[논문]전자토모그래피의 정량적 분석에서 대물렌즈 조리개의 영향

김진규; 이상희; 권희석; 정종만; 정원구; 이수정; 주형태; 김윤중

[국내논문] 전자토모그래피의 정량적 분석에서 대물렌즈 조리개의 영향
Objective Aperture Effects for the Quantitative Analysis in Electron Tomography 원문보기

한국현미경학회지 = Korean journal of microscopy, v.38 no.4, 2008년, pp.285 - 291

김진규 (한국기초과학지원연구원 전자현미경연구부) , 이상희 (한국기초과학지원연구원 전자현미경연구부) , 권희석 (한국기초과학지원연구원 전자현미경연구부) , 정종만 (한국기초과학지원연구원 전자현미경연구부) , 정원구 (한국기초과학지원연구원 전자현미경연구부) , 이수정 (한국지질자원연구원 자원활용소재연구부) , 주형태 (한국해양연구원 해양위성.관측기술연구부) , 김윤중 (한국기초과학지원연구원 전자현미경연구부)

초록
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Electron tomography의 정량적 분석을 위해서 대물렌즈 조리개가 투과빔의 강도에 미치는 영향을 평가하였다. Electron tomography에 도입되는 Beer's law의 올바른 적용을 위해서는 투과빔은 시료의 기울기에 따른 mass thickness의 변화에 의한 효과만을 반영해야 한다. 그러므로 빔 경로상의 대물렌즈 조리개, 홀더 등에 의한 다른 효과는 제거되어야 한다. 본 연구에서는 대물렌즈 조리개의 cut-off 효과를 120 kV TEM과 Quantifoil holey 카본 시료를 이용하여 상세히 평가하였다. 대물렌즈 조리개를 사용하지 않은 경우와 비교할 때, $30{\mu}m$ 크기의 대물렌즈 조리개를 통과한 투과전자빔의 강도는 약 16.7%의 감소가 일어난다. 또한 $55^{\circ}$ 이상의 고경사각 기울기에서는 대물렌즈 조리개의 cut-off 효과에 의해 14.2%의 강도 감소가 추가적으로 발생함을 알 수 있었다. Electron tomography에서 정량 분석을 위해서는 이러한 대물렌즈 조리개의 영향을 고려해야만 한다. 또한 Beer's law의 올바른 적용을 위해서는 일련의 기울기에 따른 2차원적 영상은 가능하면 대물렌즈 조리개를 사용하지 않은 상태에서 획득하는 것이 바람직하다.

Abstract ▼ AI-Helper

We have evaluated the effects of experimental factors on transmitted electron beam intensities for quantitative analysis in electron tomography. For the correct application of Beer's law in electron tomography, the transmitted beam intensity should reflect the net effect of mass properties on beam path. So, the any other effects of the objective aperture and the specimen holder on beam path should be removed. The cut-off effects of objective aperture were examined using Quanti-foil holey carbon film and a transmission electron microscope operated at 120 kV. The transmitted beam intensities with $30{\mu}m$ objective aperture dropped about 16.7% compared to electron beam intensities without the objective aperture. Also, the additional losses of about 14.2% at high tilt angles were occurred by cut-off effects of the objective apertures. For the precise quantitative analysis in electron tomography, the effect of the objective aperture on transmitted electron beam intensities should be considered. It is desirable that 2-D tilt series images are obtained without the objective aperture for correct application of Bee's law.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Carl Zeiss TEM은 다른 장비와 달리 Köhler illumination system을 갖추고 있어서 형광판 또는 CCD 카메라에 도달하는 전자빔은 균일한 강도분포를 나타내기 때문에 본 연구의 목적에 적합한 장비라 할 수 있다.
배율은 앞서서 측정한 경우와 동일한 조건을 맞추기 위해, 전자빔이 시료를 통과하는 부분과 통과하지 않는 부분이 적절히 나타나도록 5,000배로 고정하였다. 또한 에너지 여과장치의 슬릿 조리개를 제거하여 슬릿 조리개의 유동에 의한 전자빔의 불안정성을 억제하여 대물렌즈 조리개에 의한 효과를 정밀히 측정하고자 하였다. 14-bit CCD 카메라에 기록된 영상은 16 bit gray scales의 형식으로 저장되었다.
본 연구에서는 electron tomography를 이용한 시료의 3차원적 복원에 있어서 보다 정량적인 결과를 도출하기 위해 가장 중요한 요소인 시료의 영상강도에 영향을 미칠 수 있는 빔 경로상의 실험적 요인에 대한 영향을 조사하고자 하며 특히, 시료를 통과한 투과빔의 강도에 직접적으로 영향을 주는 대물렌즈 조리개의 효과를 집중적으로 다루고자 한다.
자동으로 2차원적 연속 기울기 이미지를 획득하는 장비 및 프로그램의 경우에 장비의 정렬상태가 나쁘거나 고니오미터의 불안정도를 보정하지 않는 상태로 실험을 수행하게 되면, 연속 기울기에 따른 시료의 이동과 초점의 조정량이 과대하게 되어 오히려 이미지의 콘트라스트 및 영상강도에 나쁜 영향을 주게 된다. 본 연구에서는 이러한 문제를 피하기 위해 수동으로 고니오미터를 미세하게 조정하여 연속기울기를 수행하였다.
Electron tomography를 이용한 3차원적 구조 복원을 위해서는 순수하게 시편의 기울기에 따른 투과전자빔의 강도만을 고려하여 Beer’s law를 적용해야 한다. 하지만 콘트라스트 증대를 위해 사용되는 대물렌즈 조리개의 크기에 따라 전자빔 강도의 왜곡이 발생함을 알 수 있었으며, 이에 대한 정량적인 평가를 수행하였다. 대물렌즈 조리개를 사용하지 않은 경우와 비교해 볼 때, 대물렌즈 조리개에 의한 cut-off 효과는 최대 16.

제안 방법

Electron tomography의 정량적 분석을 위해 도입되는 Beer’s law의 올바른 적용을 위해 시료의 기울기에 따라 시료를 통과한 전자빔에 대한 대물렌즈 조리개의 영향을 평가하였다.
각각의 경우에 대해서 연속 기울기에 따른 영상은 0°~60°범위 내에서 5°간격으로 측정을 하였다.
대물렌즈 조리개는 앞선 경우와 마찬가지로 open, 30 μm, 60μm, 90 μm의 크기를 적용하였으며, 시료의 영향을 고려하기 위해 시료가 없는 부분(시료내의 구멍)과 시료가 있는 부분(C-thin film)을 나누어서 측정하였다.
이를 위해 첫 번째로 시료와 holder가 삽입되지 않고 순수하게 대물렌즈 조리개의 크기(30 μm, 60 μm 90 μm)만을 변화시키며 전자빔이 검출기에 도달하는 강도를 측정하였다. 두 번째로, 시료가 장착되지 않은 홀더를 삽입하여 대물렌즈 조리개의 크기에 따라 통과한 전자빔이 검출기에 도달하는 경우를 측정하였고 마지막으로 준비된 시료가 장착된 홀더를 삽입 후, 대물렌즈 조리개의 크기에 따라 통과한 전자빔이 검출기에 도달하는 경우를 측정하였다. 각각의 경우에 대해서 연속 기울기에 따른 영상은 0°~60°범위 내에서 5°간격으로 측정을 하였다.
두 번째로는 시료를 장착하지 않은 채, 고니오미터의 기울기에 따라 홀더에 의한 전자빔의 산란의 영향을 고려해 보았다. Fig.
마지막으로 표준시료를 장착한 시료 홀더를 삽입하여 시료의 기울기에 따른 전자빔의 강도 변화를 관찰하였다. 대물렌즈 조리개는 앞선 경우와 마찬가지로 open, 30 μm, 60μm, 90 μm의 크기를 적용하였으며, 시료의 영향을 고려하기 위해 시료가 없는 부분(시료내의 구멍)과 시료가 있는 부분(C-thin film)을 나누어서 측정하였다.
1에 시료를 삽입하지 않은 상태에서의 대물렌즈 조리개와 시료홀더의 영향을 고려하기 위해 기록한 전자빔의 강도 분포에 대한 이미지를 나타내었다. 시료를 통과한 전자빔이 시료 위치 하단에 위치한 각각의 렌즈와 조리개의 영향을 받는 것을 배제하는 것이 중요하기 때문에 먼저 각 렌즈의 전류값은 중간값으로 지정하였고, 시료의 높이 또한 표준시료를 이용하여 유센트릭 높이를 조정하였다.
Electron tomography의 정량적 분석을 위해 도입되는 Beer’s law의 올바른 적용을 위해 시료의 기울기에 따라 시료를 통과한 전자빔에 대한 대물렌즈 조리개의 영향을 평가하였다. 시료에 입사하는 전자빔의 유동성을 최소화하기 위해 전자빔의 전류밀도의 안정화를 수행하고, 집속렌즈, 집속렌즈 조리개, 대물렌즈, 중간렌즈, 확대렌즈 등 기타 변수를 고정하여 대물렌즈 조리개 이외에 시료를 통과한 전자빔의 강도에 영향을 주는 변수들의 영향을 배제하였다. Electron tomography를 이용한 3차원적 구조 복원을 위해서는 순수하게 시편의 기울기에 따른 투과전자빔의 강도만을 고려하여 Beer’s law를 적용해야 한다.
2%의 감소가 일어남을 알 수 있다. 이러한 현상은 시편의 두께에도 의존할 수 있기 때문에 시료의 두께를 측정해 보았다. 시료의 두께는 제조사(Quantifoil Micro Tools GmbH, Germany)의 사양에 의하면 약 20 nm 정도이며, low-loss 영역의 electron energy loss spectrum (EELS) 측정과 log-ratio 방법을 이용하여 계산한 결과 약 18.
이를 위해 첫 번째로 시료와 holder가 삽입되지 않고 순수하게 대물렌즈 조리개의 크기(30 μm, 60 μm 90 μm)만을 변화시키며 전자빔이 검출기에 도달하는 강도를 측정하였다.
전자빔의 강도를 측정하기 위한 선택된 영역이 너무 넓으면 quantifoil의 표면의 불균일한 정도에 의한 영향이 있을 수 있기 때문에 최대한 균일한 곳을 선택하여 90×90 픽셀 영역을 기준으로 삼았다.

대상 데이터

대물렌즈 조리개는 앞선 경우와 마찬가지로 open, 30 μm, 60μm, 90 μm의 크기를 적용하였으며, 시료의 영향을 고려하기 위해 시료가 없는 부분(시료내의 구멍)과 시료가 있는 부분(C-thin film)을 나누어서 측정하였다. Fig. 5는 5,000배에서 측정한 quantifoil의 이미지이며, 고니오미터의 기울기축과 근접한 영역에 대해 시료가 없는 1곳과 시료가 존재하는 2곳을 선택하였다. 전자빔의 강도를 측정하기 위한 선택된 영역이 너무 넓으면 quantifoil의 표면의 불균일한 정도에 의한 영향이 있을 수 있기 때문에 최대한 균일한 곳을 선택하여 90×90 픽셀 영역을 기준으로 삼았다.
본 연구에 사용한 시료는 QUANTIFOIL R 2/2 (Quantifoil Micro Tools GmbH, Germany)이며, Cu 그리드의 각 mesh내에 2 μm 간격으로 2 μm 크기의 구멍이 일정하게 존재하기 때문에 시료를 통과하지 않은 전자빔과 시료를 통과한 전자빔의 강도를 측정하는 데 적당하다.
이 시료의 분석을 위해 전자현미경은 120 kV에서 작동하는 EM912 Ω (Carl Zeiss, Germany)를 사용하였다.

성능/효과

하지만 콘트라스트 증대를 위해 사용되는 대물렌즈 조리개의 크기에 따라 전자빔 강도의 왜곡이 발생함을 알 수 있었으며, 이에 대한 정량적인 평가를 수행하였다. 대물렌즈 조리개를 사용하지 않은 경우와 비교해 볼 때, 대물렌즈 조리개에 의한 cut-off 효과는 최대 16.7% 정도가 발생하며 추가적으로 시료의 기울기에 따른 cut-off 효과는 최대 14.2% 정도가 발생하였다. 이러한 오차를 줄이기 위해서는 분석하고자 하는 시료의 두께를 최적화하여 적정 콘트라스트를 유지하고, 가능하면 대물렌즈 조리개를 사용하지 않고 2차원적 영상 강도를 획득하여야 하며, 부득이 대물렌즈 조리개를 사용할 경우에는 그 영향을 고려하여야 한다.
두 번째로는 사용된 시료의 두께 범위 또한 금속박막을 약 10 nm~200 nm까지 폭넓게 변화시키면서 측정 및 분석을 시도한 반면에 electron tomography에서는 60°의 고경사각 기울기에서도 약 2배 정도의 두께 변화만이 발생하기 때문에 약 20 nm~40 nm 사이의 좁은 범위 내에서의 측정 및 분석이 가능하다는 것이다.
3과 같이 검출기에 도달한 강도는 고니오미터의 기울기에는 의존하지 않고 거의 일정하게 유지되는 것을 알 수 있다. 또한 검출기를 이용하여 전자빔의 강도를 측정한 결과로부터 불특정 다수의 기울기 각도에서 전자빔의 강도가 불규칙하게 측정되고 있는 것을 알 수 있었다. 각각의 경우에 대해 평균 전자빔의 강도 대비 표준편차 값을 구해 보면 약 2%의 불규칙한 튐 현상을 보여주고 있으며, 이것은 열전자 방출 방식의 LaB₆ gun의 특성으로 여겨지며 일반적인 field emission gun (FEG)의 전류밀도의 안정도가 약 5%인 점을 감안할 때, LaB₆의 불안정도는 피할 수는 없으나, 무시할 수 있을 것으로 판단된다(Williams & Carter, 1995).
본 연구에서의 가장 중요한 것은 Beer’s law를 적용하기 위해서는 순수하게 시료의 기울기에 의한 전자빔의 강도의 변화만을 고려해야 하지만, 대다수의 연구자들은 시료의 콘트라스트를 증대시키기 위해 작은 사이즈의 대물렌즈 조리개를 사용한다는 것이다. 상기에서 언급했듯이, 대물렌즈 조리개를 사용할 경우에 고경사각에서 최대 14.2%의 오차를 발생할 수 있으며 또한 대물렌즈 조리개의 크기에 의한 전자빔 차단으로 인해 측정된 전자빔의 강도는 최대 16.7%까지 감소되어 총 28.5%의 오차를 불러올 수 있다는 것이다.
이러한 현상은 시편의 두께에도 의존할 수 있기 때문에 시료의 두께를 측정해 보았다. 시료의 두께는 제조사(Quantifoil Micro Tools GmbH, Germany)의 사양에 의하면 약 20 nm 정도이며, low-loss 영역의 electron energy loss spectrum (EELS) 측정과 log-ratio 방법을 이용하여 계산한 결과 약 18.8~20.6 nm이었다. 일반적으로 저전압 TEM (80~120 kV)에서 electron tomography를 수행하는 경우, 의∙생물 시료는 효율적인 3차원적 정보를 확보하기 위해 최대 200 nm~250 nm의 두께를 사용하고 있기 때문에 대물렌즈 조리개의 영향은 보다 심각하게 작용할 수 있다.

후속연구

4와 같이 전자빔의 강도는 시료의 기울기에 의존하지 않으며, 단지 대물렌즈 조리개의 크기에 따른 전자빔의 cut-off 효과만이 존재할뿐이다. 이로부터, electron tomography를 수행하고자 하는 시료가 미세한 hole을 포함하고 있다면, 실험을 수행할 때 빈 공간내의 전자빔의 강도를 측정하여 시편에 입사된 전자빔의 강도의 예측이 가능하며, 실험 전, 후의 전자빔이 강도를 비교 및 선형적 fitting을 한다면 실험 도중의 전자빔 강도의 자연적 감쇠의 영향을 판단하여 보다 정밀히 시료의 기울기에 따른 입사빔의 강도를 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
이와 같이 시료의 두께가 매우 얇고 탄소막으로 구성된 저밀도 시료에 대해서 Beer’s law의 성립 여부에 대해서는 새로운 고려가 필요하며, 또한 실제 시료에 대한 electron tomography 방법에서 측정된 자료를 이용한 정량적 회귀분석을 통해 시료의 기울기에 따른 영상 강도 변화의 평가가 수행되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	electron tomography란 무엇인가?	Transmission electron microscope (TEM)를 이용하여 획득한 일련의 2차원적 영상들로부터 3차원적 정보를 추출해 내는 electron tomography는 의∙생물, 재료과학, 지질학 등 다양한 분야에서 시료의 구조적인 문제점을 해결하기 위해 널리 사용되어지고 있다. Electron tomography의 이론적인 접근은 처음으로 1917년에 정립되었으나(Radon, 1917), 실제로 TEM을 이용한 연구는 1968년도에 의∙생물 분야에서 시작이 되었으며(Hart, 1968; DeRosier & Klug, 1968), 최근에 TEM 장비의 급속한 발전과 더불어 재료∙화학분야(Midgley & Weyland, 2002; Friedrich et al.
	Electron tomography를 이용한 시료의 3차원적 영상의 구현은 상용화된 분석프로그램을 사용하여 쉽고 빠르게 결과를 도출하여 낼 수 있지만, 실제로 복원된 영상의 신뢰도의 향상을 위해서는 아직도 많은 연구가 시도되고 있는데 그 이유는 무엇인가?	Electron tomography를 이용한 시료의 3차원적 영상의 구현은 상용화된 분석프로그램을 사용하여 쉽고 빠르게 결과를 도출하여 낼 수 있지만, 실제로 복원된 영상의 신뢰도의 향상을 위해서는 아직도 많은 연구가 시도되고 있다. 그 이유는 2차원 영상을 획득할 때 발생하는 입사빔의 강도와 CCD 성능(Jou et al., 2008), 고니오미터 및 시료홀더의 성능(Kim et al., 2006)에 관계되는 문제로 인해 3차원적 복원 과정에서 영상의 잡음이 존재하기 때문이다.
	HVEM을 사용하여 무엇의 영향력을 최소화할 수 있는가?	이외에도 high voltage electron microscope (HVEM)을 사용할 경우에는 대물렌즈 조리개의 영향력을 최소화할 수 있다. HVEM의 경우, 투과력이 강하기 때문에 상대적으로 콘트라스트는 저하되지만, 저전압 TEM과 동일한 크기인 30 μm의 대물렌즈 조리개를 이용하여 C-supporting film에 대한 투과전자빔의 강도를 측정한 결과, 약 4%의 전자빔 강도의 감소밖에 일어나지 않기 때문에 대물렌즈 조리개에 의한 오차를 줄일 수 있다(Unpublished data).

참고문헌 (10)

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Friedricha H, McCartneyb MR, Busecka PR: Comparison of intensity distributions in tomograms from BFTEM, ADFSTEM, HAADFSTEM, and calculated tilt series. Ultramicroscopy 106 : 18-27, 2005

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Hart RG: Electron microscopy of unstained biological material: the polytropic montage. Science 159 : 1464-1467, 1968

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Jou HT, Lee S, Kim YJ, Suk BC: Model simulation for assessment of image acquision errors affecting electron tomography. Korean J Microscopy 38(1) : 51-61, 2008. (Korean)
Kim JG, Jeong JM, Kim YM, Kim YJ: Reliability test of the TEM rotation holder for 3-D structure analysis. Korean J Microscopy 36(3) : 209-216, 2006. (Korean)
Midgley PA, Weyland M: 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy 96 : 413-431, 2003

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Pozsgai I: Thickness determination by measuring electron transmission in the TEM at 200 kV. Ultramicroscopy 68 : 69-75, 1997

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Radon J: Ber. Verh. K. Sachs. Ges. Wiss. Leipzig, Math. Phys. Kl. 69 : 262, 1917
Williams DB, Carter CB: Transmission Electron Microscopy-A Textbook for Materials Science. Plenum Press, New York and London, pp. 69-83, 1995

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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