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문제 정의
- 제빵에 사용되어 왔다. Jeong 등에 의한 감, 사과, 포도 등을 이용한 과실 식초 생산에 대한 연구가 보고되었고[5, 6], Shim 등에 의해 적포도를 이용한 알코올 발효에 관해서도 보고가 되어 있는데[2이 이에 착안하여 본 연구에서는 양파에 순화시킨 효모를 이용하여 양파즙을 배지로 한 알코올 발효를 통하여 기능성 발효주를 생산하기 위한 목적으로 본 연구를 수행하였다.
- 그래서 그 효소의 작용을 방해하는 유기산을 이용하여 양파의 매운 향미 성분을 제거하고자 하였다. 산도가 높으면 효소의 반응성이 낮아지고 극한 pH에서는 효소의 불활성화가 일어나므로 본 실험에서는 양파를 구연산 용액에 침지하여 탈취 효과를 분석하였다.
- 미흡한 점이 있다. 그래서 본 연구에서는 여러가지 방법을 이용하여 냄새를 제거하기 위한 조건을 검토하였다.
- 본 연구에서는 양파의 수요 확대 및 국민 건강 증진을 위하여 양파즙을 발효 기질로 하여 알코올 발효 조건을 검토하고보다 나아가 발효주의 품질을 개선하고자 노력하여 산업화를 위한 발판을 마련하고자 하였다. 양파즙을 발효 기질로 한 발효주의 품질을 개선하기 위하여 먼저 양파의 독특한 매운 성분에 기인된 불쾌취를 없애고자 여러가지 방법들을 시도하였고 양파즙을 발효 기질로 하여 알코올 발효의 최적 조건을 살펴보았다.
제안 방법
- 50 ml의 양파즙에 과립형 활성탄(Sig ma Co" USA)을 10 g을 넣고 10, 20, 30, 40.50, 60분 동안 각각 반응시킨 후 냄새를비교한 뒤 상기와 같은 방법으로 발효하여 알코올 생산량을 측정하였다.
- 그 결과 48시간이 지난 후 효모에 의해 발생한 이산화탄소 가스로 인해 Durham fermentation tube 안에 기포가 포집되는 데, 이산화탄소를 생산한 균주는 16개였다. 16개의 균주를 YM 액체배지에 전배양하여 주모를 만든 후 양파즙 배지에 5% 접종하여 25C에서 5일 동안 정치 배양하였다. 그 중 OJ-8은 발효 후 잔당이 가장 적었고 알코올 생성능이 가장 뛰어나서 OJ을실험 균주로 선택하여 다음 실험에 사용하였다(Fig.
- 1차로 분리한 균주의 알코올 생산을 확인하기 위하여 당발효 실험을 하였다. YM 액체 배지 10 ml을 cap tube에 넣고 그 cap tube에 Durham fermentation tube를 넣어 멸균하였다.
- 종류별로 각각 10%씩 첨가한 후 25.Q 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다. 당 발효성에 있어서 OJ-8은 여러가지 당을 이용할 수 있지만 그 중에서 특히 glucose, fructosez sucrose, maltose 등을 이용하였을 때 잔당이 적었고 알코올 생성능도 높았다.
- 공시균의 알코올생성 최적 당도를 조사하기 위하여 알코올생성에 최적인 당을 lz 5 10, 15, 20, 25, 30%씩 보당한 후 25OC,5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.
- 공시균주의 알코올 생성 최적 당 종류를 조사하기 위하여 당을 종류별로 각각 1.%씩 첨가한 후 25CZ 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.
- 공시균주의 알코올 생성 최적 시간을 조사하기 위하여 주모를 양파즙 배지의 5% 농도로 접종하여 9일 동안 24시간 간격으로 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.
- 공시균주의 알코올 생성 최적 온도를 조사하기 위하여 주모를 양파즙 배지의 5% 농도로 접종하여 4, 15, 25, 30, 37, 45,55C에서 각각 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올 생성량을 측정하였다.
- 공시균주의 알코올 생성 최적 접종량을 조사하기 위하여주모 접종량을 각각 L 3, 5, 7, 9%씩 접종한 뒤 25C, 5일 동안정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.
- 구연산의 농도를 5 10z 15z 20, 25, 30 mM로 하여 생 양파를침지한 후 24시간이 지난 후 냄새를 확인하였다. 그 결과 냄새가 조금은 줄어들었지만 양파 특유의 독한 냄새가 없어지지는 않았다( Table 2).
- 균 생육도는 균 배 양액을 10배 희석하여 spectrophotometer (Techne Co., England)로 O.D.660에서 흡광도 값을 측정하였다. 양파즙 및 발효액의 pH는 pH meter (Coming Co.
- 에탄올의 생성량이 현저히 감소된다. 따라서 산소와 접촉을 적게 만들어 발효가 진행이 잘 되도록 정치배양을 실시하였다. 그러나 혐기성 상태로 조건을 설정하면 실험실 규모뿐만 아니라 산업화 시 그 비용적인 측면에서 알코올 생성감소분을 초과할 수 있기 때문에 적합하지 않은 것으로 판단된다.
- 6). 또한 국내 양조법 상 약주의 알코올 함량이 13% 이하인 것을감안하여 알코올 함량이 13%가 되게 최적 보당 농도를 실험적으로 결정하였다. 본 실험에서는 다음 식의 계산에 의해서 보당하였다.
- 발효액을 7, 000 rpmz 20분간 원심분리 한 후, 상등액을membrane filter (0.45 g mz Sartorius Co., Australia)로 여과하여 여과액 1 u1를 GC [gas chromatography (Hewlett Packard Co., USA)]로 Table 1과 같은 조건 하에서 loading하였고 standard (absolute ethanol)의 면적과 비교하여 생성된 알코올의 양을 계산하였다[12, 19],
- 5). 본 실험에서는sucrose을 양파즙 배지에 첨가하는 당으로 이용하여 알코올 생성을 수행하기로 하였다.
- 사용 균주의 알코올 생성 최적 당 종류를 조사하기 위하여 당을 종류별로 각각 10%씩 첨가한 후 25.Q 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.
- 사용 균주의 알코올 생성 최적 당도를 조사하기 위하여 알코올 생성에 최적인 sucrose를 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30%씩 보당한 후 25C 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다. 그 결과 sucrose의 농도가 높아질수록 알코올이 많이 생산되었지만 25% 이후부터는 알코올 생성이 비슷한 것으로 나타났다(Fig.
- 사용 균주의 알코올 생성 최적 온도를 조사하기 위하여 주모를 양파즙 배지의 5% 농도로 접종하여 4, 15, 25, 30, 37, 45, 55C에서 각각 5일 동안 정치 배양하였다.
- 사용 균주의 알코올 생성량에 대하여 접종량이 미치는 영향을 조사하기 위하여 주모 접종량을 각각 L8%까지 조절한 후 25C, 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.주모의 접종량에 따른 알코올 생성량을 조사하기 위하여 주모 접종량을 각각 L8%까지 조절하여 발효한 뒤 알코올 생성량을 측정한 결과 3-8%의 범위 내에서는 유사한 정도의 알코올 생성량을 보였다(Fig.
- 그래서 그 효소의 작용을 방해하는 유기산을 이용하여 양파의 매운 향미 성분을 제거하고자 하였다. 산도가 높으면 효소의 반응성이 낮아지고 극한 pH에서는 효소의 불활성화가 일어나므로 본 실험에서는 양파를 구연산 용액에 침지하여 탈취 효과를 분석하였다. 이때 구연산의 농도는 5, 10, 15, 20, 25, 30 mM로 정하여 각각을 최종 부피 500 ml 이 되게 하여 실험에 사용하였고 생 양파의 양은 전체 용액의 1/3이 되게 하였다.
- 양파를 착즙 후 100C에서 30분 멸균한 것과 겹겹이 떼어내어 시간별로 100C에서 멸균한 뒤 착즙한 것들의 냄새를 비교하고 그것을 배지로 하여 25C에서 5일 동안 발효한 후 알코올 생산량을 측정하였다. 이 실험은 양파를 100C에서 삶아도 양파의 성분이 크게 달라지지 않는다는 것을 전제로 하였다[1]
- 양파에서 생존 능력과 알코올 생성 능력을 향상시키기 위해시판 중인 효모 Saccharomyces cereuisiae를 양파즙 배지에 접종하여 순화시킨 것을 YM 한천 배지에 3분 도말하여 나타난colony 19개를 1차 분리하여 OJJ ~OJ-19로 각각 명 명하였다. 1차로 분리한 19개의 colony를 액체 배지에 배양하여 그 배양액을 Durham fermentation tube를 거꾸로 넣어서 멸균한 captube에 100 u1 접종한 후 25C에서 정치 배양하였다.
- 660에서 흡광도 값을 측정하였다. 양파즙 및 발효액의 pH는 pH meter (Coming Co.,USA)로 측정하였다. 초기 양파즙의 당도 및 발효 과정에서의당도는 당도계(Atago Co.
- 발판을 마련하고자 하였다. 양파즙을 발효 기질로 한 발효주의 품질을 개선하기 위하여 먼저 양파의 독특한 매운 성분에 기인된 불쾌취를 없애고자 여러가지 방법들을 시도하였고 양파즙을 발효 기질로 하여 알코올 발효의 최적 조건을 살펴보았다.
- 위의 실험 결과에 따라서 이후 실험에는 양파를 겹겹이 떼어내어 활성탄을 총 중량의 20%가 되게 첨가하여 30분 동안 처리하고 난 후 100C에서 40분간 멸균하여 착즙하는 탈취과정을 거친 후 양파즙 배지로 사용하기로 하였다.
- 산도가 높으면 효소의 반응성이 낮아지고 극한 pH에서는 효소의 불활성화가 일어나므로 본 실험에서는 양파를 구연산 용액에 침지하여 탈취 효과를 분석하였다. 이때 구연산의 농도는 5, 10, 15, 20, 25, 30 mM로 정하여 각각을 최종 부피 500 ml 이 되게 하여 실험에 사용하였고 생 양파의 양은 전체 용액의 1/3이 되게 하였다. 반응이 끝난 후 양파를 꺼내어 착즙하고 그 착즙액을 상기와 같은 방법으로 발효하여 알코올 생산량을 측정하였다.
- ,USA)로 측정하였다. 초기 양파즙의 당도 및 발효 과정에서의당도는 당도계(Atago Co.z Japan)를 이용하여 측정하였고 발효 과정에서 발효액의 환원당은 발효가 끝난 발효액을 7, 000rpm, 20분간 원심분리(Bechmaa Co., USA)하여 얻은 상등액을 IO, 배 희석한 후 Somogyi-Nelson 방법을 이용하여 spectrophotometer로 O.D.^에서 흡광도 값을 측정하였다[13].
- 탈취에 효과적인 것으로 알려져 있는 과산화수소수를 1, 5, 10, 15, 20, 25%의 농도로 양파즙 배지에 첨가하여 냄새를 비교한 뒤 상기와 같은 방법으로 발효하여 알코올 생산량을 측정하였다.
- 것에서는 냄새가 많이 제거되었다( Table 2). 활성탄을 제거한 뒤 그 배지에 주모를 접종하여 발효하였고 활성탄을 처리하지 않은 양파즙 배지에 발효한 것과 알코올 생성량에 있어서 차이를 보이지 않았다(Fig. 2C).
대상 데이터
- 16개의 균주를 YM 액체배지에 전배양하여 주모를 만든 후 양파즙 배지에 5% 접종하여 25C에서 5일 동안 정치 배양하였다. 그 중 OJ-8은 발효 후 잔당이 가장 적었고 알코올 생성능이 가장 뛰어나서 OJ을실험 균주로 선택하여 다음 실험에 사용하였다(Fig. 1).
- 5% agar 이며 모두 일급 시약을 사용하였다. 또한 배양용 액체 배지는 분리용 평판 배지의 성분 중에서 agar를 제외한 것을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 양파는 경상남도 창녕군에서 생산된 영산 오사리 종을 원료로 하여 상부와 하부 뿌리 부분을 제거하고 양파의 3배량의 증류수를 가하여 믹서기로 파쇄한 후 착즙하여 사용하였다.
- z USA)을 함유한 YM 한천 배지에 도말하여 30C에서 배양한 후 나타나는 단일 colony들을 1차로 분리하였다. 분리한 colony들을 YM 액체 배지에 접종하여 30Cz 200 이에서 배양한 후, 균 생육도와 알코올 발효도가 가장 뛰어난 균주를 2차로 선별하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 균주는 탁주 생산에 이용되는 시판 중인 효모 S. cereuisiae를 구입하여 양파즙 배지에 넣고 30C에서 순화시킨 후 한 백금이 떠서 0.01 g/ml의 chloramphenicol (Sig ma Co.z USA)을 함유한 YM 한천 배지에 도말하여 30C에서 배양한 후 나타나는 단일 colony들을 1차로 분리하였다. 분리한 colony들을 YM 액체 배지에 접종하여 30Cz 200 이에서 배양한 후, 균 생육도와 알코올 발효도가 가장 뛰어난 균주를 2차로 선별하여 실험에 사용하였다.
- 양파즙 배지는 생 양파 무게 대비 3배량의 증류수를 가하고 파쇄한 후 착즙하고 5% sucrose를 보당하고 110C에서 10분간 멸균된 액을 사용하였다. 효모의 분리용 평판 배지의 구성 성 분은 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1.0% glucose, 1.5% agar 이며 모두 일급 시약을 사용하였다. 또한 배양용 액체 배지는 분리용 평판 배지의 성분 중에서 agar를 제외한 것을 사용하였다.
성능/효과
-
활성탄에 의한 효과
과립형 활성탄에 양파즙 배지를 침지시켜 시간별로 냄새를 측정한 결과 30분 처리한 것부터 냄새가 줄었으며 1시간 처리한 것에서는 냄새가 많이 제거되었다( Table 2). 활성탄을 제거한 뒤 그 배지에 주모를 접종하여 발효하였고 활성탄을 처리하지 않은 양파즙 배지에 발효한 것과 알코올 생성량에 있어서 차이를 보이지 않았다(Fig.
-
과산화 수소수(HQ2)에 의한 효과
과산화수소수를 lz 5, 10, 15, 20, 25%의 농도로 첨가하여양파의 매운 향미 성분의 변화를 확인한 결과 향미 성분이조금 감소하였을 뿐 많은 변화를 보이지는 않았다( Table 2),뿐만 아니라 과산화수소수를 첨가한 배지에 주모를 접종하여발효하여 알코올 생성을 과산화수소수를 처리하지 않은 것과 비교한 결과 과산화수소수를 처리하지 않은 것에 비해 알코올생성량이 적었다(Fig. 2B). 이는 과산화수소수가 균의 생육을억제하기 때문인 것으로 추측된다.
- 1차로 분리한 19개의 colony를 액체 배지에 배양하여 그 배양액을 Durham fermentation tube를 거꾸로 넣어서 멸균한 captube에 100 u1 접종한 후 25C에서 정치 배양하였다. 그 결과 48시간이 지난 후 효모에 의해 발생한 이산화탄소 가스로 인해 Durham fermentation tube 안에 기포가 포집되는 데, 이산화탄소를 생산한 균주는 16개였다. 16개의 균주를 YM 액체배지에 전배양하여 주모를 만든 후 양파즙 배지에 5% 접종하여 25C에서 5일 동안 정치 배양하였다.
- 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다. 그 결과 sucrose의 농도가 높아질수록 알코올이 많이 생산되었지만 25% 이후부터는 알코올 생성이 비슷한 것으로 나타났다(Fig. 6). 또한 국내 양조법 상 약주의 알코올 함량이 13% 이하인 것을감안하여 알코올 함량이 13%가 되게 최적 보당 농도를 실험적으로 결정하였다.
- 구연산의 농도를 5 10z 15z 20, 25, 30 mM로 하여 생 양파를침지한 후 24시간이 지난 후 냄새를 확인하였다. 그 결과 냄새가 조금은 줄어들었지만 양파 특유의 독한 냄새가 없어지지는 않았다( Table 2). 또한 구연산에 침지한 양파를 착즙하여 발효 배지로 사용하였더니 알코올 생성량이 구연산을 처리하지 않은 것보다 감소하였다(Fig.
- Q 5일 동안 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다. 당 발효성에 있어서 OJ-8은 여러가지 당을 이용할 수 있지만 그 중에서 특히 glucose, fructosez sucrose, maltose 등을 이용하였을 때 잔당이 적었고 알코올 생성능도 높았다. 그 중에서도 특히 sucrose를 이용하였을 때더 많은 알코올(9%)이 생성되었다(Fig.
- 그 결과 냄새가 조금은 줄어들었지만 양파 특유의 독한 냄새가 없어지지는 않았다( Table 2). 또한 구연산에 침지한 양파를 착즙하여 발효 배지로 사용하였더니 알코올 생성량이 구연산을 처리하지 않은 것보다 감소하였다(Fig. 2D).
- 먼저 양파를 믹서기로 갈아서 착즙한 뒤 100C에서 30분 멸균한 것과 양파를 겹겹이 떼어 내어 100C에서 시간별로멸균한 뒤 착즙한 것의 냄새를 비교하였더니 후자의 것이 냄새 제거 효과가 뛰어났다. 특히 40분 이상 멸균하면 냄새가 가장 많이 제거되었다( Table 2).
- 사용 균주의 알코올 생성 최적 시간을 조사하기 위하여 주모를 양파즙 배지의 5% 농도로 접종하여 9일 동안 24시간 간격으로 정치 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올의 생성량을 측정한 결과 발효 5일째에 가장 많은알코올을 생성하였다(Fig. 4). pH 변화는 초기 pH 5.
- 양파의 냄새를 제거하기 위하여 여러가지 방법들을 실험한 결과 과산화수소수의 처리와 구연산 처리는 큰 효과가 없었고 양파를 겹겹이 떼어 내어 100C에서 40분간 멸균한 후 착즙한 것과 활성탄을 20% 첨가하여 30분 이상 반응시킨 것은 냄새가 많이 제거되었다.
- 였다. 위의 식에 의한 계산 결과 17.5%의 sucrose를 첨가하는 것이 적당하였다.
- 전술한 분석 방법에 따라 환원당의 변화 및 알코올 생성량을 측정한 결과 15에서 30C 사이에서 에탄올의 생성량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 이들 온도 범위에서 잔존당의 함량은 급격히 감소되는 것을 볼 수 있다.
- 변화 및 알코올의 생성량을 측정하였다.주모의 접종량에 따른 알코올 생성량을 조사하기 위하여 주모 접종량을 각각 L8%까지 조절하여 발효한 뒤 알코올 생성량을 측정한 결과 3-8%의 범위 내에서는 유사한 정도의 알코올 생성량을 보였다(Fig. 7). 그러므로 이 범위 내에서 접종을 한다면 알코올 생성량이 일정하게 유지되는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 본 연구에서는 단지 불쾌취를 제거하는 것에 중점을 두고 실험을 진행했으나, 차후에 활성탄 처리로 제거된 불쾌취 뿐만 아니라 유효성분의 상실에 대한 자세한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.
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