경기도와 충청도 일대의 가금류 처리공장과 폐기물 처리장 부근 토양으로부터 protease 활성이 높은 균주를 분리한 후 그 중 keratinase 활성이 높은 1균주를 최종 선별하여 동정하고 효소생산을 위한 최적 배양조건을 검토한 결과는 다음과 같다. 선별된 균주는 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus 속으로 판명되었으며, 편의상 Bacillus sp. SH-517로 명명하여 사용하였다. Bacillus sp. SH-517에 의한 keratinase 생성 최적 조건을 검토하였는데, 최적 배지 조성은 탄소원으로 chicken feather 2.0%, 유기질소원으로 beef extract 0.5%, 무기질원소원으로 $KNO_3$ 0.5%, 무기염으로 KCl 0.06%, NaCl 0.05%, $KH_2PO_4$ 0.04%. $K_2HPO_4$ 0.03%이었고 그리고 생육인자로 yeast extract 0.01%이였다. 진탕배양 시(180 rpm/min), 최적 온도와 배지의 pH는 각각 $40^{\circ}C$, 8.5로 나타났으며, 위와 같은 최적 조건 하에서 keratinase의 최대 활성은 42시간 만에 125 units/ml/min이었다.
경기도와 충청도 일대의 가금류 처리공장과 폐기물 처리장 부근 토양으로부터 protease 활성이 높은 균주를 분리한 후 그 중 keratinase 활성이 높은 1균주를 최종 선별하여 동정하고 효소생산을 위한 최적 배양조건을 검토한 결과는 다음과 같다. 선별된 균주는 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus 속으로 판명되었으며, 편의상 Bacillus sp. SH-517로 명명하여 사용하였다. Bacillus sp. SH-517에 의한 keratinase 생성 최적 조건을 검토하였는데, 최적 배지 조성은 탄소원으로 chicken feather 2.0%, 유기질소원으로 beef extract 0.5%, 무기질원소원으로 $KNO_3$ 0.5%, 무기염으로 KCl 0.06%, NaCl 0.05%, $KH_2PO_4$ 0.04%. $K_2HPO_4$ 0.03%이었고 그리고 생육인자로 yeast extract 0.01%이였다. 진탕배양 시(180 rpm/min), 최적 온도와 배지의 pH는 각각 $40^{\circ}C$, 8.5로 나타났으며, 위와 같은 최적 조건 하에서 keratinase의 최대 활성은 42시간 만에 125 units/ml/min이었다.
A strain SH-517 which produce extracellular keratinase, was isolated from the soil of a poultry waste and a poultry factory. An isolate SH-517 was identified as Bacillus sp. based on its morphological and biochemical characteristics. The optimal culture conditions for the production of keratinase by...
A strain SH-517 which produce extracellular keratinase, was isolated from the soil of a poultry waste and a poultry factory. An isolate SH-517 was identified as Bacillus sp. based on its morphological and biochemical characteristics. The optimal culture conditions for the production of keratinase by Bacillus sp. SH-517 were investigated. The optimal medium composition for keratinase production was determined to be 2.0% chicken feather as carbon source, 0.5% beef extract as organic nitrogen source, 0.5% $KNO_3$ as inorganic nitrogen source and 0.06% KCl, 0.05% NaCl, 0.04% $KH_2PO_4$, 0.03% $K_2HPO_4$ as mineral source and 0.01% yeast extract as growth factor. The optimal temperature and pH of medium were shown $40^{\circ}C$ and 8.5 with shaking culture (180 rpm/min), respectively. The maximum keratinase production reached maximum of 125 units/ml/min after 42 hr of cultivation under the optimal culturing conditions.
A strain SH-517 which produce extracellular keratinase, was isolated from the soil of a poultry waste and a poultry factory. An isolate SH-517 was identified as Bacillus sp. based on its morphological and biochemical characteristics. The optimal culture conditions for the production of keratinase by Bacillus sp. SH-517 were investigated. The optimal medium composition for keratinase production was determined to be 2.0% chicken feather as carbon source, 0.5% beef extract as organic nitrogen source, 0.5% $KNO_3$ as inorganic nitrogen source and 0.06% KCl, 0.05% NaCl, 0.04% $KH_2PO_4$, 0.03% $K_2HPO_4$ as mineral source and 0.01% yeast extract as growth factor. The optimal temperature and pH of medium were shown $40^{\circ}C$ and 8.5 with shaking culture (180 rpm/min), respectively. The maximum keratinase production reached maximum of 125 units/ml/min after 42 hr of cultivation under the optimal culturing conditions.
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문제 정의
따라서 여기서는 Bacillus sp. SH-517로 명명하고, 차후에 16SrRNA를 이용하여 보다 정확한 동정을 실시하고자 한다.
본 연구에서는 가금류의 깃털을 강력하게 분해하는 kera-tinase를 생산하는 미생물 Bacillus sp. SH-517를 분리하였으며 이 균이 생성하는 최적 생성 조건을 검토한 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
Keratin azure를 이용한 Assay 배양조건 검토를 위하여 효소의 활성은 Suntomsuk 등 [18]의 방법을 변형하여 조사하였다. 즉, 조효소액(원심분리액) 1 ml을 Keratin azure 현탁액 (0.
그 균원 시료로 사용하였다. Keratinase를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 균원 시료를 5.0% skim milk, agar 1.7% (pH 65)로 하는 1차 선별배지에 접종하여 37℃에서 36시간 배양하여 clear zone이 크고 생육이 우수한 균주를 L차 분리하고 분리된 각 균주를 0.5% chicken feather, 0.05% NH4CL 0.05% NaClz 0.04% KH2PO4/ 0.03% K2HPO4, 0.01% MgCb - 6HQ 0.01% yeast extract (pH 6.5)로 하는 2차 선별배지[16]에 접종하여 37℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 액체 배양하여 원심분리한 상등액을 37℃에서 keratin azure를 이용하여 keratinase activity를 측정하였다. 이 중활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 SH-517이라 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.
경기도와 충청도 일대의 가금류 처리공장과 폐기물 처리장 부근 토양으로부터 protease 활성이 높은 균주를 분리한 후 그 중 keratinase 활성이 높은 1균주를 최종 선별하여 동정하고 효소생산을 위한 최적 배양조건을 검토한 결과는 다음과 같다. 선별된 균주는 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus 속으로 판명되었으며, 편의상 Bacillus sp.
Chon과 Kwon [3] 그리고 Page와 Stock [14]은 raffinose가 효소생성을 촉진시켰다는 보고와 일치하였다. 그리고 본 연구에서는 D-raffinose 등이 효소생성을 촉진시켰으나 산업적으로 사용되기에 비용이 많이 들어가는 탄소원이므로 깃털만을 유일한 탄소원으로 다음 실험을 계속하였다.
깃털을 이용한 효소활성의 측정은 Farag 등[4]의 keratin을 이용한 효소활성 측정 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 조효소액 5 ml을 0.
도계장에서 수집한 깃털에서 다른 이물질들을 분리해낸 후, 증류수를 이용하여 10회 세척하였다. 세척한 chicken feather> 60℃ dry oven에서 완전 건조가 되도록 3일 동안 건조하고, 약 5 mm의 길이로 절단하여 배지 성분 및 activity test를 위한 기질로서 사용하였다.
본 균주의 균체 증식과 효소 활성에 영향을 미치는 질소원의 영향을 조사하기 위하여 유일 탄소원으로 깃털을 2% 첨가한 배지에 각 질소원을 0.1%가 되도록 첨가하여 37℃에서 48시간 진탕배양하여 균체량과 효소활성을 조사한 결과는 Table 2와 같았다.
본 균주의 균체 증식과 효소활성에 미치는 금속염의 영향을 조사하기 위하여 금속염을 제외한 기본배지에 각 금속염을 각각 0.05%되게 첨가하여 37℃에서 48시간 진탕배양한 후 균체량과 효소활성을 조사한 결과는 Table 3과 같았다.
본 균주의 배양 시간에 따른 keratinase 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 지금까지 조사된 효소 생산 최적 조건인 탄소원으로 chicken feather 2%, 질소원으로 beef extract 0.5%, KNO3 05%, 금속염으로 KC1 0.06%, NaCl 0.05%, KH2PO4 0.04%, K2HPO4 0.03% 및 생육인자인 yeast extract 0.01%를 첨가한 효소생산 배지에 전배양한 종균을 1% (v/v) 되게 접종한 후 pH 8.5, 40℃에서 배양하여 6시간 간격으로 균주의 생장과 효소활성을 조사하였다. 결과는 Fig.
본 균주의 초기 pH에 따른 균체증식과 효소활성을 조사하기 위하여 기본배지에 pH 3.5에서 pH 10까지 조절 한 후 48시간 배양하여 pH에 따른 균체량과 효소활성을 측정하였다. 결과는 Fig.
분리된 균주의 균체 증식과 효소활성에 미치는 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 chicken feather 0.5%를 첨가한 탄소 원을 배제한 2차 선별배지에 각종 탄소원을 0.5% 되도록 첨가하여 37℃에서 48시간 진탕배양(180 rpm)한 후 균체량과 효소 활성을 조사한 결과는 Table 1과 같다. 결과에서 D-raffinosez D-sorbose, fructose, a-cellulose 등이 깃털만을 유일 탄소원으로 하였을 때보다 높은 효소활성을 나타내었다.
대상 데이터
Keratinase를 분리하기 위하여 경기도와 충청도 일대의 가금류 처리공장과 폐기물 처리장 부근의 토양에서 시료를 채취하여 그 균원 시료로 사용하였다. Keratinase를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 균원 시료를 5.
선별된 균주는 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus 속으로 판명되었으며, 편의상 Bacillus sp. SH-517로 명명하여 사용하였다. Bacillus sp.
본 실험에 사용한 spectrophotometere- Hitachi model 2000을 사용하였으며/ 시약은 Sigma 사의 keratin azure를 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 내지 1급 시약을 사용하였다 .
5)로 하는 2차 선별배지[16]에 접종하여 37℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 액체 배양하여 원심분리한 상등액을 37℃에서 keratin azure를 이용하여 keratinase activity를 측정하였다. 이 중활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 SH-517이라 명명하고 이후의 실험에 사용하였다. 최종 선별된 균주는 NutrientBroth (NB) 100 ml을 300 ml Erlenmeyer flask에 넣어 배양한 후 30% glycerol 현탁액과 1:1 로 혼합하여 -70℃ deepfreezer에서 보관하였다.
이론/모형
분리 된 균주를 동정하기 위하여 Bergey's manual of systematic bacteriology [15]에 기술된 방법에 따라 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성을 조사하였다.
즉, 조효소액 5 ml을 0.1 g의 절단된 깃털에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후 8, 000 rpm으로 원심 분리하여 잔여 깃털을 제거한 후 Lowry method [13]를 이용하여 770 run에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
2)Cultivation was carried out for 48 hr at 37℃ in the 2nd isolation medium containing 2.0% feather, 0.5% beef extract, 0.04% KH2PO4, 0.03% K2HPO4, 0.01% Yeast extract (pH 6.5).
Bacillus sp. SH-517에 의한 keratinase 생성 최적 조건을 검토하였는데, 최적 배지 조성은 탄소원으로 chicken feather 2.0%, 유기질소원으로 beef extract 0.5%, 무기질소원으로 KNO3 05%, 무기염으로 KCl 0.06%, NaCl 0.05%, KH2PO4 0.04%z K2HPO4 0.03%이 었고 그리고 생육인자로 yeast extract 0.01%이였다. 진탕배양 시 (180 rpm/min), 최적 온도와 배지의 pH는 각각 40℃, 8.
Table 2의 결과를 바탕으로 유기질소원으로는 beef ex- tract를 사용하여 실험 하였고 무기질소원으로는 KNO3를 사용하여 각각의 최적 농도를 측정한 결과, Fig. 2과 Fig. 3과같이 각각 0.5%에서 최적의 효소활성과 균체 증식을 보였다. 그리고 Fig.
5에서 pH 10까지 조절 한 후 48시간 배양하여 pH에 따른 균체량과 효소활성을 측정하였다. 결과는 Fig. 6과 같이 pH85에서 가장 효소활성이 우수하였으며, pH 8.0에서 균체생산이 가장 많았다. 또한 pH 6.
5, 40℃에서 배양하여 6시간 간격으로 균주의 생장과 효소활성을 조사하였다. 결과는 Fig. 7과 같이 접종 후 18시간 후부터 효소활성이 급격하게 증가하여 42시간에서 가장 높은 효소활성을 보였으며 균체증식은 24시간 부터 일정하게 나타났다. 이는 Williams 등[21], Yu 등[23] 및 Kang 등[8]의 5일보다 효소생산 시간이 매우 빠름을 알 수 있었다.
5% 되도록 첨가하여 37℃에서 48시간 진탕배양(180 rpm)한 후 균체량과 효소 활성을 조사한 결과는 Table 1과 같다. 결과에서 D-raffinosez D-sorbose, fructose, a-cellulose 등이 깃털만을 유일 탄소원으로 하였을 때보다 높은 효소활성을 나타내었다. Kim I이은 1%의 포도당 첨가 시 효소활성 및 균체 생성을 촉진하였다는 보고와는 상반된 결과로, 이는 균주의 차이에 의한 것으로 사료된다.
이는 MgSO4와FeSO4를 첨가하였을 때 활성이 우수했다는 Page 등 [14]의 보고와는 상이하였는데, 아마 이것은 균주의 차이로 나타난 결과로 생각된다. 그리고 KC1 의 농도에 대한 영향은 Fig. 4와 같이 KC1 을 0.06% 첨 가하였을 때 효소활성이 가장 우수하였다. 배양액의 pH변화는 초기 pH 7.
이는 NFLC1 이 질소원으로서 양호하였다는 Williams 둥[21]의 결과와 상반되었다. 깃털과 함께 다른 질소원을 첨가하였을 때 대부분의 질소원에서 깃털을 유일 질소원으로 사용하였을 때에 비하여 효소활성과 균체증식이 우수하였음을 알 수 있었다. 또한 Rosa 등[1 기의 keratin을 유일한 질소원으로 사용하였다는 보고와는 상이하였다.
0에서 균체생산이 가장 많았다. 또한 pH 6.5 에서부터 pH 9.0까지의 넓은 범위에 걸쳐 균체생산과 효소 활성이 우수하였다. 이는 pH 9.
무기질 소원으로는 KNO3를 첨가하였을 때 가장 효소활성과 균체 증식이 뛰어났으며 NHK1 을 사용하였을 때에는 깃털을 유일 질소원으로 사용하였을 때보다 활성과 균체증식이 낮게 측정되었다. 이는 NFLC1 이 질소원으로서 양호하였다는 Williams 둥[21]의 결과와 상반되었다.
본 균주의 배양 온도에 따른 균체증식과 효소활성을 조사하기 위하여 각 온도에서 48시간 배양하여 각각의 균체량과효소활성을 측정한 결과는 Fig. 5와 같이 40K에서 균 체증식 및 enzyme activity가 가장 우수하였고 35~45℃ 범위에서 90% 이상의 효소활성을 보였다. 이는 30℃에서 효소 활성이 가장 우수했다는 Streptomyces 속 균을 사용한 Brigitle 등[1] 과 50℃의 Young과 Smith [22]의 보고와는 상이하였으며 같은 Streptomyces 속을 이용한 Kim [9]과의 보고와는 잘 일치하였다.
유기질소원으로는 beef extract를 첨가하였을 때 가장 효소 활성 및 균체 증식이 우수하였으며 yeast extract와 pep-tone을 참가하였을 때에도 좋은 결과가 나타났다. 무기질 소원으로는 KNO3를 첨가하였을 때 가장 효소활성과 균체 증식이 뛰어났으며 NHK1 을 사용하였을 때에는 깃털을 유일 질소원으로 사용하였을 때보다 활성과 균체증식이 낮게 측정되었다.
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