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문제 정의
- 補腎에 사용되는 腎氣丸이 腎의 대표적인 기능인 생식기능과 성기능에 미치는 영향을 검증하고자 정자생성, 고환 독성에 미치는 영향, 음경해면체 수축에 미치는 영향에 대한 실험을 통하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 이러한 doxorubicine 고환에서 정세관 상피세포의 치밀도 감소 및 정세관 상피세포 사이의 연결을 약하게 하며, 정조세포 및 정자세포의 감소와 정세관 상피세포의 괴사를 유발하는 것으로 알려져 있다16). 따라서 본 실험에서는 doxorubicin을 투여하여 고환독성을 유발시켰고, 腎氣丸의 투여에 따른 고환의 무게, 부고환내 정자 밀도, 정세관 직경 및 정세관상피세포층 높이의 변화를 관찰함으로써 腎氣丸이 남성 생식기능에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다.
- 즉 음경해면체 평활근내 혈관이 이완되어 혈액이 충분히 공급됨으로써 발기가 일어나며 만약 혈관 이완이 원활하지 않고 수축상태가 유지된다면 발기부전이라는 병증으로 진단되는 것이다19, 20). 따라서 본 실험에서는 腎氣丸이 성기능에 미치는 영향을 음경해면체내 조직화학적 검사 및 음경해면체 평활근 이완정도를 관찰함으로써 알아보고자 하였다.
- 하지만 腎氣丸이 대표적인 補腎 처방임에도 불구하고 腎氣丸이 남성 생식기능이나 성기능 등 腎기능에 미치는 영향에 대하여는 아직 보고된 바가 없다. 이에 본 연구에서는 腎氣를 補하는 대표적 처방인 腎氣丸의 투여가 정자생성 및 doxorubicin으로 유발된 고환 독성과 음경해면체의 평활근 혈관에 미치는 효과에 대하여 organ bath study를 중심으로 연구함으로써 남성 갱년기의 주된 장애인 생식기능과 성기능 개선에 대한 腎氣丸의 활용 가능성을 확인하고자 하였다.
가설 설정
- C. SG treated aging group.
제안 방법
- 5㎖을 1일 1회 20일간 경구투여하였고, 신기환군(SG group)은 腎氣丸(1,000㎎/㎏)을 1일 1회 20 일간 경구투여하여 신기환의 정자생성 효과를 평가하였다. Doxo군(Doxo group)은 증류수 0.5㎖을 1일 1회 20일간 경구투여하면서 실험 5, 10, 15일째에 각각 doxorubicin(3㎎/㎏ of b.w.)(Sigma, USA)을 복강내 투여하여 고환독성을 유발하였고, Doxo신기환군(Doxo+SG group)은 腎氣丸(1, 000㎎/㎏)을 1일 1회 20일간 경구투여하면서 실험 5, 10, 15일째에 각각 doxorubicin(3㎎/㎏ of b.w.)을 복강내 투여하여 고환 독성의 완화를 평가하였다.
- HE 염색된 고환 조직에서의 일반적인 병리조직학적 소견을 관찰하였다.
- HE 염색된 고환 조직을 사진 촬영하고, 칼라영상분석장치(Media Cybernetics, Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 고환 1개 당 비교적 원형에 가까운 정세관 20개를 임의로 선택해서 정세관 상피세포층의 높이를 측정하였다.
- HE 염색된 고환 조직을 사진 촬영하고, 칼라영상분석장치(Media Cybernetics, Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 고환 1개 당 비교적 원형에 가까운 정세관 20개를 임의로 선택해서 직경을 측정하였다.
- HE 염색된 부고환을 저배율에서 촬영하고, 칼라영상분석장치(Media Cybernetics, Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 모든 부고환관을 대상으로 광선투과도를 측정하였다. 정상군에서 측정된 투과도의 평균을 100%로 설정하고, 다른 군의 투과도를 환산하여 부고환관내 정자밀도로 평가하였다.
- Olympus, Japan) 으로 관찰하였다. Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 통해 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근육의 분포비율를 계산하였다.
- 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분동안 반응시켜 핵 염색하고, Biebrich scalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리하여 평활근(적색)과 아교섬유(청색)를 염색하고 광학현미경 (BX50. Olympus, Japan) 으로 관찰하였다. Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 통해 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근육의 분포비율를 계산하였다.
- 10% NBF에 고정하였다. 고정한 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 3 ㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다.
- 신기환의 생식기능을 관찰하기 위한 실험군은 정상군, 신기환군, Doxo군, Doxo신기환군 총 4군으로 분류하고 각 군당 체중이 유사하도록 생쥐 8마리를 배정하였다. 정상군(normal group)은 증류수 0.
- 신기환의 성기능을 관찰하기 위한 실험군은 정상군, 노화군, 노화신기환군 총 3군으로 분류하고 각 군당 체중이 유사하도록 생쥐 7마리를 배정하였다. 정상군(normal group)은 8주령의 수컷 ICR계 생쥐에게 증류수 0.
- 5 ㎖)에 현수하고, 실험절편의 한쪽 끝은 organ bath의 바닥에, 다른 쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정한 다음 그 결과를 physiograph(PowerLab, Australia)로 기록하였다. 실험 시작 전 실험절편을 organ bath에서 1시간 안정시킨 후 micromanipulator(Narishige N2, Japan)를 이용하여 피동장력 1.5 g을 가하고 다시 1시간 안정시킨 다음 실험을 진행하였으며 해면체 절편에 PE 1 µM을 투여하여 수축을 유발시킨 후 腎氣丸 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)로 투여하여 수축의 변화를 기록하였다.
- 실험개시일로부터 5일 간격으로 모든 개체의 체중을 측정하였고, 실험종료일에 희생하여 적출된 양쪽 고환의 무게를 측정하였다.
- 실험에 필요한 절편을 제작하기 위하여 토끼를 urethane (0.6 g/㎏, 정맥주사)으로 마취한 다음 음경을 적출하여 modified krebs-ringer bicarbonate solution(125.4 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 15.8 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4, 12.2 mM glucose, pH 7.4)에서 주위의 근육과 지방조직을 제거한 후 음경해면체 주위의 백막을 제거하여 2×2×6 ㎜ 크기의 절편으로 만들었다. 이렇게 제작한 실험 절편을 95%의 O2와 5%의 CO2 혼합가스로 포화된 37 ℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution이 peristaltic pump를 통하여 3 ㎖/min의 속도로 흐르고 있는 organ bath(용량 1.
- 음경해면체 평활근 이완 실험에서는 음경해면체를 적출하여 제작한 실험절편에 PE를 투여하여 최대 수축을 일으킨 후 0.01 ㎎/㎖부터 3.0 ㎎/㎖까지 腎氣丸 농도별로 투여하여 변화를 관찰하였다. 실험결과 腎氣丸 추출물은 PE로 수축된 음경해면체에서 이완효과를 나타냈으며, 이 결과는 腎氣丸이 음경해면체 평활근을 이완시킴으로써 음경으로의 혈류량이 증가되고 발기력을 증가시키는 일련의 과정을 통하여 성기능 개선에도 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
- 음경해면체에 분포하는 평활근과 아교섬유의 분포 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다.
- 4)에서 주위의 근육과 지방조직을 제거한 후 음경해면체 주위의 백막을 제거하여 2×2×6 ㎜ 크기의 절편으로 만들었다. 이렇게 제작한 실험 절편을 95%의 O2와 5%의 CO2 혼합가스로 포화된 37 ℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution이 peristaltic pump를 통하여 3 ㎖/min의 속도로 흐르고 있는 organ bath(용량 1.5 ㎖)에 현수하고, 실험절편의 한쪽 끝은 organ bath의 바닥에, 다른 쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정한 다음 그 결과를 physiograph(PowerLab, Australia)로 기록하였다. 실험 시작 전 실험절편을 organ bath에서 1시간 안정시킨 후 micromanipulator(Narishige N2, Japan)를 이용하여 피동장력 1.
- 생쥐 7마리를 배정하였다. 정상군(normal group)은 8주령의 수컷 ICR계 생쥐에게 증류수 0.5㎖을 1일 1회 60일간 경구투여하였고, 노화군(aging elicited group)은 18개월의 수컷 ICR계 생쥐에게 같은 방법으로 증류수를 경구투여하였으며, 노화신기환군(SG treated aging group)은 腎氣丸 (1, 000㎎/㎏)을 1일 1회 60일간 경구투여하였다.
- 정상군(normal group)은 증류수 0.5㎖을 1일 1회 20일간 경구투여하였고, 신기환군(SG group)은 腎氣丸(1,000㎎/㎏)을 1일 1회 20 일간 경구투여하여 신기환의 정자생성 효과를 평가하였다. Doxo군(Doxo group)은 증류수 0.
- 정상군에서 측정된 투과도의 평균을 100%로 설정하고, 다른 군의 투과도를 환산하여 부고환관내 정자밀도로 평가하였다.
- 에 담가 24시간 고정하고 고환 및 부고환 단면을 만들어 통상적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하였다. 포매된 고환 및 부고환을 5㎛ 두께의 절편으로 제작하고 poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드(Marienfeld, Germany)에 부착시켜 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색하여 관찰하였다.
대상 데이터
- 8주령의 수컷 ICR계 생쥐, 18개월의 수컷 ICR계 생쥐(나라바이오텍, 한국)와 체중 1.5~2.0 kg 내외의 New Zealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)는 항온항습실(온도 23±℃, 습도 55±5%, 12시간 명암주기)에서 1주일간 환경에 적응시킨 후 사용하였고 실험기간동안 사료와 음수는 자유 섭취케 하였다. 본 동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smecae 13-07-03)하에 실시되었다.
- 腎氣丸은 東醫寶鑑 虛勞門 腎虛篇6)에 준하였으며, 약재는 ○○대학교 한방병원에서 구입하여 사용하였다. 처방의 구성과 용량은 Table 1과 같다.
- 처방의 구성과 용량은 Table 1과 같다. 腎氣丸의 7첩 분량인 388.5 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 다음 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하였고, 농축액을 동결건조기로 건조하여 얻은 분말 45 g을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 또한 해면체의 수축변화는 실제 수축의 크기와 PE를 투여하여 유발된 최대 수축에 대한 백분율로 표현하였으며, 실험 결과의 비교는 student's t-test로 유의성을 검증하였다.
- 측정된 항목은 평균±표준편차로 표시하였다. 측정 항목의 평균값은 SPSS 11.5 프로그램을 이용하여 doxorubicin을 접종하지 않은 두 군(정상군 및 신기환군)간에 대해서, 그리고 doxorubicin을 접종한 두 군(Doxo군 및 Doxo신기환군) 간에 대해서 student's t-test로 유의성을 검증하였다.
- 측정된 항목은 평균±표준편차로 표시하였다. 측정 항목의 평균값은 SPSS 11.
성능/효과
- 1. 신기환군은 정상군에 비해서 부고환내 정자밀도가 유의성 있게 높았다.
- 2. 신기환군은 정상군에 비해서 정세관 직경이 유의성 있게 컸다.
- 3. Doxo신기환군은 Doxo군에 비해서 고환 무게가 유의성 있게 높았다.
- 4. Doxo신기환군은 Doxo군에 비해서 정세관 직경이 유의성 있게 컸다.
- 5. Doxo신기환군은 Doxo군에 비해서 정세관상피층 높이가 유의성 있게 높았다.
- 6. 음경해면체 조직에 腎氣丸을 처치하였을 때 노화군에 비하여 평활근 비율과 정맥동내 적혈구의 증가가 관찰되었다.
- 7. 腎氣丸 추출물은 PE로 유발된 음경해면체의 평활근 수축에 대하여 농도의존적 평활근 이완작용을 나타내었다.
- 1C). Doxo신기환군에서는 정세관상피의 치밀도가 Doxo군에 비해서 증가되어 있었으며, 정자발생 소견도 Doxo군에 비해서 자주 관찰되었다(Fig. 1D)
- 미만이었다. Doxo신기환군의 체중변화도 Doxo군과 유사한 경과를 보였으며, 체중 증가율은 약 2.4%로 Doxo군에 비해서 높았으나 유의한 차이는 없었다(Table 2).
- PE에 의하여 1.11±0.08 g(100%) 수축된 해면체에 腎氣丸 추출물을 농도별로 투여하였을 때 0.03 ㎎/㎖에서 1.04±0.10 g(93.5%, p<0.001), 0.1 ㎎/㎖에서 0.96±0.09 g(87.0%, p<0.001), 0.3 ㎎/㎖에서 0.91±0.08 g(82.2%, p<0.001), 1.0 ㎎/㎖에서 0.82±0.10 g(73.9%, p<0.001), 3.0 ㎎/㎖ 에서 0.63±0.07 g(56.7%, p<0.001)의 수축을 나타내어 유의성 있는 이완효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
- 고환의 무게를 측정한 결과 정상군과 신기환군 사이에 유의한 차이는 없었지만 Doxo신기환군은 doxorubicin에 의하여 고환무게가 감소된 Doxo군에 비하여 유의한 고환 무게의 증가를 보임으로써 腎氣丸이 doxorubicin에 의해 유발된 고환 독성을 완화시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 고환의 병리조직학적 소견에서 신기환군은 정상군에 비해 정세관 상피 증식 및 정자발생이 뚜렷하게 관찰되었고 Doxo군에서는 정세관상피 변성 및 괴사가 관찰되어 다른 연구보고 17, 21)와 동일한 doxorubicin에 의한 고환독성이 확인되었으며, Doxo신기환군에서는 정세관상피의 치밀도가 Doxo군에 비해 증가되어 있었고 정자발생의 소견도 Doxo군에 비해 자주 관찰되었다. 이는 腎氣丸이 정자를 생성하는 정세관에 작용하여 정자 성장과정에 영향을 줌으로써 정자 발생을 촉진시킨다는 것으로 생각되며, Doxo군에 비해 Doxo신기환군에서 정자발생의 소견 및 정세관상피의 치밀도가 증가된 사실을 바탕으로 doxorubicin에 의한 고환독성도 완화시켜 정자 발생에 영향을 준 것으로 생각된다.
- 또한 각 실험군의 정세관 직경 및 정세관상피세포층 높이를 관찰해보았을 때 신기환군 및 Doxo신기환군의 정세관 직경이 정상군 및 Doxo군에 비하여 유의성 있는 증가를 보였다. 고환의 병리조직학적 소견에서 신기환군은 정상군에 비해 정세관 상피 증식 및 정자발생이 뚜렷하게 관찰되었고 Doxo군에서는 정세관상피 변성 및 괴사가 관찰되어 다른 연구보고 17, 21)와 동일한 doxorubicin에 의한 고환독성이 확인되었으며, Doxo신기환군에서는 정세관상피의 치밀도가 Doxo군에 비해 증가되어 있었고 정자발생의 소견도 Doxo군에 비해 자주 관찰되었다.
- 먼저 각 실험군들의 체중을 측정해본 결과 신기환군에서도 정상군과 동일하게 체중이 정상적으로 증가되었다. Doxorubicin 을 투여한 Doxo군과 Doxo신기환군에서는 doxorubicin의 세포독성에 의해, 다른 연구결과17, 18)와 동일하게 전반적으로 체중 감소가 나타났다.
- 본 실험에서는 신기환군이 정상군에 비해 부고환내 정자 밀도를 유의성 있게 높였고 Doxo군과 Doxo신기환군 사이의 유의한 차이는 보이지 않았다. 이는 腎氣丸의 투여가 정상 상태에서 정자생성을 촉진시키지만 고환독성이 유발된 상태에서는 신기환의 정자생성 촉진효과가 미흡한 것으로 판단할 수 있다.
- 신기환군과 Doxo신기환군의 정세관 직경은 정상군과 Doxo 군에 비해서 유의성 있게 컸으며, 신기환군의 정세관 상피 세포층 높이는 정상군과 차이가 없었으나, Doxo신기환군의 정세관 상피 세포층 높이는 Doxo군에 비해서 유의성 있게 높았다 (Table 4).
- 신기환군의 고환 무게는 정상군에 비해서 다소 높게 나타났으나 유의한 차이는 없었으며, Doxo신기환군의 고환 무게는 Doxo군에 비해서 유의성 있게 높았다(Table 3).
- 신기환군의 부고환관내 정자밀도는 정상군에 비해서 유의성 있게 높았고, Doxo신기환군의 부고환내 정자밀도는 Doxo 군에 비해서 높았으나 유의한 차이는 없었다(Table 4).
- 신기환군의 체중 증가율은 정상군에 비해서 다소 높았으나 유의한 차이는 없었고, Doxo군에서는 실험 5일까지 체중이 증가되었으나 doxorubicin을 접종한 실험 5일 이후에는 체중이 감소되어 실험기간 중 체중 증가율은 1% 미만이었다. Doxo신기환군의 체중변화도 Doxo군과 유사한 경과를 보였으며, 체중 증가율은 약 2.
- 0 ㎎/㎖까지 腎氣丸 농도별로 투여하여 변화를 관찰하였다. 실험결과 腎氣丸 추출물은 PE로 수축된 음경해면체에서 이완효과를 나타냈으며, 이 결과는 腎氣丸이 음경해면체 평활근을 이완시킴으로써 음경으로의 혈류량이 증가되고 발기력을 증가시키는 일련의 과정을 통하여 성기능 개선에도 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
- 영상분석결과 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근의 분포 비율은 정상군에서는 1 : 0.23, 노화군에는 1 : 0.18 그리고 노화신기환군에서는 1 : 0.33로 나타났다.
- 음경해면체내의 정맥동 영상분석 결과 적혈구가 관찰되었으며, 특히 노화신기환군에서는 노화군에 비해 307 % 많은 적혈구를 관찰할 수 있었다(Fig. 2C).
- 음경해면체의 조직화학적인 실험결과, 아교섬유에 대한 평활근의 분포비율은 노화군에 비하여 노화신기환군에서 증가되어 나타났고 음경해면체내 정맥동에서 적혈구의 수도 증가되었는데, 이를 통해 腎氣丸이 음경해면체내 평활근을 확장시킴으로써 음경해면체내 혈류량이 증가된 것을 알 수 있다.
- 이상의 결과를 종합해보면 腎氣丸은 부고환 및 정세관에 영향을 주어 정자발생을 촉진 및 doxorubicin에 의해 유발된 고환 독성 완화로 생식기능의 개선에도 효과를 나타내며, 음경해면체에서는 조직내 혈관을 이완시킴으로써 성기능의 개선에도 효과를 나타냈다. 따라서 腎氣丸을 남성 갱년기 장애의 주된 장애인 생식기능과 성기능장애 개선 목적으로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 조직화학결과 아교섬유는 음경해면체 중심부와 가쪽 백색 막주변부에서 관찰되었다, 평활근은 음경해면체에 분포하는 아교섬유 사이공간에서 관찰되었는데, 특히 노화 신기환군에서는 음경해면체 중심부에 분포하는 아교섬유사이에서 많이 관찰되었다(Fig. 2C).
후속연구
- 효과를 나타냈다. 따라서 腎氣丸을 남성 갱년기 장애의 주된 장애인 생식기능과 성기능장애 개선 목적으로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 토대로 할 때, 腎氣丸은 정자발생을 촉진하는 효과와 doxorubicin에 의한 고환독성을 완화시키는 효과가 있고 음경해면체 평활근 이완효과를 통해 성기능 개선에도 도움을 주며, 남성 갱년기 장애의 주된 장애인 생식기능과 성기능 개선 목적으로 활용 가능성도 있을 것으로 생각된다.
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