전통발효식품에서 분리한 유산균의 항균 활성 및 발효유 스타터 개발 Antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods and development of a starter for fermented milk원문보기
본 연구에서는 수입되는 발효유 starter를 대체하기 위해 전통발효식품으로부터 유산균을 분리 및 동정하여 이를 이용한 유산균주의 발효유 적합성 및 probiotics로서의 가능성을 확인하기 위한 기초자료로 사용하고자 실시하였다. 전통발효식품 배추김치, 젓갈 및 장류에서 분리해 낸 유산균주는 11종이며, 이 중 내산성 및 내담즙성이 우수한 L. plantarum A, Leu. lactis B 및 L. acidophilus C를 선택하여 항균활성 및 발효유제조 적용연구를 실시하였다. 3종의 균종에 대한 항균활성은 병원성 미생물인 Li. monocytogenes NCTC 11994에 대해서 높은 항균활성을 보였다. 항균활성이 있는 3종의 유산균주를 사용하여 발효유를 제조한 결과 대조구인 ABT 5보다는 미생물학적 및 이화학적 변화가 유의적으로 차이는 났으나 관능검사 결과 색, 향기, 조직감, 맛 및 전체적인 기호도가 대조구 대비 80% 이상으로 단독 균주임을 감안하면 우수한 관능적 특성을 가지고 있고, 추후 관능적 특성을 높이기 위한 복합균주에 대한 연구가 추가적으로 진행된다면 발효유 스타터로서의 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 수입되는 발효유 starter를 대체하기 위해 전통발효식품으로부터 유산균을 분리 및 동정하여 이를 이용한 유산균주의 발효유 적합성 및 probiotics로서의 가능성을 확인하기 위한 기초자료로 사용하고자 실시하였다. 전통발효식품 배추김치, 젓갈 및 장류에서 분리해 낸 유산균주는 11종이며, 이 중 내산성 및 내담즙성이 우수한 L. plantarum A, Leu. lactis B 및 L. acidophilus C를 선택하여 항균활성 및 발효유제조 적용연구를 실시하였다. 3종의 균종에 대한 항균활성은 병원성 미생물인 Li. monocytogenes NCTC 11994에 대해서 높은 항균활성을 보였다. 항균활성이 있는 3종의 유산균주를 사용하여 발효유를 제조한 결과 대조구인 ABT 5보다는 미생물학적 및 이화학적 변화가 유의적으로 차이는 났으나 관능검사 결과 색, 향기, 조직감, 맛 및 전체적인 기호도가 대조구 대비 80% 이상으로 단독 균주임을 감안하면 우수한 관능적 특성을 가지고 있고, 추후 관능적 특성을 높이기 위한 복합균주에 대한 연구가 추가적으로 진행된다면 발효유 스타터로서의 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
This study was conducted to investigate the antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods and to develop a new starter for fermented milk. The isolates were identified using 16S rDNA sequencing and named Lactobacillus plantarum A, Leuconostoc lactis B and L...
This study was conducted to investigate the antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods and to develop a new starter for fermented milk. The isolates were identified using 16S rDNA sequencing and named Lactobacillus plantarum A, Leuconostoc lactis B and L. acidophilus C. The activity of these strains to inhibit the growth of food-borne human pathogens (Escherichia coli NCTC 12923, Salmonella Typhimurium NCTC 12023, Listeria monocytogenes NCTC 11994) was measured using the paper disc method. All these strains showed strong antibacterial activity against Li. monocytogenes NCTC 11994. The experiment groups were the fermented milks with these strains, and the control group was the fermented milk with the commercial starter (ABT 5). The change of pH, acidity and viable cell counts were measured during their aging time. All the experiment groups showed a significant difference in their aging times compared to the control group. However, the sensory test showed that the experiment groups can be used as useful starters for fermented milk. This result suggests that L. plantarum A, Leu. lactis B and L. acidophilus C have the potential to be developed as new starters for fermented milk.
This study was conducted to investigate the antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods and to develop a new starter for fermented milk. The isolates were identified using 16S rDNA sequencing and named Lactobacillus plantarum A, Leuconostoc lactis B and L. acidophilus C. The activity of these strains to inhibit the growth of food-borne human pathogens (Escherichia coli NCTC 12923, Salmonella Typhimurium NCTC 12023, Listeria monocytogenes NCTC 11994) was measured using the paper disc method. All these strains showed strong antibacterial activity against Li. monocytogenes NCTC 11994. The experiment groups were the fermented milks with these strains, and the control group was the fermented milk with the commercial starter (ABT 5). The change of pH, acidity and viable cell counts were measured during their aging time. All the experiment groups showed a significant difference in their aging times compared to the control group. However, the sensory test showed that the experiment groups can be used as useful starters for fermented milk. This result suggests that L. plantarum A, Leu. lactis B and L. acidophilus C have the potential to be developed as new starters for fermented milk.
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문제 정의
하지만 산업적 활용은 미흡하여 우리나라에서 생산되는 발효유의 대부분은 덴마크, 미국 및 일본에서 수입되는 상업적 starter를 주로 사용하고 있어 독자적인 발효유 스타터 개발이 시급한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 수입되는 발효유 starter를 대체하기 위해 전통발효식품으로부터 유산균을 분리 및 동정하여 이를 이용한 유산균주의 발효유 적합성 및 probiotics로서의 가능성을 확인하여 향후 발효유의 starter 개발을 위한 기초자료로 사용하고자 한다.
본 연구에서는 수입되는 발효유 starter를 대체하기 위해 전통발효식품으로부터 유산균을 분리 및 동정하여 이를 이용한 유산균주의 발효유 적합성 및 probiotics로서의 가능성을 확인하기 위한 기초자료로 사용하고자 실시하였다. 전통발효식품 배추김치, 젓갈 및 장류에서 분리해 낸 유산균주는 11종이며, 이 중 내산성 및 내담즙성이 우수한 L.
제안 방법
각 시료별 배지에서 투명환을 나타내는 단일 colony를 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주들을 BCP agar(Eiken chemical Co., Ltd., Shimotsuga, Japan)에 획선평판법으로 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 노란색을 보이는 colony를 2차 분리하였다. 김치로부터 5종, 젓갈에서 1종, 장류에서 5종이 분리되었으며, 이를 MRS agar에 접종하여 37℃에서 24∼72시간 배양 후 4℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
37℃에서 24시간 배양된 병원성 미생물(Escherichia coli NCTC 12923, Salmonella Typhimurium NCTC 12023, Listeria monocytogenes NCTC 11994)을 면봉으로 Nutrient agar(Difco)에 도말하였다. 도말된 평판배지에 직경 10 mm의 paper disc를 놓고 37℃ MRS broth에서 24시간 배양된 분리균을 각각 40 μL씩 일정하게 가한다.
도말된 평판배지에 직경 10 mm의 paper disc를 놓고 37℃ MRS broth에서 24시간 배양된 분리균을 각각 40 μL씩 일정하게 가한다. 37℃에서 24시간 배양한 후 disc 주위의 생육저지환 생성 여부를 확인하였다.
, Hercules, CA, USA)을 수행하여 증폭시켰다. PCR 산물은 BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)를 이용하여 ABI Prism 3730XL analyzer(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)로 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 NCBI BLASTN 프로그램(http://blast.
plantarum A, Leu. lactis B 및 L. acidophilus C를 단독으로 이용하여 발효유를 제조하였으며, 대조구는 상업적 균주 ABT 5를 사용하여 비교하였다. 모든 실험구의 지방, 단백질, 유당 및 총고형분 함량은 각각 4.
plantarum A, Leu. lactis B 및 L. acidophilus C를 선택하여 항균활성 및 발효유제조 적용연구를 실시하였다. 3종의 균종에 대한 항균활성은 병원성 미생물인 Li.
내담즙성은 Kang 등(23)의 방법을 변형하여 내산성과 동일한 방법으로 수행하되, Bacto oxgall(Difco)을 0.3%(w/v)를 가한 MRS broth를 사용하였으며, 37℃에서 4시간 배양한 후 생균수를 측정하였다. 위산과 담즙산에 대한 생존율은 위산 및 담즙산을 처리하기 전과 후의 생균수를 비교하였다.
내산성 측정은 Kobayashi 등(22)의 방법을 변형하여 1N HCl를 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS broth(Difco)를 사용하였다. 분리된 유산균을 MRS broth에서 37℃로 24시간 배양한 후 4,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다.
acidophilus C를 이용하여 제조한 발효유의 관능적 특성은 Table 5에 나타내었다. 대조구로는 ABT 5를 이용하여 색, 향기, 조직감, 맛 및 전체적인 기호도를 5점 척도법으로 실시하였으며, 대조구는 각각 4.5, 4.5, 4.8, 4.5 및 4.5 로 나타났다. L.
CFU/mL 이상으로 배양한 후 4℃로 냉장보관하며 사용하였다. 대조군은 상업용 균주인 ABT-5를 똑같은 방법으로 배양하여 발효유 제조용 starter로 사용하였다. 원유에 정백당을 5.
9를 곱한 후 시료의 무게(g)를 나누어 나타낸 값을 적정산도(%)로 하였다. 발효 중 적정산도는 2시간 간격으로 6시간까지 경시적인 변화를 측정하였다.
발효유 제조를 위한 유산균주의 분리원은 배추김치, 젓갈 및 장류를 사용하였으며, pH를 2.5로 조정한 MRS agar를 이용하여 총 11종의 유산균주를 분리하였다(Table 1). 11종의 유산균주는 김치에서 분리한 L.
발효유의 pH가 4.7에 도달하였을 때 4℃에서 24시간 냉각하여 시료로 사용하였으며, 관능검사요원 15명을 대상으로 색(color), 향(flavor), 맛(taste), 조직감(texture) 및 전반적인 기호도(overall acceptability)를 5점 척도법으로 평가하도록 하였다.
발효유의 발효 중 유산균수의 변화는 2시간 간격으로 시료 1 mL를 채취하여 멸균식염수에 십진 희석법으로 희석한 뒤 BCP 한천배지를 이용하여 평판배양법으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 나타난 노란색 colony 수를 측정하여 log CFU(colony forming unit)/mL로 나타내었다.
3%(w/v)를 가한 MRS broth를 사용하였으며, 37℃에서 4시간 배양한 후 생균수를 측정하였다. 위산과 담즙산에 대한 생존율은 위산 및 담즙산을 처리하기 전과 후의 생균수를 비교하였다.
, Arvada, CO, USA)를 이용하여 2시간 간격으로 6시간까지 변화를 측정하였다. 적정산도는 시료 10 mL에 증류수 10 mL를 혼합하여 현탁액을 만든 후 0.1 N NaOH로 pH 8.3까지 적정시키고, NaOH의 소비량에 유산의 환산계수인 0.9를 곱한 후 시료의 무게(g)를 나누어 나타낸 값을 적정산도(%)로 하였다. 발효 중 적정산도는 2시간 간격으로 6시간까지 경시적인 변화를 측정하였다.
대상 데이터
Hansen사(Hørsholm, Denmark)의 ABT-5(L. acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus)를 사용하였다.
유산균 분리를 위하여 배추김치는 전라북도 지역의 가정에서 담근 김치를 사용하였으며, 젓갈류(새우젓) 및 장류(고추장 및 청국장)는 각각 충청남도(광천)와 전라북도(순창)에서 제조된 비살균 시판제품을 구입하여 실험에 사용하였다. 발효유 제조에 사용된 원유는 임실지역 낙농가에서 착유하여 사용하였으며, 대조구로 사용될 상업용 균주는 Chr.
acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus)를 사용하였다. 환원 탈지유는 서울우유(Seoul Milk Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 생산된 제품을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
1 cycle sequencing kit(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)를 이용하여 ABI Prism 3730XL analyzer(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)로 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 NCBI BLASTN 프로그램(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 사용하여 유산균을 동정하였다.
, Enterococcus faecium 및 Ped. acidilactici 3종으로 16S rDNA의 염기서열을 표준 균주와 비교하여 작성한 계통수 결과 각각의 균주는 표준균주와 모두 97% 이상 일치하였다(Table 1). Kwon 등(24)은 김치에는 30종 이상의 유산균종이 있으며 그 중 우점종으로 L.
lactis B 및 L. acidophilus C는 각각 배양 6시간 이내에 pH가 4.6으로 도달하였으며, 상업적 스타터에 비해 배양 시간이 1∼2시간 정도 더 걸린 것으로 나타났다.
lactis B 및 L. acidophilus C를 첨가하여 제조한 발효유는 각각 배양 2시간까지는 변화가 없다가 배양 6시간 때 각각 1.3×108, 7.9×107 및 7.9×107 CFU/mL로 증가하였고, 상업적 스타터 ABT 5를 사용한 발효유는 배양초기부터 증가하여 배양 6시간째 2.5×108 CFU/mL로 증가하였다.
3종의 균종에 대한 항균활성은 병원성 미생물인 Li. monocytogenes NCTC 11994에 대해서 높은 항균활성을 보였다. 항균활성이 있는 3종의 유산균주를 사용하여 발효유를 제조한 결과 대조구인 ABT 5보다는 미생물학적 및 이화학적 변화가 유의적으로 차이는 났으나 관능검사 결과 색, 향기, 조직감, 맛 및 전체적인 기호도가 대조구 대비 80% 이상으로 단독 균주임을 감안하면 우수한 관능적 특성을 가지고 있고, 추후 관능적 특성을 높이기 위한 복합균주에 대한 연구가 추가적으로 진행된다면 발효유 스타터로서의 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
faecium이 각각 96, 95, 94, 및 92%로 높게 나타났다. 내담즙성은 Weissella viridescens를 제외하고 모두 90% 이상의 내담즙성을 확인하였다(Table 3). Kang 등(28)은 발효식품에서 분리한 유산균의 내산성 및 내담즙성을 분석한 결과 내담즙성은 높지만 내산성이 낮은 것으로 보고되고 있으며, 본 연구의 결과에서도 분리된 유산균주의 대부분은 내담즙성은 높지만 내산성이 우수한 유산균주로는 김치에서 분리한 L.
acidophilus C를 단독으로 첨가하였을 경우 상업적 스타터인 ABT 5에 비해 낮은 증가율을 보이고 있으나 상업적 스타터의 경우는 원유를 주성분으로 하여 ABT 5에 속하는 유산균이 잘 자랄 수 있도록 조정이 된 것으로 본 연구에서 사용되는 유산균은 김치에서 분리된 유산균을 적용함으로서 상업적 스타터와는 배양시간의 차이가 생긴 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서 선택된 유산균주 3종은 발효유제조를 위한 스타터로서의 내산성, 내담즙성 및 발효유 제조 시 이화학적 특성이 우수하며 스타터로 이용 가능이 적합하리라 판단된다.
또한 L. plantarum으로 발효유를 제조 시 단독으로 사용할 경우 pH를 4.08∼4.30 까지 낮춘다는 연구보고와 다르게나타났으며, 이는 본 연구에서 분리된 유산균주의 특성에 기인된 것으로 보인다.
6으로 도달하였으며, 상업적 스타터에 비해 배양 시간이 1∼2시간 정도 더 걸린 것으로 나타났다. 상업적 스타터인 ABT 5는 L. acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus 3종의 유산균이 혼합배양 되어 있어 본 연구에서 사용된 단일 균주에 비해서는 빠르게 산을 생성하는 것으로 사료된다. 단독 유산균주를 사용할 경우 Lee 등(31)은 L.
30 까지 낮춘다는 연구보고와 다르게나타났으며, 이는 본 연구에서 분리된 유산균주의 특성에 기인된 것으로 보인다. 하지만 단일균주로 스타터를 제조 시 적정 pH에 도달하지 못하면 스타터로 이용 가능성이 낮은데 비해 본 연구에서 분리해 낸 3종의 유산균은 모두 6시간 이내로 목표 pH에 도달하여 발효유의 스타터로 사용 가능성이 높은 것으로 사료된다. 산도의 변화는 모든 실험구에서 배양시간이 증가할수록 산도는 증가하였으며, 유산균의 변화는 L.
후속연구
plantarum A, Leu. lactis B 및 L. acidophilus C의 장내세균 변화 등의 기능성 연구가 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.
관능검사 결과 대조구에 비해 색, 향기, 조직감 및 전체적인 기호도는 유의하게 낮게 측정되었으며, Lee 등(31)은 풍미 및 기타 관능적 특성 저하가 일어난다고 보고하였다. 본 연구는 선택된 유산균주 3종을 발효유 제조 시 스타터로 사용하기 위한 기초 연구로 본 연구에 사용된 유산균주가 김치에서 분리된 단일균주임을 감안하면 색, 향기, 조직감, 맛 및 전체적인 기호도가 상업적 스타터를 사용한 대조구 대비 80% 이상으로 발효유의 스타터로 이용 가능성이 높은 것으로 보여지며 추후 관능적 특성을 높이기 위한 복합균주에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단된다. 또한 Dedios 등(32)은 발효유 제조에 있어 유산균의 장내 정착이 병원성 미생물의 증식 억제와 장내 세균총에 있어서 중요한 작용을 하므로 기능성이 증진된다고 보고하였고, 향후 동물실험 모델을 통한 L.
monocytogenes NCTC 11994에 대해서 높은 항균활성을 보였다. 항균활성이 있는 3종의 유산균주를 사용하여 발효유를 제조한 결과 대조구인 ABT 5보다는 미생물학적 및 이화학적 변화가 유의적으로 차이는 났으나 관능검사 결과 색, 향기, 조직감, 맛 및 전체적인 기호도가 대조구 대비 80% 이상으로 단독 균주임을 감안하면 우수한 관능적 특성을 가지고 있고, 추후 관능적 특성을 높이기 위한 복합균주에 대한 연구가 추가적으로 진행된다면 발효유 스타터로서의 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유산균주의 내산성 및 내담즙성을 확인할 결과는 어떠한가?
분리된 유산균이 probiotics 및 발효유 starter가 되기 위한 필수조건으로 위장관 상부의 산성 조건 및 담즙이 존재하는 환경에서 생존되어야 장내에 부착되어 기능성을 나타낸다고 보고되어 있다(27). 유산균주의 내산성 및 내담즙성을 확인한 결과(Table 2, 3) 내산성은 Leu. lactis가 99%로 가장 높았으며, 그 다음으로 L. acidophilus, Ped. acidilactici, L. plantarum, 및 Ent. faecium이 각각 96, 95, 94, 및 92%로 높게 나타났다. 내담즙성은 Weissella viridescens를 제외하고 모두 90% 이상의 내담즙성을 확인하였다(Table 3). Kang 등(28)은 발효식품에서 분리한 유산균의 내산성 및 내담즙성을 분석한 결과 내담즙성은 높지만 내산성이 낮은 것으로 보고되고 있으며, 본 연구의 결과에서도 분리된 유산균주의 대부분은 내담즙성은 높지만 내산성이 우수한 유산균주로는 김치에서 분리한 L.
Probiotics란 무엇인가?
Probiotics는 generally recognized as safe(GRAS)로 안전한 미생물이며, 대부분 사람의 장으로부터 유래되며, 내산성 및 내담즙성을 가짐으로써 위장관에서 살아남아 숙주의 장내에 정착하여 숙주에게 건강적 효능을 주는 것으로 보고되어 있다(3,4). Probiotics의 효능으로는 항생제 관련 설사, 병원성 균에 의한 장의 감염, 과민성 대장증후군 같은 위장관 질환 개선, 아토피 피부염 감소, 고혈압 개선, 혈중 콜레스테롤 수준 감소 및 혈중 지질상태 개선, 항비만 효과, 대장암과 위암에 대한 항암 효과 등 다양한 기능성에 대한 연구가 진행되고 있다(5-12).
유산균에는 무엇이 있는가?
발효유는 원유 또는 유가공품을 유산균으로 발효시킨 것으로 정의하고 있으며, 발효유는 완전 식품인 원유에 유산균 starter를 첨가하여 일정한 온도에서 발효시켜 제조되며, starter에 사용되는 유산균은 주로 Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus가 있으며, 대부분이 probiotics에 해당된다(1). Probiotics는 동물의 장내 미생물의 균형을 개선시킴으로써 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물 제제로 주로 유산균이 많이 사용되고 있으며 그 외 Saccharomyces cerevisiae와 같은 효모 및 Aspergilllus oryzae와 같은 사상균이 사용되고 있다(2).
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