨 흰쥐에서 음경해면체 내압이 정상군에 비해 현저하게 감소되었으나 螟蚣추출물을 투여한 실험군에서는 유의성 있게 회복되는 것으로 나타났다.
- 흰쥐에 알코올을 30일간 음용시켰을 때 nitrite 함량이 유의성 있게 감소되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 유의성 있게 증가되는 것으로 나타났다. 또한 NO 를 생합성하는 NOS 활성 및 c-GMP 함량을 검토한 실험에서도 알코올 음용에 의해 유의성 있게 감소되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 정상화되는 것으로 나타났다. 이러한 실험결과를 볼 때 螟蚣추출물이 음경조직 중의 NOS 활성을 증가시켜서 혈관 이완인자인 NO의 생합성을 촉진시켜 결과적으로 혈관의 이완작용에 의해서 혈액의 유입량이 증가되어 발기부전을 개선시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 L-NAME 주입에 의해 음경 해면체 내압이 현저하게 감소되었으나 螟蚣추출물을 30일 동안 투여한 경우에 유의성 있게 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 장기간 알코올을 음용시킨 흰쥐에서 음경해면체 내압이 정상군에 비해 현저하게 감소되었으나 螟蚣추출물을 투여한 실험군에서는 유의성 있게 회복되는 것으로 나타났다.
- 음경 발기능이 개선될 수 있을 것이다. 알코올 장기 음용에 의해 phosphodiesterase 활성이 증가되었으나 螟蚣추출물투여로 회복되는 것으로 나타났다. 이 성적으로 보아 螟蚣 성분 중에는 NO 와 c-GMP 의 생합성을 촉진하고 분해 작용을 억제시키는 효소들의 활성을 조절하여 음경발기를 개선시키는 성분이 함유되어 있음을 나타내고 있다.
- 또한 NO 를 생합성하는 NOS 활성 및 c-GMP 함량을 검토한 실험에서도 알코올 음용에 의해 유의성 있게 감소되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 정상화되는 것으로 나타났다. 이러한 실험결과를 볼 때 螟蚣추출물이 음경조직 중의 NOS 활성을 증가시켜서 혈관 이완인자인 NO의 생합성을 촉진시켜 결과적으로 혈관의 이완작용에 의해서 혈액의 유입량이 증가되어 발기부전을 개선시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- Ethan이을 음용시킨 흰쥐에서 음경 발기능이 현저하게 억제되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 유의성 있게 증가되었다. 이상의 결과로 螟蚣은생체내에서 nitric oxide synthase 와 guanylate cyclase 및 phosphodiesterase 활성을 조절하여 nitric oxide 및 c-GMP의 생합성을 증가시켜 발기능을 정상화시킬 것으로 사료된다.
- 이상의 실험 성적들을 종합하여 볼 때 螟蚣추출물은 생체 내에서 NOS와 guanylate cyclase 및 phosphodiesterase 활성을 조절하여 발기 유발인자인 NO 및 c-GMP의 생합성을 증가시키므로 음경 혈관의 이완을 촉진하여 혈액의 유입량이 증가되어음경의 발기능력을 개선시키는 것으로 사료된다.
- 정상군의 c-GMP 함량은 0.120±0.006 pmoles/mg이었으나 대조군의 경우는 0.094±0.004 pmoles/mg으로 정상군에 비하여 약 22% 정도 유의성 있게 감소되었다. 그러나 실험군에서는 0.
- 정상군의 음경해면체 조직 중의 nitrite 함량은 0.64±0.07 moles이었으나 L-NAME 주입량이 10-7 M인 경우 0.60±0.07 moles, 10-6 M 인 경우는 0.57±0.06 moles, 10-5 M인 경우는 0.52±0.06 moles로 주입량이 증가할수록 감소되었다. 특히 L-NAME 주입량이 10-4 M 되게 하였을 때는 0.
- 수 있다. 흰쥐에 알코올을 30일간 음용시켰을 때 nitrite 함량이 유의성 있게 감소되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 유의성 있게 증가되는 것으로 나타났다. 또한 NO 를 생합성하는 NOS 활성 및 c-GMP 함량을 검토한 실험에서도 알코올 음용에 의해 유의성 있게 감소되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 정상화되는 것으로 나타났다.
- 있다. 흰쥐에 장기간 알코올을 음용시켰을 때 음경 조직중의 guanylate cyclase 활성이 현저하게 억제되었으나 螟蚣추출물 투여로 유의성 있게 회복되는 것으로 나타났다.
- Ethanol 음용에 의해 음경해면체 조직 중의 guanylate cyclase 활성이 억제되고 phosphodiesterase 활성이증가되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 유의성 있게 회복되었다. 흰쥐의 음경해면체에 L-NAME 를 주입하였을 때 농도 의존적으로 nitrite 및 c-GMP 함량이 감소되는 것을 확인하였으며, 해면체 전기 자극에 의한 음경 발기능이 억제되었으나 螟蚣추출물을 투여한 경우에는 정상 수준 가깝게 증가되었다. Ethan이을 음용시킨 흰쥐에서 음경 발기능이 현저하게 억제되었으나 螟蚣추출물 투여에 의해 유의성 있게 증가되었다.
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