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문제 정의
- 이에 저자는 射干이 호흡기 질환을 다스리는 것으로 보아 폐기능과 연관성이 있음을 알 수 있고 한의학에서는 '肺主皮毛' 라 하여 폐는 피부를 주관한다고 하였으며, 이 같은 기능을 토대로 저자는 射干의 에탄올 추출물의 피부 생리 활성효능을 알아보고자 항산화효능, UVB 세포독성 억제 효과, 항균효과 및 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 조사하여 유의성있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 4t, 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고, protein assay 용액(Bio Red, USA)으로 595 nm에서 흡광도를 측정, 동량의 단백질 양을 계산하였다. 시료 50 M와 0.1 M sodium phosphate buffer 150 "l, 0.1 % L-DOPA 50 M를 분주하여 혼합한 후 ELISA reader기로 37℃에서 405 nm의 파장으로 1시간 동안 30분 간격으로 흡광도의 변화를 측정하였다. 활성율은 대조군의 흡광도를 기준으로 한 백분율로 환산하여 결과로 나타내었다.
- 용액으로 고정하였다. 0.1% DOPA 용액으로 염색하고 탈수하여 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다18).
- 1 M PMSF} 로세포를 용해하였다. 4t, 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고, protein assay 용액(Bio Red, USA)으로 595 nm에서 흡광도를 측정, 동량의 단백질 양을 계산하였다. 시료 50 M와 0.
- P. acnes 균주는 GAM 액체배지에, S. epidermidiS와 S. aureus는 Nutrient 액체배지에 각 균주의 single colony를 넣고 12시간 동안 배양 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. P.
- 射干 에탄올 추출물로부터 유용활성물질을 탐색하기 위해 항산화 효능을 검정하였으며, 자유 라디칼인 DPPH을 사용한 항산화활성 측정방법을 이용하였다 13). 실험관에 메탄올을 넣고 시료 화합물을 농도별로 첨가한 다음 상기 DPPH (0.
- 3 (8X108 cfu/㎖)로 조절하여 평판배지에 균일하게도 말해 주었다. 射干 에탄올 추출물은 400 ㎍/㎖ 농도로 10 % DMSO에 용해하여, 0.22 m filter로 여과하여 제균한 후 80 % 에탄올로 희석하여 항균 활성을 측정하였다. Paper disc (0 8 mm, Adventec.
- 淸熱解毒, 利水作用으로 폐, 호흡기질환에 사용된 射干 에탄올추출물을 肺主皮毛의 한의학적 이론에 근거하여 피부 생리 활성효능을 조사하고자항산화효능, 항균효과 및 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서 DOPA 염색을 통하여 射干 에탄올 추출물의 멜라닌합성 억제 효과를 형태적으로 관찰하기 위하여 射干 에탄올추출물을 100 ㎍/ml 농도로 처리하고 3일간 배양한 후 대조군과 비교하였다. Tyrosinase의 DOPA oxidase 활성을 관찰한 결과 射干 처리군은 대조군에 비해 tyrosinase 활성이 증가하였다.
- 세포의 UVB 조사는 광원으로 UVB lamp GI5T8E (Sankyo denki, Japan)를 이용하여 제작한 UVB 조사기를 사용하였으며 광량은 waldmann UV meter (Waldmann Lichtechnik, germany)로 측정하였다. 자외선 조사 동안 세포가 건조되지 않게 하기 위하여 phosphate buffered saline (PBS) 2㎖를 세포 배양 접시에 넣은 후 UVB 를 10mJ/W 로 조사하였다.
- meter (Waldmann Lichtechnik, germany)로 측정하였다. 자외선 조사 동안 세포가 건조되지 않게 하기 위하여 phosphate buffered saline (PBS) 2㎖를 세포 배양 접시에 넣은 후 UVB 를 10mJ/W 로 조사하였다.
- 피부는 자외선에 노출되어 있고 활성 산소 종이 생성되는 광화학적 반응들이 계속해서 일어나고있으므로, UVB에 대한 射干 에탄올추출물의 효과를 조사하였다. 본 실험 결과, UVB 조사에 의해 B16/F10 세포의 생존률은 현저히 감소되었고, 射干 에탄올추출물 전처리군에서는 UVB군에 비하여 회복 효과가 뚜렷하였다(Fig.
대상 데이터
- Centrifuge HA-12, Clean bench, CO2 incubator, Micro 17TR centrifuge는 한일기기사 (Korea) 제품을, ELISA reader는 Bio-TEK사 (Japan) 제품을, Electrophoresis power supply는 Amersham사(USA) 제품을, ChemidocXRS image analysis는 Bio-rad사 (USA) 제품을 사용하였다.
- Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)와 RPMI 1640 배지는 Gibco사(USA) 제품을, fetal bovine serum(FBS) 은 Hyclones사 (UK) 제품을, dimethylsulfoxide (DMSO), a -melanocyte stimulating hormone(a-MSH), bovine serum albumin(BSA), 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA), phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF), triton X-100, catechol, mushroom tyrosinase, 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)은 Sigma사(USA) 제품을, protein assay 시약은 Bio-rad사 (USA) 제품을 사용하였고, methanol(MeOH), ethyl ether, acetic acid, 3-(4, 5-Dimethylithiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 시약은 Sigma사(USA) 제품을 사용하였다.
- 37-C, 5% CO2 하에서 12~24시간 배양한 후 disc 주변의 clear zone 크기를 측정하여 항균활성으로 나타내었다. 대조군으로 80% 에탄올을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 여드름의 원인 균인 Propionibacterium acnes (KCCM41747)와 호기성그람 양성 균주인 Staphylococcus epidermidis (KCTC1917), Staphylococcus aureus (KCTC1927)를사용하였다.
- 실험에 사용된 射干(Belamcandae Rhizoma) 은신우약업사(서울)에서 구입한 국산 규격품을 정선하여 원광대학교 한의학전문대학원의 약재보관 냉동고에 보관하여 사용하였다.
- 한국 세포주은행에서 분양받은 B16/F10 멜라닌 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM) 을 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value 를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포 내 tyrosinase 활성은 Matinez-Esparza 등의 방법 14)으로 측정하였다. B16/F10 멜라닌세포주를 6 well 배양용기에 5x104/well 씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후, 시료와 a -MSH(20 nM)을 각각 처리하고 3일간 배양하였다.
- 항균활성 평가는 paper disc diffusion 법을 이용하였다. P.
성능/효과
- 1. 射干 에탄올추출물은 200 ㎍/ml 농도에서 60.8% 의 DPPH 라디칼 소거 효과를 보였다,
- 2. 射干 에탄올추출물은 UVB에 의한 세포독성에 대해 세포생존률 회복효과를 보였다.
- 3. 射干 에탄올추출물은 S aureuse S. epidermidis 균주에서 항균효과가 있었으나, P. acnes 균주에서는 항균효과가 없었다.
- 4. 射干 에탄올추출물 100 ㎍/ml 농도에서 B16 /F10 세포의 생존률은 72.6%로 나타났다.
- 5. 射干 에탄올추출물은 100 ㎍/ml 농도에서 B16/F10세포의 tyrosinase 활성을 170±37%로 촉진하였다.
- B16/F10 세포에 UVB 10 mJ/cm2를 조사하고 24 시간 후 관찰한 결과 B16/F10 세포의 생존률이 현저히 감소하였다. 그러나 射干 에탄올추출물 100 ㎍/ml 처리군에서는 UVB에 의한 세포독성을 억제하였다(Fig.
- Tyrosinase의 DOPA oxidase 활성을 관찰한 결과 射干 처리군은 대조군에 비해 tyrosinase 활성이 증가하였다. 또한 射干 처리군은 대조군에 비하여 수지상 가지돌기가 증가하였다 (Fig.
- 射干 에탄올추출물이 B16/F10 세포의 tyrosinase 효소 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 射干 에탄올 추출물 50 Ng/m과 100 ㎍/ml 농도에서 각각 대조군의 182 ± 34%, 170 ± 37%로 나타났다(Fig. 5). 따라서 射干 에탄올추출물은 B16/F10 세포의 tyrosinase 활성을 증가시켰음을 알 수 있었다.
- 5). 따라서 射干 에탄올추출물은 B16/F10 세포의 tyrosinase 활성을 증가시켰음을 알 수 있었다.
- 따라서 피부 상재균인 P acnes, S. aureus, S epidermidis 균주에 대한 射干 에탄올추출물의 항균 활성을 조사한 결과, S. aureus 균주와 S epidermidis 균주의 경우 항균효과를 나타냈으나, P. acnes 균주에서는 항균활성을 나타내지 않았다
- 조사하였다. 본 실험 결과, UVB 조사에 의해 B16/F10 세포의 생존률은 현저히 감소되었고, 射干 에탄올추출물 전처리군에서는 UVB군에 비하여 회복 효과가 뚜렷하였다(Fig. 2). 따라서 射干 에탄올 추출물의 UVB-방어효과는 비교적 작지만 일부 射干추출물의 항산화작용에 의한 것으로 생각된다.
- 이밖에도 감초22,23), 더덕24), 천화분25), 백출26), 사삼 27) 등의 식물추출물이 멜라닌 합성억제 효능이 있다고 보고되었다. 본 실험에서 멜라닌 합성에 미치는 射干 에탄올 추출물의 효과를 조사한 결과 100 Ng/ml 농도에서 B16/F10세포의 tyrosinase 활성을 증가시켰으며, 수지상 가지돌기 또한 증가시켰다 (Fig. 5, 6).
- 실험 결과 射干 에탄올추출물 25, 50, 100 ㎍/ml 농도에서 B16/F10세포의 세포생존율은 각각 대조군의 100.5%, 87.1%, 72.6%로 나타났다(Fig. 4). 따라서 射干 에탄올추출물은 B16/F10 세포에 대해서 100 ㎍/ml 농도에서 세포 생존률이 약간 감소하였다.
- 실험 결과 射干 에탄올추출물은 50, 100, 200 , ㎍/ml 농도에서 대조군의 97.2%, 93.3%, 60.8% 로 200 Mg/ml 농도에서만 일정정도의 DPPH 라디칼 소거효과를 보였다. 이는 항산화 대조물질로 알려져 있는 butylated hydroxy toluene(BHT, SC50 : 50 Mg/ml) 및 ascorbic acid(SC5o : 22 [㎍/ml]와 비교하여 항산화효과는 적은 것으로 나타났다 (Fig.
- 실험 결과, S aureus 균주의 경우 5, 10 mg/ml 농도에서 각각 19 mm, 22 mm의 투명 대를 형성하였으며, S. epidermidis 균주의 경우 5, 10 mg/ml 농도에서 각각 10 mm, 20 mm의 투명 대를 형성하였다(Fig. 3 & Table 1). 그러나 P.
- 이상의 결과 射干 에탄올추출물은 항산화 효과와 S aureus, S epidermidis 균주에 대해 항균 활성이 있으며, 멜라닌세포에서는 멜라닌 합성을 촉진하였다.
후속연구
- 이상의 결과 射干 에탄올추출물은 항산화 효과와 S. aureus, S. epidermidis 균주에 대해 항균 활성이 있는 것으로 나타났으며, UVB에 의한 세포독성을 억제하는 결과를 보였으며 멜라닌세포에서는 tyrosinase 활성을 증가시켰는바 인체를 보호하기 위한 멜라닌 합성의 반응인지, 아니면 미백효과를 억제하는 것인지에 대한 연구는 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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