Hep3B 간암세포에서 Caspase-3 활성화를 통한 동충하초 열수추출물의 Apoptosis 유도에 관한 연구 Induction of Apoptotic Cell Death by Aqueous Extract of Cordyceps militaris Through Activation of Caspase-3 in Human Hepatocarcinoma Hep3B Cells원문보기
본 연구에서는 동충하초(C. militaris)의 항암작용 기전 해석을 위하여 Hep3B 간암세포의 apoptosis 유발에 미치는 동충하초 열수추출물(WECM)의 영향을 조사하였으며, apoptosis 조절에 중요한 몇 가지 유전자들의 발현 및 활성 변화를 조사하였다. AECM 처리에 의한 Hep3B 세포의 증식억제는 형태적 변형을 동반한 apoptosis 유도와 연관성이 있음을 DAPI 염색을 통한 apoptotic body 출현의 증가 및 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1 기에 속하는 세포 빈도의 증가로 확인하였다. AECM 처리에 의한 apopotosis 유도에서 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자들의 발현은 큰 변화가 없었으나, caspase-3 및 -8의 활성이 매우 높게 증가 되었으며 이는 PARP 및 ${\beta}$-catenin 단백질의 분해와 연관성이 있었다. 또한 caspase-3 선택적 저해제인 z-DEVD-fmk로 caspase-3의 활성을 인위적으로 차단시켰을 경우, AECM에 의한 apoptois 유도 현상이 유의적으로 감소되어 AECM에 의한 Hep3B 세포의 apoptosis 유발에 caspase-3이 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 본 연구의 결과만으로 동충하초에 의한 간암세포의 증식억제 기전을 명확하게 제시할 수는 없으나, 이상의 결과들은 동충하초의 생화학적 항암기전 해석을 이해하는데 중요한 기초자료로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구에서는 동충하초(C. militaris)의 항암작용 기전 해석을 위하여 Hep3B 간암세포의 apoptosis 유발에 미치는 동충하초 열수추출물(WECM)의 영향을 조사하였으며, apoptosis 조절에 중요한 몇 가지 유전자들의 발현 및 활성 변화를 조사하였다. AECM 처리에 의한 Hep3B 세포의 증식억제는 형태적 변형을 동반한 apoptosis 유도와 연관성이 있음을 DAPI 염색을 통한 apoptotic body 출현의 증가 및 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1 기에 속하는 세포 빈도의 증가로 확인하였다. AECM 처리에 의한 apopotosis 유도에서 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자들의 발현은 큰 변화가 없었으나, caspase-3 및 -8의 활성이 매우 높게 증가 되었으며 이는 PARP 및 ${\beta}$-catenin 단백질의 분해와 연관성이 있었다. 또한 caspase-3 선택적 저해제인 z-DEVD-fmk로 caspase-3의 활성을 인위적으로 차단시켰을 경우, AECM에 의한 apoptois 유도 현상이 유의적으로 감소되어 AECM에 의한 Hep3B 세포의 apoptosis 유발에 caspase-3이 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 본 연구의 결과만으로 동충하초에 의한 간암세포의 증식억제 기전을 명확하게 제시할 수는 없으나, 이상의 결과들은 동충하초의 생화학적 항암기전 해석을 이해하는데 중요한 기초자료로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
Cordyceps militaris is a medicinal fungus which has been used for patient suffering from cancer in Oriental medicine. It was previously reported that C. militaris extracts are capable of inhibiting tumor growth and inducing apoptosis; however, the anti-poliferative effects of human cancer cells have...
Cordyceps militaris is a medicinal fungus which has been used for patient suffering from cancer in Oriental medicine. It was previously reported that C. militaris extracts are capable of inhibiting tumor growth and inducing apoptosis; however, the anti-poliferative effects of human cancer cells have been poorly understood. In this study, to elucidate the anti-cancer mechanisms of human cancer cells by treatment with aqueous extract of C. militaris (AECM), we investigated the anti-proliferative effects of AECM in human hepatocarcinoma Hep3B cells. AECM treatment inhibited the growth of Hep3B cells and induced the apoptotic cell death in a concentration-dependent manner such as formation of apoptotic bodies and increased populations of apoptotic-sub G1 phase. The induction of apoptosis by AECM was connected with a proteolytic activation of caspase-3 and caspase-8. and concomitant degradation of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) and ${\beta}$-catenin proteins. Furthermore, caspase-3 inhibitor, z-DEVD-fmk, significantly inhibited AECM-induced apoptosis demonstrating the important role of caspase-3 in the bserved cytotoxic effect. Taken together, these findings suggest that AECM-induced inhibition of human hepatocarcinoma cell proliferation is associated with the induction of apoptotic cell death via activation of caspase-3 and C. militaris may have therapeutic potential in human cancer.
Cordyceps militaris is a medicinal fungus which has been used for patient suffering from cancer in Oriental medicine. It was previously reported that C. militaris extracts are capable of inhibiting tumor growth and inducing apoptosis; however, the anti-poliferative effects of human cancer cells have been poorly understood. In this study, to elucidate the anti-cancer mechanisms of human cancer cells by treatment with aqueous extract of C. militaris (AECM), we investigated the anti-proliferative effects of AECM in human hepatocarcinoma Hep3B cells. AECM treatment inhibited the growth of Hep3B cells and induced the apoptotic cell death in a concentration-dependent manner such as formation of apoptotic bodies and increased populations of apoptotic-sub G1 phase. The induction of apoptosis by AECM was connected with a proteolytic activation of caspase-3 and caspase-8. and concomitant degradation of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) and ${\beta}$-catenin proteins. Furthermore, caspase-3 inhibitor, z-DEVD-fmk, significantly inhibited AECM-induced apoptosis demonstrating the important role of caspase-3 in the bserved cytotoxic effect. Taken together, these findings suggest that AECM-induced inhibition of human hepatocarcinoma cell proliferation is associated with the induction of apoptotic cell death via activation of caspase-3 and C. militaris may have therapeutic potential in human cancer.
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문제 정의
Fig. 3의 결과에서 AECM에 의한 Hep3B 세포의 apoptosis 유도에 caspase-3이 매우 중요한 역할을 할 것으로 나타났기 때문에 AECM 처리에 의한 apoptosis 유도에서 caspase-3의 역할을 재확인하기 위하여 caspase-3의 활성을 인위적으로 억제할 경우 AECM에 의해 유발되는 apoptosis에 어떠한 변화가 나타나는지의 여부를 조사하였다. 먼저 DAPI 염색을 이용하여 핵의 형태를 관찰한 결과는 Fig.
다음은 AECM 처리에 따른 Hep3B 세포의 증식억제 및 형태변형이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지의 여부를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 이용한 apoptotic body의 형성 유무를 관찰하였다. Fig.
본 연구에서는 동충하초(C. militaris)의 항암작용 기전 해석을 위하여 Hep3B 간암세포의 apoptosis 유발에 미치는 동충하초 열수추출물(WECM)의 영향을 조사하였으며, apoptosis 조절에 중요한 몇 가지 유전자들의 발현 및 활성 변화를 조사하였다. AECM 처리에 의한 Hep3B 세포의 증식 억제는 형태적 변형을 동반한 apoptosis 유도와 연관성이 있음을 DAPI 염색을 통한 apoptotic body 출현의 증가 및 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1 기에 속하는 세포 빈도의 증가로 확인하였다.
본 연구에서는 동충하초의 항암기전에 대한 부가적인 해석을 위하여 그동안 연구가 이루어지지 않았던 간암세포의 증식에 미치는 동충하초 추출물의 영향을 조사하였다.
제안 방법
(Palo Alto, CA) 및 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였으며, 제시된 방법에 준하여 활성의 증감 여부를 조사하였다.
22 μm의 pore size를 가진 주사기용 필터유닛을 사용하거나 1회용 펌프 필터 유닛을 사용하여 미생물 및 불순물 을 걸러낸 다음, 배지를 갈아주면서 직접 처리하였다. AECM 처리에 따른 세포의 형태변화는 AECM 처리 48시간 후, 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany) 을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
AECM 처리에 의하여 apoptosis가 유발된 세포의 빈도를 비교하기 위하여 flow cytometry 분석을 실시하였다. 이를 위하여 정상 및 AECM이 함유된 배지에서 자란 세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액(70% ethyl alcohol, 0.
Apoptosis 유발의 증거로 제시되는 apoptotic body의 관찰을 위하여 정상 및 AECM이 처리된 배지에서 배양된 세포를 3.7% formaldehyde 용액으로 상온에서 10분 동안 고정하 였다. 고정된 세포를 PBS로 수세 후, 0.
Fig. 1의 결과에서 확인된 AECM 처리에 따른 Hep3B 간 암세포의 apoptosis 유발에 관여하는 기전의 해석을 위하여 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자들의 발현 변화를 RT-PRC 및 Western blotting으로 조사하였으며, 아울러 caspases의 발현 및 그들의 활성에 미치는 AECM의 영향을 Western blotting 및 in vitro colorimetric assay로 비교하였다.
이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide(EtBr, Sigma)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다(17).
세척 후 1차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 이상 또는 4℃에서 over night시 킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 적절한 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemiluminoesence(ECL) 용 액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL) 을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단 백질의 발현 양상을 비교 분석하였다. 본 실험에 사용된 항 체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
상온에서 15분 정도 염색시킨 후, PBS로 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 증류수로 재빨리 세척한 다음 absolute alcohol을 이용하여 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광현미경(Carl Zeiss, ×400)을 이용하 여 각 농도에 따른 핵의 형태 변화를 관찰하였다(15).
5% Tween 20)을 첨가하여 4℃에서 고정시킨 후, propidium iodide(PI, concentration, 50 μg/mL; Sigma)와 10 kunit의 RNase(Sigma)를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후, nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT(Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다(16).
이를 위하여 정상 및 AECM이 처리된 배지에서 48시간 배양된 세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정량하여 각각 20 μg의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 100 μM이 함유된 extraction buffer[40 mM HEPES(pH 7.4), 20% glycerol(v/v), 1 mM EDTA, 0.2% NP-40 and 10 mM DL-dithiothreitol] 50 μL에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 100 μL가 되게 하였다.
이를 위하여 정상 및 AECM이 함유된 배지에서 자란 세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액(70% ethyl alcohol, 0.5% Tween 20)을 첨가하여 4℃에서 고정시킨 후, propidium iodide(PI, concentration, 50 μg/mL; Sigma)와 10 kunit의 RNase(Sigma)를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 염색하였다.
전사수준에서 apoptosis 관련 유전자들의 발현 정도를 비 교하기 위하여 동일한 조건에서 배양된 Hep3B 세포를 대상으로 RNAzol B를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리 된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 μg의 RNA에서 cDNA를 합성하 였다.
실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline(pNA)이었으며, caspase-8은 IleGlu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었고, caspase-9는 Leu-GluHis-Asp(LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 37℃에서 2시 간동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다(17).
대상 데이터
본 연구에 사용된 동충하초(C. militaris)는 대전대학교 한의과대학 부속 한방병원에서 공급받았으며 선행연구의 방법(15)에 준하여 동충하초 수용액 추출물[aqueous extract of C. militaris(AECM), 수율; 약 15%]을 준비하였으며, 적정 농도로 배지에 첨가하여 녹인 다음, 0.22 μm의 pore size를 가진 주사기용 필터유닛을 사용하거나 1회용 펌프 필터 유닛을 사용하여 미생물 및 불순물 을 걸러낸 다음, 배지를 갈아주면서 직접 처리하였다.
2% NP-40 and 10 mM DL-dithiothreitol] 50 μL에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 100 μL가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline(pNA)이었으며, caspase-8은 IleGlu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었고, caspase-9는 Leu-GluHis-Asp(LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 37℃에서 2시 간동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다(17).
실험에 사용한 Hep3B 간암세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD)에서 분주 받아 사용하였으며, 암세포의 배양을 위해 90%의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY), 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin(Biofluids, Rockville, MD)가 포함된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 본 연구에 사용된 동충하초(C.
데이터처리
The significance was determined by a Student’s t-test ( * p<0.05 vs. untreated control).
실험결과는 평균과 편차로 표시하였고 분산분석으로 분석 후 유의성이 나타난 항목에서 유의성 0.05% 수준에서 Student’s t-test를 실시하여 대조군에 대한 유의성을 검정 하였다.
이론/모형
The cells were treated with variable concentrations of AECM for 48 hr. The growth inhibition was measured by the metabolic-dye-based MTT assay. Results represent the mean±SD of triplicate determinations.
상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA)의 사용법에 따라 동량으로 맞춘 다음 동량의 Laemmli sample buffer(β-melcaptomethanol 5%, Laemmli sample buffer 95%, Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다.
분리 된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 μg의 RNA에서 cDNA를 합성하 였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 증폭하였다 (Table 1). 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 internal control로 사용하였다.
성능/효과
militaris)의 항암작용 기전 해석을 위하여 Hep3B 간암세포의 apoptosis 유발에 미치는 동충하초 열수추출물(WECM)의 영향을 조사하였으며, apoptosis 조절에 중요한 몇 가지 유전자들의 발현 및 활성 변화를 조사하였다. AECM 처리에 의한 Hep3B 세포의 증식 억제는 형태적 변형을 동반한 apoptosis 유도와 연관성이 있음을 DAPI 염색을 통한 apoptotic body 출현의 증가 및 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1 기에 속하는 세포 빈도의 증가로 확인하였다. AECM 처리에 의한 apopotosis 유도 에서 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자들의 발현은 큰 변화가 없었으나, caspase-3 및 -8의 활성이 매우 높게 증가 되었으며 이는 PARP 및 β-catenin 단백질의 분해와 연관성이 있었다.
AECM 처리에 의한 apopotosis 유도 에서 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자들의 발현은 큰 변화가 없었으나, caspase-3 및 -8의 활성이 매우 높게 증가 되었으며 이는 PARP 및 β-catenin 단백질의 분해와 연관성이 있었다.
Fig. 1C에 나타난 바와 같이 AECM을 처리하지 않았을 경우에는 핵의 모양이 정상적으로 염색된 반면에 처리된 AECM의 농도가 증가할수록 세포 밀도의 감소와 더불어 염색질 응축 현상이 증가되어 AECM 처리에 따른 Hep3B 세포의 증식억제는 apoptosis 유도와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
결과에서 알 수 있듯이 AECM이 처리된 배지에서 배양된 Hep3B 세포에서는 처리 농도 의존적으로 caspase-3의 활성이 증가되어 1.0 mg/mL 처리군에서는 대조군에 비하여 약 3배 정도 증가되었다. Caspase-8의 경우도 AECM 처리 농도의 증가에 따라 활성의 정도가 증가되었지만 최대 농도에서 1.
그러나 AECM을 처리하기 전에 caspase-3 선택적 저해제인 z-DEVD-fmk를 1시간 선처리하였을 경우 정상배지에서 자란 Hep3B 세포와 마찬가지 로 apoptotic body가 관찰되지 않았다. 그리고 AECM에 의하여 유도되는 caspase-3의 활성에 미치는 caspase-3 저해제의 영향을 조사한 결과, AECM을 단독으로 처리했을 경우에는 약 5배 정도의 활성 증가가 관찰되었지만 AECM 처리 전 z-DEVD-fmk를 1시간 선처리하였을 경우에는 거의 대조군 혹은 z-DEVD-fmk 단독 처리군 수준으로 caspase-3 의 활성이 감소되었다(Fig. 4B). 그리고 AECM을 단독으로 처리했을 경우에는 약 45% 정도의 sub-G1 빈도가 관찰되었지만 z-DEVD-fmk 선처리에 의하여 sub-G1에 속하는 세포의 빈도는 현저히 감소하여 약 15% 정도로 나타났다(Fig.
4B). 그리고 AECM을 단독으로 처리했을 경우에는 약 45% 정도의 sub-G1 빈도가 관찰되었지만 z-DEVD-fmk 선처리에 의하여 sub-G1에 속하는 세포의 빈도는 현저히 감소하여 약 15% 정도로 나타났다(Fig. 4C). 이상의 결과는 Hep3B 간암세포에서 AECM에 의한 apoptosis의 유도에 caspase-3이 결정적인 역할을 하고 있음을 의미하는 결과이다.
1C에 나타난 바와 같이 AECM을 처리하지 않았을 경우에는 핵의 모양이 정상적으로 염색된 반면에 처리된 AECM의 농도가 증가할수록 세포 밀도의 감소와 더불어 염색질 응축 현상이 증가되어 AECM 처리에 따른 Hep3B 세포의 증식억제는 apoptosis 유도와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 따라서 AECM에 의해 유발된 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 세포주기 sub-G1기에 속하는 세포들 의 빈도를 flow cytometry를 이용하여 측정한 결과, AECM 을 처리하지 않은 세포의 경우는 sub-G1기에 해당하는 세 포가 약 1.65%에 불과했지만 0.8 mg/mL 및 1.0 mg/mL 처리군에서는 각각 10.84% 및 41.12%로 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었지만, 세포주기 특이적 arrest 현상은 관찰할 수가 없었다(Fig. 1D).
AECM 처리에 의한 apopotosis 유도 에서 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자들의 발현은 큰 변화가 없었으나, caspase-3 및 -8의 활성이 매우 높게 증가 되었으며 이는 PARP 및 β-catenin 단백질의 분해와 연관성이 있었다. 또한 caspase-3 선택적 저해제인 z-DEVD-fmk로 caspase-3의 활성을 인위적으로 차단시켰을 경우, AECM에 의한 apoptois 유도 현상이 유의적으로 감소되어 AECM에 의한 Hep3B 세포의 apoptosis 유발에 caspase-3이 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 본 연구의 결과만으로 동충하초에 의한 간암세포의 증식억제 기전을 명확하게 제시할 수는 없으나, 이상의 결과들은 동충하초의 생화학적 항암기전 해석을 이해하는데 중요한 기초자료로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
3의 결과에서 AECM에 의한 Hep3B 세포의 apoptosis 유도에 caspase-3이 매우 중요한 역할을 할 것으로 나타났기 때문에 AECM 처리에 의한 apoptosis 유도에서 caspase-3의 역할을 재확인하기 위하여 caspase-3의 활성을 인위적으로 억제할 경우 AECM에 의해 유발되는 apoptosis에 어떠한 변화가 나타나는지의 여부를 조사하였다. 먼저 DAPI 염색을 이용하여 핵의 형태를 관찰한 결과는 Fig. 1의 C에서 관찰된 바와 같이, 정상배지에서 자란 Hep3B 세포의 경우는 핵의 형태가 정상으로 염색된 반면에 AECM이 처리된 배지에서 자란 Hep3B 세포의 경우는 전형적인 apoptotic body가 관찰되었다(Fig. 4A). 그러나 AECM을 처리하기 전에 caspase-3 선택적 저해제인 z-DEVD-fmk를 1시간 선처리하였을 경우 정상배지에서 자란 Hep3B 세포와 마찬가지 로 apoptotic body가 관찰되지 않았다.
1에 나타낸 바와 같다. 먼저 Hep3B 세포의 증식에 미치는 AECM의 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 48시간 동 안 정상 배지에서 자란 세포에 비하여 AECM이 함유된 배지에서 배양된 Hep3B 세포의 경우 AECM의 첨가 농도 의존적으로 세포의 증식이 감소하였음을 알 수 있었다(Fig. 1A). 즉 0.
0 mg/mL의 농도에서는 약 70% 정도의 증식억제 효과가 나타났다. 이러한 AECM 처리에 따른 Hep3B 세포의 증식억제 현상은 다양한 형태 변화와도 연관 성이 있었는데, 처리된 AECM의 농도가 증가할수록 암세포 의 밀도가 감소되었고, 전체적으로 세포질이 응축되었다. 또 한 세포의 모양이 길어지면서 분지를 형성하였으며, AECM 처리 농도의 증가에 따라 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 증가되었다(Fig.
4C). 이상의 결과는 Hep3B 간암세포에서 AECM에 의한 apoptosis의 유도에 caspase-3이 결정적인 역할을 하고 있음을 의미하는 결과이다.
이상의 결과를 동일 조건에서 수행된 A549 폐암세포의 결과와 비교해 볼 때, A549 암세포의 50% 정도 증식억제 효능을 나타낸 동충하초 열수추출물의 농도가 약 2.0 mg/ mL 정도였으며, 5.0 mg/mL 처리군에서 약 80% 정도의 증식억제 효과를 나타낸 것에 비하여(16) Hep3B 세포에서는 저농도에서 매우 강력한 증식억제 효과를 보였을 알 수 있었다. 그리고 혈구암세포에서보다는 감수성이 다소 낮았지만(17,18), 전반적으로 AECM 처리에 따른 암세포의 증식 억제는 apoptosis 유도와 밀접한 연관성을 지님을 잘 알 수 있었다.
제시된 결과에서 알 수 있듯이 AECM의 처리 농도 증가에 따라 PARP 및 β-catenin 단백질의 단편화 정도가 점차 증가함을 알 수 있었으며, 이는 AECM 처리에 따른 apoptosis 유도에 caspase-3 이 매우 중요한 역할을 하고 있음을 보여주는 결과이다.
1A). 즉 0.2 mg/mL의 AECM을 처리하였을 경우에는 약 22% 정도의 증식억제가 나타났지만 처리 농도의 증가에 따라 증식 억제 정도가 증가하여 2.0 mg/mL의 농도에서는 약 70% 정도의 증식억제 효과가 나타났다. 이러한 AECM 처리에 따른 Hep3B 세포의 증식억제 현상은 다양한 형태 변화와도 연관 성이 있었는데, 처리된 AECM의 농도가 증가할수록 암세포 의 밀도가 감소되었고, 전체적으로 세포질이 응축되었다.
후속연구
또한 caspase-3 선택적 저해제인 z-DEVD-fmk로 caspase-3의 활성을 인위적으로 차단시켰을 경우, AECM에 의한 apoptois 유도 현상이 유의적으로 감소되어 AECM에 의한 Hep3B 세포의 apoptosis 유발에 caspase-3이 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 본 연구의 결과만으로 동충하초에 의한 간암세포의 증식억제 기전을 명확하게 제시할 수는 없으나, 이상의 결과들은 동충하초의 생화학적 항암기전 해석을 이해하는데 중요한 기초자료로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
고대로부터 중국에서 한방약재로 사용되어온 대표적인 동충하초인 C. militaris와 C. sinensis에 대한 연구에서 알려진 효과들은 무엇이 있는가?
sinensis이다(6). 최근까지 본 연구와 관련 있는 결과들을 살펴보면, C. sinensis의 추출물 또는 유효성분들은 백혈병세포 증식억제효과(7,8), 폐암 세포의 전이 억제효과(9), 항염증효과(10) 등이 있는 것으로 보고된 바 있다. 그리고 C. militaris 역시 세포독성 및 유전 독성 억제효과(11), 항산화성 및 항돌연변이 효과(12), 혈관 신생 및 종양생성 억제효과(13), 고형암 성장 억제 및 면역활성 작용(14), apoptosis 유발에 의한 암세포증식억제효과 (15) 등이 있는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 정확한 항암기전이 밝혀지지는 않았다.
세포의 죽음은 어떻게 구분될 수 있는가?
세포의 죽음은 necrosis와 apoptosis로 구분되며, 이것은 세포의 형태학적 및 생화학적인 특성에 의하여 구분될 수 있다. 그 중 apoptosis는 개체의 발생단계나 DNA 손상, 바이러스 감염 등에 따른 유전적 조절 하에서 일어나는 개체보존 수준에서 손상된 세포들의 제거를 위한 중요한 방어기전이라는 점에서 생리적 또는 화학적 외상에 의한 세포의 죽음인 necrosis와 구별된다(1,2).
caspase의 특징은 무엇인가?
따라서 apoptosis 유발 해석에 대한 연구는 특히 암세포의 과다한 증식과 성장억제에 대한 연구에 필연적인 것으로 사료된다. 그중 caspase라고 이름 붙여진 ICE/CED-like protease family는 apoptosis 유발에 가장 중 요한 중심 조절자로서 알려져 있으며, 이들은 proenzyme 형태로 존재하다가 apoptosis 유도를 활성화시키는 신호에 의해 활성화된 cysteine-related protease로 되어 직ㆍ간접적으로 세포 내에 존재하는 많은 표적 단백질의 분해에 관여하게 된다(3,4).
참고문헌 (31)
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