본 연구에서는 분해성 고분자의 종류와 제조조건에 따른 나노입자의 분산 안정성을 평가하기 위하여 광산란 입도 분석기를 이용하여 입자 크기 변화를 조사하였다. 이를 위해 생분해성 고분자인 폴리(D,L-락타이드-co-글리콜라이드) 단독과 폴리(L-락타이드)와의 블렌드, 그리고 폴리(L-락타이em)-g-폴리(에틸렌 글리콜)과의 블렌드, 세 종류를 개선된 자발적 에멀션/용매 확산 방법을 이용하여 나노입자를 제조하였다. 제조조건의 영향을 파악하기 위하여서는 나노입자의 제조시에 대표적인 분산 안정제인 폴리(비닐 알코올)(PVA)의 사용 유무의 영향을 조사하였다. 시간이 진행함에 따라 분산 안정제가 적용되지 않은 경우에서는 나노입자의 분해와 분해를 통해 붕괴된 입자의 응집에 의하여 입자의 크기가 bimodal 분포를 나타내었다. 나노입자가 분산된 수용액에 단백질 용액을 투입한 경우에는 분산 안정제인 PVA의 사용 유무에 의해 극명한 차이를 나타내었으며 PVA가 분산 안정성에 크게 기여함을 확인할 수 있었다. 또한 낮은 분자량의 폴리(에틸렌 글리콜)이 그래프트 고분자를 미량 블렌드함에 따라 입자의 단백질 흡착에 대한 분산 안정성은 침전이 일어나지 않고 1일 정도 분산 상태를 유지하는 것으로부터 일부 향상됨을 확인하였다.
본 연구에서는 분해성 고분자의 종류와 제조조건에 따른 나노입자의 분산 안정성을 평가하기 위하여 광산란 입도 분석기를 이용하여 입자 크기 변화를 조사하였다. 이를 위해 생분해성 고분자인 폴리(D,L-락타이드-co-글리콜라이드) 단독과 폴리(L-락타이드)와의 블렌드, 그리고 폴리(L-락타이em)-g-폴리(에틸렌 글리콜)과의 블렌드, 세 종류를 개선된 자발적 에멀션/용매 확산 방법을 이용하여 나노입자를 제조하였다. 제조조건의 영향을 파악하기 위하여서는 나노입자의 제조시에 대표적인 분산 안정제인 폴리(비닐 알코올)(PVA)의 사용 유무의 영향을 조사하였다. 시간이 진행함에 따라 분산 안정제가 적용되지 않은 경우에서는 나노입자의 분해와 분해를 통해 붕괴된 입자의 응집에 의하여 입자의 크기가 bimodal 분포를 나타내었다. 나노입자가 분산된 수용액에 단백질 용액을 투입한 경우에는 분산 안정제인 PVA의 사용 유무에 의해 극명한 차이를 나타내었으며 PVA가 분산 안정성에 크게 기여함을 확인할 수 있었다. 또한 낮은 분자량의 폴리(에틸렌 글리콜)이 그래프트 고분자를 미량 블렌드함에 따라 입자의 단백질 흡착에 대한 분산 안정성은 침전이 일어나지 않고 1일 정도 분산 상태를 유지하는 것으로부터 일부 향상됨을 확인하였다.
Colloidal stability of the biodegradable nanoparticle was characterized by measuring the variation of particle size with time using photon correlation spectroscopy. Three kinds of polymers, namely, poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA), PLGA/poly(L-lactide) blends, and PLGA/poly(L-lactide)-g-poly(eth...
Colloidal stability of the biodegradable nanoparticle was characterized by measuring the variation of particle size with time using photon correlation spectroscopy. Three kinds of polymers, namely, poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA), PLGA/poly(L-lactide) blends, and PLGA/poly(L-lactide)-g-poly(ethylene glycol) blends were used as matrix material for nanoparticle preparation. Nanoparticles were prepared with or without using poly(vinyl alcohol)(PVA) as suspension stabilizer to evaluate the condition of preparation. Nanoparticles from the blend of amphiphilic graft copolymer with short poly(ethylene glycol) chain and PLGA maintained suspension for 1 day when protein stock solution was introduced. This is somewhat improvement in colloidal stability against protein adsorption compared with that of nanoparticles without PEG moiety. Suspension stabilizer, PVA, had a significant effect on the colloidal stability against freezing and protein adsorption which led to coagulation of nanoparticles. It is important to consider effect of suspension stabilizer as well as materials used to prepare nanoparticle on the colloidal stability.
Colloidal stability of the biodegradable nanoparticle was characterized by measuring the variation of particle size with time using photon correlation spectroscopy. Three kinds of polymers, namely, poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA), PLGA/poly(L-lactide) blends, and PLGA/poly(L-lactide)-g-poly(ethylene glycol) blends were used as matrix material for nanoparticle preparation. Nanoparticles were prepared with or without using poly(vinyl alcohol)(PVA) as suspension stabilizer to evaluate the condition of preparation. Nanoparticles from the blend of amphiphilic graft copolymer with short poly(ethylene glycol) chain and PLGA maintained suspension for 1 day when protein stock solution was introduced. This is somewhat improvement in colloidal stability against protein adsorption compared with that of nanoparticles without PEG moiety. Suspension stabilizer, PVA, had a significant effect on the colloidal stability against freezing and protein adsorption which led to coagulation of nanoparticles. It is important to consider effect of suspension stabilizer as well as materials used to prepare nanoparticle on the colloidal stability.
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문제 정의
5% 이상부터 PVA 자체가 응집체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 PVA 농도를 매우 낮게(0.4 wt%) 유지하여 PVA의 입자크기에 대한 영향변수를 최소화하고자 하였다.17 Figure 2에서는 PVA가 분산 안정제로 도입되었을 경우와 도입되지 않았을 경우의 나노입자 제조 직후의 크기를 나타내고 있다.
제안 방법
일부 보고되고 있는 실정이다.13,14 이에 본 연구에서는 수분산 상태에서의 시간에 따른 입자 크기를 측정함으로써 짧은 사슬 길이의 PEG가 그래프트된 경우에 분산안정성에 대한 영향, PVA 분산 안정제의 영향, 시간에 따른 분해거동에 따른 분산 안정성을 정리하였다.
나노입자가 분산된 매질에서 분해반응이 일어나는지를 확인하기 위하여 분산매질의 pH를 측정하였다. 모든 분산매질이 7일의 항온배양 후에 초기의 7.
45 ㎛의 필터를 통과시켰다. 나노입자는 분산 안정제인 PVA가 0.4% 용해된 PBS 용액과 PVA가 도입되지 않은 PBS 용액에서 각각 제조하였다. 나노입자가 분산된 액은 증류수를 첨가하여 희석하였고 최종 농도가 0.
나노입자의 제조 나노입자는 입자 크기를 작게 제어할 수 있는 자발적 에멀션/용매 확산 방법을 사용하여 제조하였다. 이전의 연구보고와 같이 분산 안정제를 사용하지 않고 나노입자를 제조하였을 때와16 PVA를 분산 안정제로 도입한 경우, 양친성 그래프트 고분자 또는 소수성 고분자를 PLGA에 일부 도입하였을 경우의 안정성 평가를 위하여 Table 1에 나타낸 바와 같이 나노입자를 제조하였다 분산 매에서의 PVA 농도가 1% 이상에서는 PVA의 함량이 제조되어지는 나노입자의 크기에 영향을 미치게 되며 농도가 2.
본 연구에서는 PLGA, PLGA(9)/PLLA(1), 그리고 PLGA(9)/ PLLA-g-PEG(l) 고분자를 기반으로 하여 나노입자를 제조하고 이의 분산 안정성을 나노입자의 크기를 측정함으로써 평가하였다. 시간에 따른 광산란법을 이용한 크기 측정은 나노입자가 분산된 상태에서 변화를 관찰하기에 용이할 뿐만 아니라 분산 안정성을 평가하는 기법으로 제시될 수 있음을 확인하였다.
대상 데이터
88) 이었다. 모델 단백질로는 Sigma사의 난백 lysozyme (hen egg white) 를 사용하였다 Phosphate 완충 용액(PBS, 33 mM, pH 7.4) 50 mL에 1 g의 lysozyme을 용해시켰다 PVA(87-89% hydrolyzed, MW=13-23 kD)는 Aldrich사의 제품을 사용하였다. Figure 1에서는 나노입자를 제조하는데 사용한 고분자의 화학적 구조를 나타내었다.
시약 및 재료 Lactide와 glycolide 조성비가 50 : 50인 PLGA 공중합체는 Sigma사에서 PLA는 미국의 Polyscience사에서 구입하여 사용하였다. 사용되어진 PLGA와 PLA의 분자량은 각각 8.
이론/모형
나노입자의 제조 나노입자는 자발적 에멀션용매 확산 방법 (spon-taneous emulsification solvent diffusion technique)을 사용하여 제조하였다.15 간략하게 200 mg의 고분자를 10 mL의 아세톤에 용해를 시킨다 그 후 이 용액을 150 mL의 PBS 용액에 적하하였으며 상온에서 3시간 동안 교반하면서 아세톤을 제거함으로써 나노입자를 얻었다.
입자 크기의 측정. 나노입자의 평균 크기는 BI-9000AT digital auto-correlator(Brookhavne Instruments) 가 부착된 BI-90 Plus 입자 크기 분석기를 이용해 동적 광산란법 (dynamic Eght scattering)으로 측정하였다. 측정조건은 20 ℃에서 입사빔에 대해 fixed scattering angle 90˚에서 duplicate로 제조된 샘플을 즉정하였다.
성능/효과
보고하였다.10 이 논문에서 고분자내에 PEG의 함량을 증가할수록 분산안정성이 향상됨을 나타내었다. 또한, 본 연구진에서 개발한 PLLA-g-PEG를 11 PLGA와 블렌드하여 제조한 단백질 약물 방출용 미립구(microparticle) 제형에서도 그래프트 양친성 공중합체의 도입을 통해 높은 약물담지 특성과 100%에 가까운 단백질 약물방출 특성을 나타냄을 보였다.
PVA의 사용 유무와 관계없이 모든 입자들은 그 크기의 분포가 매우 좁았음을 확인하였고 분산 안정제 없이도 나노입자가 잘 제조됨을 알 수 있다.16 PVA를 분산 안정제를 사용한 경우는 사용하지 않은 경우보다 입자의 크기가 약간 증가함을 알 수 있다. 일반적으로 PVA의 농도에 따라 입자 크기가 변경될 때는 농도가 증가할수록 입자 크기가 줄어들게 되나18 본 연구에서는 매우 낮은 농도의 PVA가 적용되어 사용된 PVA의 농도가 입자 크기에는 영향을 미치지 않고 분산 안정화에만 작용하고 입자 크기의 증가는 나노입자 표면에 PVA가 흡착되어 표면층을 형성하기 때문이다.
17 Figure 2에서는 PVA가 분산 안정제로 도입되었을 경우와 도입되지 않았을 경우의 나노입자 제조 직후의 크기를 나타내고 있다. PVA의 사용 유무와 관계없이 모든 입자들은 그 크기의 분포가 매우 좁았음을 확인하였고 분산 안정제 없이도 나노입자가 잘 제조됨을 알 수 있다.16 PVA를 분산 안정제를 사용한 경우는 사용하지 않은 경우보다 입자의 크기가 약간 증가함을 알 수 있다.
10 이 논문에서 고분자내에 PEG의 함량을 증가할수록 분산안정성이 향상됨을 나타내었다. 또한, 본 연구진에서 개발한 PLLA-g-PEG를 11 PLGA와 블렌드하여 제조한 단백질 약물 방출용 미립구(microparticle) 제형에서도 그래프트 양친성 공중합체의 도입을 통해 높은 약물담지 특성과 100%에 가까운 단백질 약물방출 특성을 나타냄을 보였다.12 이는 양친성 그래프트 공중합체로 인해 단백질에 대한 안정성을 나타내는 것이며 나노입자의 적용에서도 우수한 특성을 기대할 수 있다
분산매질의 pH를 측정하였다. 모든 분산매질이 7일의 항온배양 후에 초기의 7.4에서 7.1 로 산도가 약간 증가하였음을 확인하였고 이를 통하여 모든 경우 7일간의 배양에도 분해가 일어나고 있음을 확인하였다. 실제적으로 나노입자를 적용하는 경우에서는 나노입자의 소멸 반감기가 수 시간으로 보고되고 있어21 투여 후 7일까지인 체 내에 존재하는 경우가 흔치 않으며 혈액 내에서 나노입자의 낮은 농도로 인해 분해가 진행된 작은 입자간의 응집에 따른 초기 대비입자의 크기가 증가하는 경우는 발생하지 않을 것으로 판단되나 시간에 따라 나노입자가 분해됨에 따라 분산 안정성의 변화가 발생할 수 있으며 투여 이전의 분산상의 보관에 따른 입도의 크기가 증가할 수 있음을 알 수 있다.
평가하였다. 시간에 따른 광산란법을 이용한 크기 측정은 나노입자가 분산된 상태에서 변화를 관찰하기에 용이할 뿐만 아니라 분산 안정성을 평가하는 기법으로 제시될 수 있음을 확인하였다. 짧은 길이의 PEG가 그래프트 된 고분자를 적용한 경우에도 PVA를 분산 안정제로 사용하지 않은 경우 단백질 흡착에 대하여 분산 안정성을 어느 정도 나타냄을 확인할 수 있었다.
그러나 약 1일 이후에는 NP-1 이나 NP-2와 같이 응집에 의한 침전물이 생성되었다. 이를 통해 양친성 그래프트 고분자가 PLGA와 블렌드되었을 때 단백질에 분산안정성을 나타냄을 확인할 수 있었으나 그 효과가 크지 않았다. 이러한 원인은 여러 가지로 예측해 볼 수 있는데 우선 그래프트에 사용된 MPEG의 분자랑이 매우 작아서 단백질에 대한 안정성을 유지하기 불충분하였고 분자량 120인 MPEG가 그래프트된 경우는 rigid한 구조를 통해 측사슬의 움직임이 제약되었을 가능성이 있다.
사용을 위해서는 재분산의 과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있다. 이에 본 연구진은 나노입자가 분산된 상태로 매질을 동결하여 보관 가능 여부를 파악하기 위하여 NP-1과 NP-4를 선택하여 나노입자가 분산된 PBS 자체를 2일간 동결상태로 유지한 후 상온으로 해동하였고 이때 나노입자의 크기를 측정하였다 결과로 NP-1은 평균 입경 832 nm, NP-4는 232 nm 값을 얻었고 표면에 분포한 PVA가 동결시에도 분산 안정성을유지시키는데 영향을 준다는 사실을 확인하였다. 기존에 PVA나 PEG-PPG를 분산 안정제로 사용한 경우에서도 이와 동일한 특성이 보고되었다.
PVA를 분산 안정제를 사용한 경우에는 7일째에서 현격한 크기 변화를 나타내었다. 특이하게도 PLLA-g-PEG가 도입되고 PVA를 분산 안정제로 사용한 경우에는 unimodal한 분포를 나타내었고 입자 크기의 변화가 거의 없어 분해가 진행됨에도 7일까지 그 형태를 잘 유지하고 있는 것으로 나타났다. 블렌드 형태로 도입된 PLLA-g-PEG는 PLGA 와 상용성을 나타내며 입자 내부와 표면에 위치한다.
후속연구
짧은 길이의 PEG가 그래프트 된 고분자를 적용한 경우에도 PVA를 분산 안정제로 사용하지 않은 경우 단백질 흡착에 대하여 분산 안정성을 어느 정도 나타냄을 확인할 수 있었다. 나노입자의 분산 안정성에 미치는 양친성 고분자의 구조에 대한 영향은 양친성 고분자의 함량 사용하는 PEG의 분자량의 변화를 통해 더욱 자세히 확인될 수 있을 것으로 판단되어 이에 따른 표면전하의 변화에 대한 추가적인 연구가 계획 중이다.
참고문헌 (26)
K. S. Soppimath, T. M. Aminabhavi, A. R. Kulkarni, and W. E. Rudzinski, J. Control. Release, 70, 1 (2001)
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