본 연구에서는 의생물 시료에 대해 정량적 전자토모그래피의 기본 전제 조건인 Beer's law를 실험적으로 검증하였다. 시료는 의생물 시료와 비슷한 흡수계수를 갖는 카본 지지막과 latex sphere의 시료를 선택하였으며, 연속적으로 기울어진 TEM 이미지를 획득하였다. 우선, 전자토모그래피를 수행하여 카본 지지막과 latex sphere의 기본 상태를 파악하였다. Beer's law의 검증을 위해 각각의 물질에 대해 경사각 기울기에 따라 입사빔의 강도와 투과빔의 강도의 변화를 측정하여 회귀분석을 수행하였으며, 그 결과 RMS값 0.976의 범위에서 선형적인 관계를 확인할 수 있었다. 또한 Beer's law를 이용하여 카본 지지막과 latex sphere에 대한 각각의 상대적인 흡수계수를 구했으며, 그 값은 대략 1.71(5)/${\mu}m$과 2.67(6)/${\mu}m$으로 경사각 기울기에 대하여 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 따라서, 정밀한 실험조건에서 입사빔의 정보를 유추할 수 있다면 의생물 시료에 대해 엄밀한 Beer's law가 성립하는 정량적인 전자토모그래피가 수행될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 의생물 시료에 대해 정량적 전자토모그래피의 기본 전제 조건인 Beer's law를 실험적으로 검증하였다. 시료는 의생물 시료와 비슷한 흡수계수를 갖는 카본 지지막과 latex sphere의 시료를 선택하였으며, 연속적으로 기울어진 TEM 이미지를 획득하였다. 우선, 전자토모그래피를 수행하여 카본 지지막과 latex sphere의 기본 상태를 파악하였다. Beer's law의 검증을 위해 각각의 물질에 대해 경사각 기울기에 따라 입사빔의 강도와 투과빔의 강도의 변화를 측정하여 회귀분석을 수행하였으며, 그 결과 RMS값 0.976의 범위에서 선형적인 관계를 확인할 수 있었다. 또한 Beer's law를 이용하여 카본 지지막과 latex sphere에 대한 각각의 상대적인 흡수계수를 구했으며, 그 값은 대략 1.71(5)/${\mu}m$과 2.67(6)/${\mu}m$으로 경사각 기울기에 대하여 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 따라서, 정밀한 실험조건에서 입사빔의 정보를 유추할 수 있다면 의생물 시료에 대해 엄밀한 Beer's law가 성립하는 정량적인 전자토모그래피가 수행될 수 있을 것으로 기대된다.
This study has examined experimentally the Beer's law which is a precondition for quantitative electron tomography. We used carbon support film and latex spheres, which have similar absorption coefficients with biological samples, as the test samples to take a tilt-series of images for electron tomo...
This study has examined experimentally the Beer's law which is a precondition for quantitative electron tomography. We used carbon support film and latex spheres, which have similar absorption coefficients with biological samples, as the test samples to take a tilt-series of images for electron tomography. First, the 3D information of carbon film and latex spheres was obtained by electron tomography. Then, the regression analysis on the relationship between the intensities of the incident and the transmitted beams in a tilt series was carried out to examine the Beer's law. The regression results with RMS error of 0.976 show the linear intensity variations of the transmitted beam as the tilt angles were increased. In addition, the relative absorption coefficients of carbon support film and latex spheres calculated experimentally through the Beer's law were 1.71 (5) and 2.67 (6)/${\mu}m$, respectively. The absorption coefficients remained constant within a full tilt range. Therefore, it is expected that quantitative electron tomography could be performed for biological samples by applying Beer's law provided the exact intensity of incident beam can be obtained under the thoroughly controlled experimental conditions.
This study has examined experimentally the Beer's law which is a precondition for quantitative electron tomography. We used carbon support film and latex spheres, which have similar absorption coefficients with biological samples, as the test samples to take a tilt-series of images for electron tomography. First, the 3D information of carbon film and latex spheres was obtained by electron tomography. Then, the regression analysis on the relationship between the intensities of the incident and the transmitted beams in a tilt series was carried out to examine the Beer's law. The regression results with RMS error of 0.976 show the linear intensity variations of the transmitted beam as the tilt angles were increased. In addition, the relative absorption coefficients of carbon support film and latex spheres calculated experimentally through the Beer's law were 1.71 (5) and 2.67 (6)/${\mu}m$, respectively. The absorption coefficients remained constant within a full tilt range. Therefore, it is expected that quantitative electron tomography could be performed for biological samples by applying Beer's law provided the exact intensity of incident beam can be obtained under the thoroughly controlled experimental conditions.
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문제 정의
이 논문에서는 전자빔 흡수계수가 크지 않은 의생물 실험환경에서 Beer’s law를 검증하기 위해서 carbon 막상에 존재하는 latex sphere에 대한 TEM 실험을 통해 여러 가지 다양한 방법으로 입사빔의 강도 및 Beer’s law를 검증하여 정량적 토모그래피를 위한 기초자료로 이용하고자 한다.
한편 보다 두꺼운 시료에 대해서는 정량적인 I0의 도출을 위해서는 투과빔의 다중회절과 시료내의 구성 원자들에 의한 영향을 고려해야만 하지만(Levine, 2005), 본 연구에서는 일반적인 Beer’s law의 적용에 대해서 논의하고자 한다.
제안 방법
Beer’s law의 검증에 앞서 latex sphere의 상태 및 카본 막의 기울어짐 정도를 확인하기 위해 토모그래피를 수행하여 latex sphere와 카본 지지막의 3차원적 구조 복원을 시도하였다.
Beer’s law의 검증에 앞서 사용된 시료인 latex sphere의 상태 및 카본 막의 기울어짐 정도를 확인하기 위해 전자토모그래피를 수행하였으며, 이러한 토모그래피 작업에 사용되는 각 영상의 정렬, z-축 tomogram 구현, 그리고 3D visualization 작업은 TEMography (JEOL Ltd.) 프로그램을 이용하였다.
). Hole 영역의 강도 측정을 통해 간접적으로 I0의 강도변화를 측정한 후, 카본 지지막을 통과한 전자빔의 강도 변화를 측정하였다. 카본 지지막을 통과한 전자빔의 강도변화는 I0의 강도변화에 대한 영향과 기울기 각도에 따른 카본 지지막의 두께 변화에 따른 강도변화의 영향이 포함되어 나타난다고 간주할 수 있다.
두 번째로 측정된 I0 및 빔투과 두께 등을 이용해 두 물질에 대한 흡수계수를 구해 보았다. 카본 지지막과 hole의 가장자리에 위치한 latex sphere의 영역은 각각 동일 물질에 대한 강도가 분포되어 있으므로 기울기 경사각에 대한 두께를 고려해주면 같은 흡수계수를 나타내어야 한다.
서로 다른 두 개의 위치에 존재하는 latex sphere를 통과한 전자빔의 강도 변화를 측정하였다. 만약 latex sphere가 완벽한 sphere의 성질을 지니고 있다면, 고니오미터의 기울기가 증가 또는 감소하더라도 latex sphere의 중심 부분의 두께는 변하지 않기 때문에 투과전자빔의 강도(It)는 일정하게 유지되어야 한다.
연속 기울기에 따른 영상은 +55°~-55° 범위 내에서 5°간격으로 16 bit의 동적범위를 가지고 있는 2 k CCD 카메라(F224HD, TVIPS)를 이용하여 획득하였다.
TEM은 120 kV에서 작동하는 EM912 Ω(Carl Zeiss, Germany)를 사용하였다. 전자총(LaB6)의 특성을 고려하여 전류밀도의 불안정도에 의한 영향을 최소화하기 위해 약 1시간 동안 안정화시켰다. 영상을 획득하기 위해 사용되는 대물렌즈 조리개는 크기에 따라 고경사각에서 자연적인 투과빔의 강도저하가 발생하기 때문에 이에 대한 영향을 방지하고자 사용하지 않았다(Kim et al.
카본 지지막의 두께(z)는 평평한 상황에서의 초기 두께 30 nm에 대해 카본 지지막의 경사각 θ에 따라 30/cosθ nm을 적용하였고, latex sphere는 두께가 변하지 않기 때문에 모든 경사각에 대하여 75 nm를 적용하였다.
대상 데이터
TEM은 120 kV에서 작동하는 EM912 Ω(Carl Zeiss, Germany)를 사용하였다.
3에는 상기와 같은 방법을 통하여 수행된 tomogram 결과를 나타내었다. Tomogram은 z축 방향으로 약 125 nm의 두께에 대하여 190개의 slice image를 이용하여 구축하였다. Fig.
2(a)에는 0° 기울기 이미지에 대해 연속기울기에 따른 영상 강도 변화를 측정하기 위해 사용된 영역(□)과 각각의 영역에 대하여 기울기 각도가 변함에 따라 영상강도의 변화양상에 대한 결과를 나타내었다. 각각의 측정 영역은 앞서 언급한 바와 같이, I0를 측정하기 위한 hole 영역, It를 측정하기 위한 카본 지지막영역, 카본 지지막 위에 위치한 latex sphere, 그리고 hole의 가장자리에 위치한 latex sphere의 4곳을 선택하였다. 선택한 영역의 크기는 각각의 영역에 대하여 최대한 균일한 곳을 선택하여 61×61 픽셀 영역을 기준으로 삼았다.
본 연구에 사용한 시료는 대략 75 nm 직경의 polystyrene latex sphere (Ted pellar Inc.)이며, 200 mesh의 holey carbon Cu 그리드(EMS Com.)위에 분산시켜 관찰하였다. TEM은 120 kV에서 작동하는 EM912 Ω(Carl Zeiss, Germany)를 사용하였다.
데이터처리
앞서서 획득한 토모그래피의 결과가 Beer’s law를 만족하는지 검증하기 위해 기울기 각에 따른 카본 지지막 및 latex sphere에 대한 입사빔 통과 두께 및 투과빔의 관계를 이용하여 회귀분석을 실시하였으며 상술하면 다음과 같다.
이렇게 구해진 토모그래피 결과를 고려하면서 획득 영상으로부터 추출된 입사빔의 강도(I0)와 투과빔의 강도(It)를 이용하여 Beer’s law의 검증을 시도하였다.
첫 번째로 카본 지지막에 대한 투과빔의 강도에 대하여 선형회귀분석을 실시하였으며, Fig. 5에 카본 지지막의 빔 투과 두께와 투과빔의 강도에 대한 관계를 나타내었다. Beer’s law가 성립한다면 기울기 각에 따라 시료의 두께 및 흡수계수의 일정한 변화에 따라 It가 달라지기 때문에 It는 각도 변화에 따른 투과빔의 지지막 통과 길이(두께)와 연관된다.
이론/모형
Beer’s law의 검증에 앞서 latex sphere의 상태 및 카본 막의 기울어짐 정도를 확인하기 위해 토모그래피를 수행하여 latex sphere와 카본 지지막의 3차원적 구조 복원을 시도하였다. 각각의 연속 기울기 이미지를 경사각에 따라 cross correlation 방법을 이용하여 정렬을 수행하였다. 정렬된 이미지는 filtered back projection 방법을 이용하여 z축 tomogram을 생성하였다.
각각의 연속 기울기 이미지를 경사각에 따라 cross correlation 방법을 이용하여 정렬을 수행하였다. 정렬된 이미지는 filtered back projection 방법을 이용하여 z축 tomogram을 생성하였다. Fig.
성능/효과
(4)식으로부터 흡수계수(β)는 입사빔 강도의 변화에 민감하게 작용을 하기 때문에 이에 대한 오차를 줄이기 위해 앞서서 구한 전자빔의 불안정도(4.1%)를 감안하여 I0에 1.041의 scale factor를 곱하여 계산한 결과 카본 지지막은 약 1.71(5)/μm, latex sphere는 약 2.67(6)/μm의 흡수계수를 나타내었다.
결과적으로 회귀분석은 RMS값이 0.976의 정확도를 가지고 수행이 가능하였고 회귀분석을 통해 “0”도에서의 It값(2520.216)을 구한 결과, 실제 측정된 It에 대하여 약 0.2%의 오차내에서 일치함을 알 수 있었다.
, 2008). 또한 에너지 여과장치의 슬릿 조리개를 제거하여 슬릿 조리개의 유동에 의한 전자빔의 불안정도의 영향을 억제하였다. 연속 기울기에 따른 영상은 +55°~-55° 범위 내에서 5°간격으로 16 bit의 동적범위를 가지고 있는 2 k CCD 카메라(F224HD, TVIPS)를 이용하여 획득하였다.
후속연구
따라서 보다 정확한 상대적인 흡수계수의 산출 및 Beer’s law의 적용을 위해서는 본 연구의 실험방법에서 언급한 입사빔의 강도(I0)의 안정도(가속전압, 집속렌즈 조리개 등의 선택)가 무엇보다 중요하며, 투과빔의 강도(It)에 영향을 주는 대물렌즈 조리개, 전자빔 조사량 등의 실험적 변수에 대한 세심한 고려가 수반된 실험이 필요하다. 결론적으로 의생물 시료에 대한 전자토모그래피는 시료에 대한 입사빔의 강도 측정과 Beer’s law의 적용을 통해 획득된 토모그램을 이용할 경우보다 정량적인 3차원적 구조분석을 수행할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서 보다 정확한 상대적인 흡수계수의 산출 및 Beer’s law의 적용을 위해서는 본 연구의 실험방법에서 언급한 입사빔의 강도(I0)의 안정도(가속전압, 집속렌즈 조리개 등의 선택)가 무엇보다 중요하며, 투과빔의 강도(It)에 영향을 주는 대물렌즈 조리개, 전자빔 조사량 등의 실험적 변수에 대한 세심한 고려가 수반된 실험이 필요하다.
1에 나타낸 바와 같이, Beer’s law의 검증을 위해서는 시료를 통과하지 않고 바로 투과된 전자빔(I0)에 대한 강도가 필요하며, 이를 측정하기 위해선 카본 지지막내에 존재하는 hole이 필요하다. 또한 기울기에 따른 카본 지지막의 두께 변화에 따른 전자빔의 강도변화를 측정하는 것이 필요하며, 마지막으로 카본 지지막위에 존재하는 latex sphere와 hole의 가장자리에 걸쳐 있는 latex sphere를 동시에 관찰하여 latex sphere의 강도변화를 관찰하는 것이 필요하다. Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
전자토모그래피 기법은 무엇을 기반으로 하여 영상에서 정보를 추출해내는가?
Transmission electron microscope (TEM)를 이용하여 획득한 일련의 2차원적 영상들로부터 3차원적 정보를 추출해내는 전자토모그래피는 시료의 구조를 입체적으로 관찰할 수 있기 때문에 구조분석 오류를 피할 수 있고 더 나아가 새로운 정보를 획득할 수 있어 유용하게 사용되는 분석기법 중의 하나이다. 이러한 토모그래피 기법은 시료에 입사되는 빔의 강도와 시료를 투과한 빔의 강도의 관계를 나타내는 Beer’s law를 기반으로 하고 있다(Gilbert, 1972). 현재 정성적인 해석에 머물고 있는 토모그래피를 정량적 해석의 단계로 올리기 위해서는 물질의 특성과 전자빔과의 관계를 나타내는 Beer’s law에 대한 보다 다양한 실험 및 검증이 필요하다.
전자토모그래피의 역할은 무엇인가?
Transmission electron microscope (TEM)를 이용하여 획득한 일련의 2차원적 영상들로부터 3차원적 정보를 추출해내는 전자토모그래피는 시료의 구조를 입체적으로 관찰할 수 있기 때문에 구조분석 오류를 피할 수 있고 더 나아가 새로운 정보를 획득할 수 있어 유용하게 사용되는 분석기법 중의 하나이다. 이러한 토모그래피 기법은 시료에 입사되는 빔의 강도와 시료를 투과한 빔의 강도의 관계를 나타내는 Beer’s law를 기반으로 하고 있다(Gilbert, 1972).
전자토모그래피에서 정확한 상대적인 흡수계수의 산출 및 Beer’s law의 적용을 위해서 본 연구가 제안하는 입사빔 강도의 안정도와 실험적 변수에 대한 세심한 고려가 수반된 실험이 필요한 이유는 무엇인가?
마지막으로 고려할 사항은 전자토모그래피에서는 각 물질에 대한 흡수계수는 가속전압, 대물렌즈 조리개, 배율, 전자빔 조사량 등에 의해 달라지게 되기 때문에 절대값은 구하기 어려우며 동일한 실험환경에서 각 물질에 대해 상대적인 값을 비교할 수 밖에 없다(Hayat, 2000). 따라서 보다 정확한 상대적인 흡수계수의 산출 및 Beer’s law의 적용을 위해서는 본 연구의 실험방법에서 언급한 입사빔의 강도(I0)의 안정도(가속전압, 집속렌즈 조리개 등의 선택)가 무엇보다 중요하며, 투과빔의 강도(It)에 영향을 주는 대물렌즈 조리개, 전자빔 조사량 등의 실험적 변수에 대한 세심한 고려가 수반된 실험이 필요하다.
참고문헌 (5)
Gilbert P: Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. J Theor Biol 36(1) : 105-117, 1972.
Hayat MA: Principles and techniques of electron microscopy-biological applications, Cambridge university press, pp. 158, 2000.
Kim JG, Lee SH, Kweon HS, Jeong JM, Jeong WG, Lee SJ, Jou HT, Kim YJ: Objective aperture effects for the quantitative analysis in electron tomography. Korean J Microscopy 38(4) : 285-291, 2008. (Korean)
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