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문제 정의
- 본 연구에서는 토마토 풋마름병의 생물적 방제를 위하여 여러 지역과 작물의 근권토양으로부터 형광성 Pseudomonas 세균을 분리하여, 실내 항균력 실험과 대량배양을 위한 탄소원 탐색 및 포트실험결과를 보고한다.
- 2003). 이번 연구에서는 국내 여러 지역의 토마토, 고추, 포도 등 15개 작물 재배지의 근권 토양으로부터 KB 배지 상에서 형광을 발현하는 균주들을 순수 분리하였고, 이 균주들을 토마토 풋마름병의 생물적 방제제 개발을 위한 기초 연구에 이용하였다. 분리균의 속동정을 위하여 실시한 Pseudomonas속 특이적 PCR 결과 모든 분리균에서 1, 018 bp의 증폭산물이 검출되어(Fig.
- 없는 실정이다. 일반 병원균의 생물적 방제를 위해 Fseudommas속의 세균이 가장 일반적으로 이용되고 있는데, 이번 연구에서는 각종 작물의 재배지 토양에서 형광성 세균을 분리하여 Pseudomonas속 특이적 PCR과 항생물질(2, 4-diacetylphloroglucinol) 생산 관련 유전자의 유무를 조사하였다. 분리된 150개의 Pseudomonas속 세균 중 항생물질 관련 유전자가 검출된 균은 2균주뿐이였으며, 그 중 토마토 근권토양으로 분리된 E putida P84 세균이 각종 식물 병원 세균에 대해 가장 높은 실내 항균력을 나타내었다.
- 탄소원별 P84균주의 생장효과. 항균력 검정결과 가장 우수한 효과를 나타낸 P84 균주의 최적 배양조건을 탐색하기 위한 일환으로 탄소원별 생장효과를 조사하였다. 기초배지(1.
제안 방법
- 5%)과 엑스텐(동부한농)(X2,000)에 대한 방제 효과도 함께 실시하였다. 24시간 후 가위를 이용하여 토마토 뿌리에 상처를 낸 후 tetrazolium chloride(TTC) 배지에서 새롭게 배양한 풋마름병균(Rsl2)을 멸균수에 1W cfb/m/ 농도로 현탁액을 제조하여 5 m/씩 관주 접종하였고, 대조구에는 P84 균주 처리 없이 풋마름병균을 접종하였다. 각 처리는 30포트씩 3반복 실험하였다.
- 클린벤치에서 충분히 응고시킨 후 신선하게 배양된 형광성 세균을 이쑤시개로 배지위에 접종하였다. 28℃ 배양기에서 2일간 배양한 후 형성된 저지원의 길이를 측정하여 항균력을 검정하였다.
- 파종 3주 후 KB배지에서 새롭게 배양한 P84 균주를 멸균수에 IO® cfu/m/ 농도로 현탁액을 제조하여 10 m씨 포트에 분주하였다. P84 균주 이외에도 친환경 방제제를 탐색하기 위해 키토산(0.5%)과 엑스텐(동부한농)(X2,000)에 대한 방제 효과도 함께 실시하였다. 24시간 후 가위를 이용하여 토마토 뿌리에 상처를 낸 후 tetrazolium chloride(TTC) 배지에서 새롭게 배양한 풋마름병균(Rsl2)을 멸균수에 1W cfb/m/ 농도로 현탁액을 제조하여 5 m/씩 관주 접종하였고, 대조구에는 P84 균주 처리 없이 풋마름병균을 접종하였다.
- 분리된 형광성 세균의 속 동정을 위해 Widmer 등(1998)이 보고한 Pseudomonas 속 특이적 primer(Ps-for, Ps-rev)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCRe 2.5U Taq polymerase(Takara, Japan), 100 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 각각의 dNTP 0.2 mM, primer 50 pmol 반응액 에 2 μl의 분리된 DNA를 첨가한 후 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25 μl로 조절하였다. 각 PCR 증폭산물 5 μl를 1.
- 2 mM, primer 50 pmol 반응액 에 2 μl의 분리된 DNA를 첨가한 후 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25 μl로 조절하였다. 각 PCR 증폭산물 5 μl를 1.2% agarose gd에 전기영동 후 EtBr로 염색하여 증폭산물의 유무를 조사하였다. 또한, Raaijmakers 등(1997)이 보고한 primer (Phl2a, Phl2b)를 이용해 항생물질인 2, 4-diacetylphloroglucinol 생산 관련 유전자(phID)의 유무를 조사하였다.
- 24시간 후 가위를 이용하여 토마토 뿌리에 상처를 낸 후 tetrazolium chloride(TTC) 배지에서 새롭게 배양한 풋마름병균(Rsl2)을 멸균수에 1W cfb/m/ 농도로 현탁액을 제조하여 5 m/씩 관주 접종하였고, 대조구에는 P84 균주 처리 없이 풋마름병균을 접종하였다. 각 처리는 30포트씩 3반복 실험하였다.
- 형광성 Pseudomonas 세균 분리. 고추, 토마토, 포도 등 15작물의 근권토양을 채집하여, 토양 10 g을 100 m/ 멸균수가 들어있는 250 m2 삼각플라스크에 넣고 1시간 동안 진탕배양한 후 King's B 배지 (Difco)에 100 μl를 분주하여 평판희석법으로 배양하였다. 28℃에서 2일간 배양 후 UV를 조사하여 형광을 발현하는 단일 균총을 순수 분리 하였다.
- 항균력 검정결과 가장 우수한 효과를 나타낸 P84 균주의 최적 배양조건을 탐색하기 위한 일환으로 탄소원별 생장효과를 조사하였다. 기초배지(1.25% K2HPO4, 0.38% KH2PO4, 0.01% MgSO4, 0.5% Yeast extract)에 13개의 탄소원을 각각 1% 농도로 맞추고 28℃에서 2일간 진탕배양 후 흡광도를 조사하여 농도를 측정하였다.
- 2% agarose gd에 전기영동 후 EtBr로 염색하여 증폭산물의 유무를 조사하였다. 또한, Raaijmakers 등(1997)이 보고한 primer (Phl2a, Phl2b)를 이용해 항생물질인 2, 4-diacetylphloroglucinol 생산 관련 유전자(phID)의 유무를 조사하였다.
- 분리된 형광성 세균을 이용하여 식물 병원성 세균 10균주(Table 1)에 대한 실내 항균력 검정을 실시하였다. 분리된 형광성 세균과 식물 병원성 세균과의 항균력은 KB배지를 이용하였다. 각각의 식물 병원성 세균 현탁액 100 μl(2X108 cfu/ml)를 50℃ 정도로 식힌 KB 배지에 혼합한 후 petri-dish에 분주하였다.
- 항균력 검정. 분리된 형광성 세균을 이용하여 식물 병원성 세균 10균주(Table 1)에 대한 실내 항균력 검정을 실시하였다. 분리된 형광성 세균과 식물 병원성 세균과의 항균력은 KB배지를 이용하였다.
- 균주는 이번 실험에서 분리한 67 균주와 냉동 보관중인 83 균주(서 등, 2006)를 이용하였다. 종 150균주의 DNA는 InstaGene matrix(Bio-Rad)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 분리하였고, -20℃ 에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리된 형광성 세균의 속 동정을 위해 Widmer 등(1998)이 보고한 Pseudomonas 속 특이적 primer(Ps-for, Ps-rev)를 이용하여 PCR을 실시하였다.
- 각각의 식물 병원성 세균 현탁액 100 μl(2X108 cfu/ml)를 50℃ 정도로 식힌 KB 배지에 혼합한 후 petri-dish에 분주하였다. 클린벤치에서 충분히 응고시킨 후 신선하게 배양된 형광성 세균을 이쑤시개로 배지위에 접종하였다. 28℃ 배양기에서 2일간 배양한 후 형성된 저지원의 길이를 측정하여 항균력을 검정하였다.
- putida로 동정 되었다(서 등, 2006). 토마토 종자를 바로커 상토를 채운 포트에 파종하여 유리온실에서 재배하였다. 파종 3주 후 KB배지에서 새롭게 배양한 P84 균주를 멸균수에 IO® cfu/m/ 농도로 현탁액을 제조하여 10 m씨 포트에 분주하였다.
대상 데이터
- 유전적 특성조사. 균주는 이번 실험에서 분리한 67 균주와 냉동 보관중인 83 균주(서 등, 2006)를 이용하였다. 종 150균주의 DNA는 InstaGene matrix(Bio-Rad)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 분리하였고, -20℃ 에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 포트실험. 포트실험에는 P84 균주를 이용하였으며, 이 균은 지방산 분석, 유전적 분석 등을 통해 P. putida로 동정 되었다(서 등, 2006). 토마토 종자를 바로커 상토를 채운 포트에 파종하여 유리온실에서 재배하였다.
이론/모형
- 종 150균주의 DNA는 InstaGene matrix(Bio-Rad)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 분리하였고, -20℃ 에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리된 형광성 세균의 속 동정을 위해 Widmer 등(1998)이 보고한 Pseudomonas 속 특이적 primer(Ps-for, Ps-rev)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCRe 2.
- 토마토 풋마름병 포트실험에는 P84 균주이외에 풋마름병의 친환경 방제제로 이용 가능성을 조사하기 위하여 키토산과 상품화된 생물적 방제제 엑스텐을 이용하였다. 키토산과 엑스텐은 항균활성과 기주식물의 저항성 증대 효과를 높일 수 있는 것으로 알려져 있다(Park 등, 2001; Terry와 Joyce, 2004).
성능/효과
- 분리된 150개의 Pseudomonas속 세균 중 항생물질 관련 유전자가 검출된 균은 2균주뿐이였으며, 그 중 토마토 근권토양으로 분리된 E putida P84 세균이 각종 식물 병원 세균에 대해 가장 높은 실내 항균력을 나타내었다. P84 균주의 탄소원별 증식효과는 glucose 첨가시에 가장 좋았으며, arabionse, inositol, melibiose 첨가 시에도 우수한 증식효과를 나타내었다. P84 세균을 이용한 토마토 풋마름병의 포트실험 결과에서는 60%의 방제 효과를 나타내었다.
- 모든 분리균을 이용하여 풋마름병균을 포함한 10개의 식물 병원성 세균에 대한 실내 항균효과를 검정한 결과 5개 균주(P66 , P83, P86, P105, P106)가 10-20 mm 사이의 저지원을 형성하였고, 1개 균주(P84)가 대부분의 병원성 세균에 대해 20mm 이상의 저지원을 형성하였다(Table 1). Pseudomonase- 세균을 이용한 생물적 방제에 관한 연구는 많이 보고되어 있으며, 특히 항생물질 생산이 항균력과 밀접한 관련이 있는데(De La Fuente 등, 2004), 그중 2, 4-diacetylphloroglucinol이 가장 밀접하게 관련되어있다(Picard 등, 2000).
- 이번 연구에서는 국내 여러 지역의 토마토, 고추, 포도 등 15개 작물 재배지의 근권 토양으로부터 KB 배지 상에서 형광을 발현하는 균주들을 순수 분리하였고, 이 균주들을 토마토 풋마름병의 생물적 방제제 개발을 위한 기초 연구에 이용하였다. 분리균의 속동정을 위하여 실시한 Pseudomonas속 특이적 PCR 결과 모든 분리균에서 1, 018 bp의 증폭산물이 검출되어(Fig. 1A), UV 조사시 형광을 발현하는 특성과 PCR 결과를 종합하여 이들 분리균 모두 Pseudomonas 속으로 동정하였다.
- 일반 병원균의 생물적 방제를 위해 Fseudommas속의 세균이 가장 일반적으로 이용되고 있는데, 이번 연구에서는 각종 작물의 재배지 토양에서 형광성 세균을 분리하여 Pseudomonas속 특이적 PCR과 항생물질(2, 4-diacetylphloroglucinol) 생산 관련 유전자의 유무를 조사하였다. 분리된 150개의 Pseudomonas속 세균 중 항생물질 관련 유전자가 검출된 균은 2균주뿐이였으며, 그 중 토마토 근권토양으로 분리된 E putida P84 세균이 각종 식물 병원 세균에 대해 가장 높은 실내 항균력을 나타내었다. P84 균주의 탄소원별 증식효과는 glucose 첨가시에 가장 좋았으며, arabionse, inositol, melibiose 첨가 시에도 우수한 증식효과를 나타내었다.
- IB), 이 2균주는 모두 실내 항균효과에서 항균력을 나타낸 균주들이었다. 이 결과로 2, 4-diacetylphloroglucinol과 식물 병원 세균에 대한 항균력 사이에는 상호관계가 높은 것으로 나타났다.
- 필수적 조건일 것이다. 이번 실내 항균력 실험결과 가장 우수한 방제효과를 나타낸 P84 균주의 탄소원별 생장효과를 검정한 결과 glucose# 첨가한 배지에서 생장이 가장 우个하였으며, 다음으로 arabinose, inositol, melibiose 를 첨가한 곳에서 생장이 좋게 나타났으며, 나머지 9개의 탄수화물 처리 배지에서는 생장이 미미하였다(Fig. 2).
- 2, 4-diacetylphloroglucinol의 생산에는 6개의 cluster 유전자가 보고되어 있는데, 그 중 phlD 유전자가 모든 2, 4-diacetylphloroglucinol 생산균주에 안정적으로 존재하는 유전자로 알려져 있다(Raaijmakers 등, 1997). 이번 실험에 이용된 분리균에 대한 phlD 유전자의 검색을 위한 PCR 실험 결과 2개의 균주(P83, P84)에서만 750 bp의 유전자가 증폭되었는데 (Fig. IB), 이 2균주는 모두 실내 항균효과에서 항균력을 나타낸 균주들이었다. 이 결과로 2, 4-diacetylphloroglucinol과 식물 병원 세균에 대한 항균력 사이에는 상호관계가 높은 것으로 나타났다.
- 3). 키토산과 엑스텐의 경우 식물에 저항성 증대효과가 있는 것으로 알려져 있는데, 이번 실험에서 방제효과가 낮게 나타난 것은 이번 실험조건이 토마토에 저항성을 유도하기에는 시간이 부족하였던 것으로 판단되었다. 제형화 되지 않은 Pwdomonas속의 생존력은 길지 않은 것으로 보고되고 있는데(Vidhyasekaran 등, 1997), 이번 P84 균주 처리의 경우 약 2주 후부터 방제효과가 떨어지기 시작하였다(결과 미제시).
- 키토산과 엑스텐은 항균활성과 기주식물의 저항성 증대 효과를 높일 수 있는 것으로 알려져 있다(Park 등, 2001; Terry와 Joyce, 2004). 포트실험 결과 P84 균주의 방제 효과가 60%로 가장 높게 나타났으며, 키토산과 엑스텐의방제효과는 매우 미미하였다(Table 2, Fig. 3). 키토산과 엑스텐의 경우 식물에 저항성 증대효과가 있는 것으로 알려져 있는데, 이번 실험에서 방제효과가 낮게 나타난 것은 이번 실험조건이 토마토에 저항성을 유도하기에는 시간이 부족하였던 것으로 판단되었다.
후속연구
- 따라서, P84 균주를 이용해 풋마름병을 방제하기 위해서는 제형화 또는 여러 차례의 처리가 이루어져야 할 것으로 생각되었다. Pseudomonas속 세균을 이용한 생물적 방제 기작에는 항생물질, 식물호르몬, 식물성장 촉진물질, siderophore 생산 등이 보고되어 있는데 P84 균주의 풋마름병에 대한 방제효과가 항생물질 이외에 어떤 다른 기작이 작용하는지에 대해서는 추가 실험이 필요하다고 사료된다.
- 제형화 되지 않은 Pwdomonas속의 생존력은 길지 않은 것으로 보고되고 있는데(Vidhyasekaran 등, 1997), 이번 P84 균주 처리의 경우 약 2주 후부터 방제효과가 떨어지기 시작하였다(결과 미제시). 따라서, P84 균주를 이용해 풋마름병을 방제하기 위해서는 제형화 또는 여러 차례의 처리가 이루어져야 할 것으로 생각되었다. Pseudomonas속 세균을 이용한 생물적 방제 기작에는 항생물질, 식물호르몬, 식물성장 촉진물질, siderophore 생산 등이 보고되어 있는데 P84 균주의 풋마름병에 대한 방제효과가 항생물질 이외에 어떤 다른 기작이 작용하는지에 대해서는 추가 실험이 필요하다고 사료된다.
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