대두 발효식품으로부터 분리한 Bacillus subtilis HS 25가 생산한 항균물질의 특성 Characterization of an Antibacterial Substance Produced by Bacillus subtilis HS 25 Isolated from Fermented Soybean Foods원문보기
대두 발효식품으로부터 분리 동정한 B. subtilisHS 25가 생산한 항균물질의 특성을 검토하였다. 열안정성을 검토한 결과, $100^{\circ}C$에서 10분 처리에서는 항균활성이 전혀 떨어지지 않았지만 15분 이상의 처리에서는 항균활성이 약간 떨어지는 경향을 보였다. pH 안정성은 pH $4.5{\sim}5.0$의 산성측보다 pH $7.42{\sim}12.0$까지의 알칼리 범위에서 안정된 항균활성을 유지하였다. 특히, E. coli 및 P. mirabilis에 대한 항균활성은 pH 12.0에서도 대조구와 거의 대등한 활성을 나타내었다. 최소저해농도는 E. coli가 5 mg/mL로 가장 낮았으며, P. mirabilis는 7.5 mg/mL, S. aureus, S. enteritidis, K. pneunoniae 및 V. parahaemolyticus 균주에서는 15mg/mL를 나타내었다. B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질을 E. coli, S. enteritidis 및 P. mirabilis에 각각 처리하였을 때 균체의 표면이 불규칙적으로 변형되어 심한 형태적 변화가 일어났음을 관찰할 수 있었다. B. subtilis HS 25균주가 생산한 항균물질은 papain에 의해서는 분해되지 않지만, A. orzae 유래의 protease과 pancreatin 및 pepsin의 효소에 의해서 완전히 분해되어 항균활성이 전혀 나타나지 않았다.
대두 발효식품으로부터 분리 동정한 B. subtilis HS 25가 생산한 항균물질의 특성을 검토하였다. 열안정성을 검토한 결과, $100^{\circ}C$에서 10분 처리에서는 항균활성이 전혀 떨어지지 않았지만 15분 이상의 처리에서는 항균활성이 약간 떨어지는 경향을 보였다. pH 안정성은 pH $4.5{\sim}5.0$의 산성측보다 pH $7.42{\sim}12.0$까지의 알칼리 범위에서 안정된 항균활성을 유지하였다. 특히, E. coli 및 P. mirabilis에 대한 항균활성은 pH 12.0에서도 대조구와 거의 대등한 활성을 나타내었다. 최소저해농도는 E. coli가 5 mg/mL로 가장 낮았으며, P. mirabilis는 7.5 mg/mL, S. aureus, S. enteritidis, K. pneunoniae 및 V. parahaemolyticus 균주에서는 15mg/mL를 나타내었다. B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질을 E. coli, S. enteritidis 및 P. mirabilis에 각각 처리하였을 때 균체의 표면이 불규칙적으로 변형되어 심한 형태적 변화가 일어났음을 관찰할 수 있었다. B. subtilis HS 25균주가 생산한 항균물질은 papain에 의해서는 분해되지 않지만, A. orzae 유래의 protease과 pancreatin 및 pepsin의 효소에 의해서 완전히 분해되어 항균활성이 전혀 나타나지 않았다.
We investigated an antibacterial substance produced by Bacillus subtilis HS 25. Antibacterial activity was relatively heat-stable, with no effect caused by heating at $100^{\circ}C$ for 10 min, but a gradual decrease in activity after 15 min at $100^{\circ}C$. The antibacterial...
We investigated an antibacterial substance produced by Bacillus subtilis HS 25. Antibacterial activity was relatively heat-stable, with no effect caused by heating at $100^{\circ}C$ for 10 min, but a gradual decrease in activity after 15 min at $100^{\circ}C$. The antibacterial substance was more stable at pH 7.42-12 than at pH 4.5-5.0. There was strong antibacterial activity against E. coli and P. mirabilis at pH 12. The minimum inhibition concentration (MIC) of the substance was 5 mg/mL for E. coli 7.5 mg/mL for P. mirabilis and S. aureus and 15 mg/mL for S. enteritidis, K. pneunoniae, and V. parahaemolyticus. When the substance was added to cultures of E. coli, S. enteritidis, and P. mirabilis, the bacterial surfaces became irregular and deeply changed. The substance produced from B. subtilis HS 25 was not degraded by Papain but was degraded by a protease from Aspergillus orzae, pancreatin, and pepsin.
We investigated an antibacterial substance produced by Bacillus subtilis HS 25. Antibacterial activity was relatively heat-stable, with no effect caused by heating at $100^{\circ}C$ for 10 min, but a gradual decrease in activity after 15 min at $100^{\circ}C$. The antibacterial substance was more stable at pH 7.42-12 than at pH 4.5-5.0. There was strong antibacterial activity against E. coli and P. mirabilis at pH 12. The minimum inhibition concentration (MIC) of the substance was 5 mg/mL for E. coli 7.5 mg/mL for P. mirabilis and S. aureus and 15 mg/mL for S. enteritidis, K. pneunoniae, and V. parahaemolyticus. When the substance was added to cultures of E. coli, S. enteritidis, and P. mirabilis, the bacterial surfaces became irregular and deeply changed. The substance produced from B. subtilis HS 25 was not degraded by Papain but was degraded by a protease from Aspergillus orzae, pancreatin, and pepsin.
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문제 정의
특히 전통 장류발효식품은 우리민족의 건강을 지켜온 우수한 단백질 급원으로 인정되고 있으나, 염분의 함량이 높아 현대인의 식생활 흐름과 성인병 등의 예방측면에서 저염화 추세가 요구되고 있다(5, 6). 그러나 장류발효식품을 저 염화 할 경우 여러 가지 부패미생물의 증식으로 저장성이 낮아지는 등 많은 문제점이 대두되기 때문에 이를 해결하기 위해서 본 연구자들은 전보(7)에서 전통 대두 발효식품으로부터 효소 활성 및 항균활성 이 우수한 Bacillus subtilis HS-25균주를 순수분리하여 그 미생물의 생화학적 및 배양학적 특성을 밝히고 항균물질 대량생산을 위한 최적배양조건 등을 보고하였다. 본 연구에서는 B.
그러나 장류발효식품을 저 염화 할 경우 여러 가지 부패미생물의 증식으로 저장성이 낮아지는 등 많은 문제점이 대두되기 때문에 이를 해결하기 위해서 본 연구자들은 전보(7)에서 전통 대두 발효식품으로부터 효소 활성 및 항균활성 이 우수한 Bacillus subtilis HS-25균주를 순수분리하여 그 미생물의 생화학적 및 배양학적 특성을 밝히고 항균물질 대량생산을 위한 최적배양조건 등을 보고하였다. 본 연구에서는 B. subtilis HS-25균주가 생산한 항균물질의 특성을 더욱더 명확히 밝히기 위하여 항균활성 이 우수한 미생물로 보고된 B, natto, B. subtilis, B. licheivformis 및 B. megaterium SMY 212 와 그 활성을 비교하였으며, 또한 B. subtilis HS-25가 생산한 항균물질의 열안정성 및 pH 안정성 등의 여러 가지 성질을 검토하였다.
subtilis HS-25균주를 분리하여 배양학적 특성을 검토하여 보고하였다. 이 배양조건에서 B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질의 활성 정도를 밝힐 목적으로 이미 항균 활성이 높은 미생물로 밝혀져 있는 R natto, B. subtilis, B. lichemfbrmis 및 R rnegatenum SMY 212 균주를 액체배양 한 후 원심분리하여 얻은 상징 액을 membrane filter.로 여과한 다음 paper disc에 150 pL씩 흡착시켜 유해미생물에 대한 항균 활성을 비교하여 Table 1에 나타내었다.
전통 장류 발효식품의 발효도와 저장성을 증진시키기위하여 전보(7)에서 전통 대두 발효식품으로부터 cellulase, amylase 및 protease 활성과 항균활성이 우수한 B. subtilis HS-25균주를 분리하여 배양학적 특성을 검토하여 보고하였다. 이 배양조건에서 B.
제안 방법
B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질의 처리가 유해 미생물의 세포형태 변화에 미치는 영향을 검토하기 위하여 B. subtilis HS 25 균주를 24시 간 배양한 후 8, 000g에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상징 액을 0.45 pm membrane filter로 여과한 여과액과 7시간 동안 Mueller Hinton 액체배지에 배양한 유해 미생물을 1:1로 혼합한 다음 35℃에서 50 rpm 으로 10시간 동안 천천히 진탕 시킨 후 주사전자현미경 (SEM, JEOL T330A)으로 유해미생물의 세포형태 변화를 관찰하였다.
열 안정성은 시료를 100℃에서 5, 10, 15, 20 및 25분 동안 열처리한 다음 각각의 시료에 잔존하는 항균활성을 측정하였다. pH 안정성은 원심분리 하여 얻은 시료 용액에 0.1 M NaOH 및 0.1 M HC1 을 사용하여 pH 4.5 〜12까지 조절한 다음 상온에서 천천히 흔들면서 2시간 동안 방치한 후 pH 7.5로 중화시켜 항균활성을 측정 측정하였다. 각종 단백질분해효소에 대한 안정성 검토는 원심분리하여 얻은 시료를 0.
3에 나타내었다. 각 유해 미생물의 형태 변화는 항균물질을 처리하지 않은 시험 구(I)인 대조구와 처리한 시험구(n)를 주사전자현미경으로 관찰하였다. Fig.
5로 중화시켜 항균활성을 측정 측정하였다. 각종 단백질분해효소에 대한 안정성 검토는 원심분리하여 얻은 시료를 0.45 pm membrane filter로 여과한 다음 기원이 서로 다른 여 러 종류의 시 판 단백질 분해효소를 200 units씩 처리하여 37 ℃ 에서 2시간 방치한 후 잔존하는 항균활성을 측정하였다. 단백 질 분해 효소로는 Aspergillus or^jae 유래 의 protease (Sigma, St.
대두 발효식품으로부터 분리 동정 한 B, subtilis HS 25가 생산한 항균물질의 특성을 검토하였다. 열안정성을 검토한 결과, 100℃에서 10분 처리에서는 항균활성이 전혀 떨어지지 않았지만 15분 이상의 처리에서는 항균활성이 약간 떨어지는 경향을 보였다.
subtilis HS 25 균주의 배 양액 중에 존재 하는 항균물질이 단백질성 물질인지를 확인하기 위하여 시판중인 pancreatin, pepsin, papain 및 Aspergillus orzae 유래의 protease을 각 200 umits/mL씩 첨가하여 2시간 동안 처리한 후 잔존 항균활성을 검토하여 Table 3에 나타내었다. 대조 구는 각 효소를 용해할 때 사용한 완충용액을 동량 첨가하여 사용하였다. 효소처리를 하지 않은 대조구에서는 매우 높은 항균활성을 나타내었지 만 pancreatin, pepsin 및 곰팡이 유래의 protease을 처리한 시험구에서는 모든 유해 미생물에 대하여 전혀 항균활성이 나타나지 않았다.
subtilis HS 25 균주를 액체배양 한 후 그 배양액을 8, 000g 에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상징액을 사용하였다. 열 안정성은 시료를 100℃에서 5, 10, 15, 20 및 25분 동안 열처리한 다음 각각의 시료에 잔존하는 항균활성을 측정하였다. pH 안정성은 원심분리 하여 얻은 시료 용액에 0.
최소저해 농도(minimum inhibitory concentration: MIC)는 박테리오신 생산 균주를 액체배양 한 후 배양액을 8, 000 g에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상징액을 0.45 pm membrane filter로 여과한 다음 멸균된 paper dis*에 여과액을 0, 5, 10, 20, 40, 60 및 80 mg/mL 가 되도록 각각 흡착시킨 후 유해미 생물을 중층 한 Mueller Hinton배지 상에 얹어 35C에서 정치배양하면서 유해미생물의 생육을 억제하는 clear zone의 직경 (mm)을 측정하여 나타내었다.
2 pm membrane filter로 여과하여 항균활성 측정 시료로 사용하였다. 측정법은 0.6% soft agar가 함유된 Mueller Hinton 배지에 각 유해미생물의 액체배양액 50 pL 씩을 접종하여 잘 혼합한 후 미리 준비해둔 MueUer Hinton 평판배지에 중층 한 다음 항균활성 측정시료 120 pL씩을흡착시켜 건조시켜 둔 paper disc (Toyo Rhosi kaisha, Ltd., 8 mm)를 중층배지 위에 얹어 35℃ 항온기에서 배양하면서 유해 미생물의 생육저해를 나타내는 clear zone의 직경(mm)을 측정하였다.
대상 데이터
5% 및 MgCh . 6H2O 0.05%로 구성된 배지를 사용하였으며, 항균물질 생산을 위한 배양은 35℃에서 180 rpm으로 24시간 행하였다(7).
45 pm membrane filter로 여과한 다음 기원이 서로 다른 여 러 종류의 시 판 단백질 분해효소를 200 units씩 처리하여 37 ℃ 에서 2시간 방치한 후 잔존하는 항균활성을 측정하였다. 단백 질 분해 효소로는 Aspergillus or^jae 유래 의 protease (Sigma, St. Louis, USA), 온혈동물의 췌장에서 분리한 pancreatin (Kanto chemical co., Japan), Papaya 유액 유래의 papain (Sigma, St. Louis, USA) 및 돼지의 위 점막 유래의 pepsin (Sigma, St. Louis, USA) 을 사용하였다. Pepsin은 0.
0)에 용해하여 사용하였다. 대조구로는 각 효소를 용해할 때 사용한 완충용액을 사용하였다.
항균활성이 우수한 미생물로 분리 . 동정된 Bacillus subtilis HS-25를 사용하였다(7). 항균활성 검토를 위한 유해 미생물은 Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis KCCM 1202, Klebsiella pneumoniae KCCM 11319, Proteus nurabilis KCTC 2433 및 Vibrio parahaemolyticus 등의 Gram(-) 균과 Staphylococcus aureus KCTC 1927 등의 Gram(+)균을 한국종균협회에서 분양을 받아 사용하였다.
항균물질의 여러 가지 안정성을 검토하기 위한 시료는 B. subtilis HS 25 균주를 액체배양 한 후 그 배양액을 8, 000g 에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상징액을 사용하였다. 열 안정성은 시료를 100℃에서 5, 10, 15, 20 및 25분 동안 열처리한 다음 각각의 시료에 잔존하는 항균활성을 측정하였다.
동정된 Bacillus subtilis HS-25를 사용하였다(7). 항균활성 검토를 위한 유해 미생물은 Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis KCCM 1202, Klebsiella pneumoniae KCCM 11319, Proteus nurabilis KCTC 2433 및 Vibrio parahaemolyticus 등의 Gram(-) 균과 Staphylococcus aureus KCTC 1927 등의 Gram(+)균을 한국종균협회에서 분양을 받아 사용하였다.
이론/모형
미생물의 항균활성은 agar diffusion법(8)에 준하여 측정하였다. 500 mL의 삼각플라스크에 200 mL의 액체배지를 넣고 살균한 후, 전배양액을 1% 접종하여 35℃에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
2)Tested strains = A-8, E coli ATCC 25922 ; A-12, S aureus KCTC 1927 ; A-14, S. enteritidis KCCM 1202 ; A-18, K. pneuiwniae KCCM 11319 ; A-25, P. mirabilis KCTC 2433 ; A-26, V. parahaemolyticus.
2-A, B, C, D, E 및 F의 c)를 사용하였다. B. subtilis HS 25 균주가 생산하는 항균물질은 본 연구에 사용한 모든 유해 미생물에 대하여 pH 4.5 및 5.0의 산성 측에서는 거의 항균 활성을 나타내지 않았지만, pH 7.42〜12.0까지의 알칼리성 범위에서는 매우 안정된 항균활성을 유지하였다. 특히, E.
parahaemolyticus 균주에서는 15 mg/mL를 나타내었다. B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균 물질을 E. coli, S. enteritidis 및 P. mirabilis^ 각각 처리하였을 때 균체의 표면이 불규칙적으로 변형되어 심한 형태적 변화가 일어났음을 관찰할 수 있었다. B.
각 유해 미생물의 형태 변화는 항균물질을 처리하지 않은 시험 구(I)인 대조구와 처리한 시험구(n)를 주사전자현미경으로 관찰하였다. Fig. 3의 A는 E. coli, B는 S. enteritidis, C는 P. mirabilis의 균주에 B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질을 각각 처리한 것으로 대조구인 I 은 완전한 균체의 형태를 유지하고 있는데 비하여 항균물질을 처리한 시험구 II는 균체의 표면이 불규칙적이며, 타원형으로 변형되어 3 종류의 균주 모두 표층구조가 손상을 받아 심한 형태적 변화가 일어났음을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 현상은 B.
로 여과한 다음 paper disc에 150 pL씩 흡착시켜 유해미생물에 대한 항균 활성을 비교하여 Table 1에 나타내었다. Table 1에서 보는 바와 같이 E. coli, S. aureus, S. enteritidis, K. pneumoniae, P. mirabilis 및 V. parahaemolyticus^} 유해미생물에 대하여 B. subtilis HS 25 균주는 아주 높은 항균활성을 나타내었으나 B. subtilis 및 B. licheniformis는 거의 항균활성을 나타내지 않았으 며, B. natto와 B. megaterium SMY 212 균주에서는 약간의 항균활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 항균 미생물을 배양하는 조건 및 항균활성을 나타내는 대상 미생물의 종류에 따른 차이 때문으로 생각된다.
subtilis HS 25 균주의 항균물질이 유해미생물의 생육 저해에 미치는 최소저해농도(MIC)를 검토한 결과를 Table 2에 나타내었다. 고체배지에서 최소저해농도는 E. coli가 5 mg/mL로 가장 낮게 나타났으며, P. mirabilis^ 7.5 mg/mL, S. aureus, S. enteritidis, K. pneumoniae 및 V. parahaemolyticus 균주에서는 15 mg/mL를 나타내었다. 이상의 결과로 B.
항균물질의 특성을 검토하였다. 열안정성을 검토한 결과, 100℃에서 10분 처리에서는 항균활성이 전혀 떨어지지 않았지만 15분 이상의 처리에서는 항균활성이 약간 떨어지는 경향을 보였다. pH 안정성은 pH 4.
1-A 및 E의 e). 이 와 같은 결과는 Pediococcus pentosaceus FB61 이 생산한 pediocin A의 물질은 1(XTC에서 10분간 열처리하면 단지 5% 정도의 항균활성만이 유지되었다는 결과(10)와 비교할 때 상당히 열 안정성이 높은 것으로 판단된다. 그리고 Ali 등(11)은 Lactococcus lactis subsp.
mirabilis게 대한 항균활성 은 pH 120의 알칼리 측에서도 대조구와 거의 대등한 활성을 나타내었다. 이상의 결과로 B. subtilis HS 25 균주가 생산하는 항균물질은 산성 조건보다는 알칼리성 조건에서 더욱 안정한 것으로 확인되었다. Daeshel 등(12)이 보고한 Lactobacillus plantarum C-11 이 생산하는 plantaricin A는 pH 4.
parahaemolyticus 균주에서는 15 mg/mL를 나타내었다. 이상의 결과로 B. subtilis HS 25 균주가 생산하는 항균물질은 낮은 농도에서도 그람양성뿐만 아니라 음성 균주의 생육을 저해시킬 수 있는 항균물질을 생산하고 있음을 확인할 수 있었다.
subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질은 단백질성 물질일 가능성이 높은 것으로 추측되었다. 이상의 결과로 B. subtilis HS 25 균주는 전통 콩 발효식품에서 발효 균주로 사용할 가치가 있는 것으로 사료된다.
diacetylactis UL 720에 의해 생산된 diacetin B는 121℃에서 20분간 처리 후에도 항균활성이 안정하다고 보고하였다. 이상의 결과로 미생물이 생산하는 항균물질은 그 미생물의 특성에 따라서 열 안정성에 상당한 차이를 나타내는 것으로 판단된다.
그러나 papain을 처리한 시험구는 전혀 영향을 받지 않고 대조 구의 활성과 동일한 항균활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 B. subtilis HS 25균주가 생산한 항균물질은 papain에 의해서는 분해되지 않지 만 protease, pancreatin 및 pepsin의 효소에 의해서 완전히 분해되기 때문에 유해미생물에 대하여 항균 활성 이 전혀 나타나지 않는 것으로 판단되 었으며, 또한 B. subtilis HS 25 균주가 생산한 항균물질은 단백질성 물질일 가능성이 높은 것으로 추측되었다. 이상의 결과로 B.
참고문헌 (14)
Kim, T.K., Shin, H.D., and Lee, Y.H. (2003) Stabilization of polyphenolic antioxidants using inclusion complexation with cyclodextrin and their utilization as the fresh-food preservation. Korean J. Food Sci. Technol., 35, 266-271
Baeck, B. S. and Lee, Y. H. (2006) Consumer's awareness and policies directions on food additives-Ficusing on consumer information. Korean Soc. Consumer Studies, 17, 133-141
Lee, S.W., Shin, S.Y. and Yu, T.J. (1985) Effect of the ethanol contents on the preparation of low salt Doenjang. Korean J. Food Sci. Technol., 17, 336-339
Park, S.K., Cho, Y.S., Shon, M.Y., Gal, S.W. and Lee, S.W. (2007) Isolation and cultural characterization of antibacterial substance producing microbes. Korean J. Food Preserv., 14, 194-200
Kim, J.D., Cheo M. and Ju, J.S. (1995) A study on correlation between blood pressure and dietary Na, K intakes pattern in the family member of normal and cerebrovascular disease patients. J. Korean Soc. Food Nutr., 24, 24-29
Kim, S.K., Lee. S.J., Baek. Y.J. and Park, Y.H. (1994). Isolation of Bacteriocin producing Lactococcus sp. 449 and its Antimicrobial charateristics. Kor. J. Appl. Microb. Biotechnol., 22, 259-265
Ryu, H.S., Shon, M.Y., Cho, S.J., Park, S.K. and Lee, S.W. (2007) Characterization of antibacterial substance-producing Bacillus subtilis isolated from traditional Doenjang. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 50, 87-94
Hurst, A. (1981). Nisin. Adv. Appl. Microbiol., 27, 85-89
Shon, M.Y. (1991). Physicochemical properties and biological activities of Chungkuk-jang produced from korean black bean. Ph. D. thesis of Gyeongsang National University, Jinju, Korea
Piva, A. and Hedadon, D.R. (1994). Pediocin A, a bacteriocin produced by Pediococcus pentosaceus FBB61. Microbiology. 140, 697-702
Ali, D. and Lacroix, C. (1995). Characterization of diacetin B. a bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. lactis bv diacetylactis UL720. Can. J. Microbiol., 41, 832-841
Takatsugu, T., Oshimura, M., Umezawa, C. and Kanatani, K. (1996). Isolation partial characterization and Mode of Action of Acidocin J1132, Two Component Bacteriocin Produced by Lactobacillus acidphillus JCM1132. Appl. Environ., Microbiol., 62, 892-897
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