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문제 정의
- 7 세포에서 항염증 효과가 있음을 밝혔다. 24)본연구에서는 괴화에서 분리한 새로운 검색물질인 kaempferol- 3-O-P-D-sophoroside (KS)의 항염증 효과와 그 aglycone인 kaempf&ol과의 작용을 비교하여 KS가 어떤 기전을 통해 항염증 효과를 나타내는지 연구하였다.
- 항염증 약물의 개발을 시도하고 있다. 본 논문에서는 이러 한 연구 중 괴각으로부터 분리한 kaempferol-3-O-P-D- sophoroside (Fig. 1)가 LPS에 의해 활성 화된 RAW 264.7세포에서 항염효과를 나타내는 기전을 연구 하였으며 염증에 괸려된 다양한 단백질과' mRNA 그리고 cytokine의 발현을 측정하였다.
- 본 연구진은 여러 천연물의 추출물 및 분리된 단일화합물들의 항염증 효과를 검색하고 그기전을 규명함으로써 새로운 항염증 약물의 개발을 시도하고 있다. 본 논문에서는 이러 한 연구 중 괴각으로부터 분리한 kaempferol-3-O-P-D- sophoroside (Fig.
제안 방법
- 2 mM dNTP, 乂10 reaction buffer 그리고 5' 와 3' primers 100 pmot을 포함한 전체 부피 25 μL의 시료를 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA)를 이용하여 PCR 분석을 하였다. PCR 반응은 95℃ 에서 2분간 initial denaturation 시킨 후 iNOS (95℃ 1 분 danaturation, 60℃ 1 분 annealing 그리고 72℃ 1.5분 extension), COX-2 (94℃ 1 분 danaturaion" 60℃ 1 분 annealing 그리고 72℃ 1 분 extension), TNF-a (95℃ 1 분 denaturation, 55℃ 1 분 annealing 그리고 72 1 분 extension) 그리고 IL-6 (94℃ 1 분 denaturation, 56℃ 1 분 annealing 그리고 72℃ 1 분 extension) 를 30 회 amplification 하였다. 아번 연구에서 아래의 목록과 같은 PCR primers 가 사용되었으며 Bioneer (Seoul, Korea) 에서구입하였다.
- - Easy Blue®kits (Intron Biote산mology)를 이용하여 kit의 protocol에 따라 전체 cellular RNA를 추출하였다. 각각의 시료에서 MuLV reverse transcriptase, IrnM dNTP 그리고 oligo (dT]2.
- - KS 와 대조약물로 KS의 aglycone인 kaempf&이의 RAW 264.7 세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. KS는 100μM까지 RAW 264.
- - KS가 RAW 264.7 세포에서 LPS] 의한 pro- inflammatory cytokine의 형성을 억제히는지 알아보기 위해 ELISA 와 RFPCR 을 이용하여 TNF-a와 IL-6 의 생성 및 mRNA 발현을 측정하였다. LPS 처리에 의한 TW-a의 생성이 KS의 12.
- LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포의 배앙액 중에 생성된 nitrite 양을 Griess 시약을 사용하여 KS의 NO 생성저해 효과를 조사하였다. KS는 농도 의존적으로 NO 생성을 저해하였으며 (Fig.
- - RAW 264.7 세포를 dish에 각각 2)시05 cells/dish 농도로 분주한 후, Invitrogen (CA, U.S.A.)에서 구입한 LipofBctoiine 2000 Reagen® 이용하여 NF-kB luciferase reporter plasmid DNA를 형질감염 (transfection)시켰다. 형질감염 48시간이 경과한 후 31x10, cell/well로 12 well plat冽 세포를 분주하고 KS를 1시간 동안 전처리 한 후 LPS (1 μg/ml)를 처리하였다.
- - 세포배양액을 취해 각각 R&D kit의 지시에 따라 PGE2, TNF-a 및 IL-6를 정량하였다.
- 형질감염 48시간이 경과한 후 31x10, cell/well로 12 well plat冽 세포를 분주하고 KS를 1시간 동안 전처리 한 후 LPS (1 μg/ml)를 처리하였다. 2갸시간 후세포를 수집하여 luciferase assay system (Promega, U.S.A.) 와 luminometer (Perkin Elmer Cetus, U.S.A)를 이용하여 luciferase 활성을 측정하였다.
- 양성 대조군으로는 선택적'인 COX-2 저해제로 알려진 NS398 (5 μM)을 시용하였다. KS 에 의한 PGE, 생성 저해와 COX-2 발현의 상관성을 알아보기 위하여 Western blot 과 RFPCR로 COX-2 단백 질과 mRNA 발현을 조사하였다. LPS에 의해 COX-2 단백질이 뚜렷하게 증가하였으며' 50 μMKS에서 50.
- arginene과의 기질 경쟁에 의하여 iNOS 저해제로 알려진 L-NIL (10 pM>을 사용하였다. KS에 의한 Nitrite의 생성 억제와 iNOS 발현의 상관성을 알아 보- 기 위하여 Western blot 과 RTPCR로 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 조사하였다. LPS에 의해 iNOS 단백질이 뚜렷하게 증가하였으며, 100 μM KS에 의해 iNOS 단백질의 발현이81.
- 의한 NW-kB의 활성화를 억제 하는지 알아보기 위해 luciferase assay를 수행하였다. Lipofectamine 2000시약을 사용하여 RAW 264.7 세포에 일시적으로 pNF-KB-luc plasmid 를 transfection 시키고 KS 또는 kaempfferol을 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에 LPS (1 ㎍/㎖)로 자극을 가한다. KS가 LPS에 의해 유도된 NF-kB 의존적인 luciferase 효소의 발현을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰으며 50 (1M에서 22.
- Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60 (Merck, Germany)을 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA)으로, FABMS는 JMS- 700 (JEOL, Japan)로 측정하였다. Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycine life Technologies Inc.
- 7 세포는 10% FBS 및 penicillin (100 μg/ml), streptomycin (100U/ml)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 배양했다. RAW 264.7 세포에 시료용액의 여러 농도 (25, 50, 100 μM) 또는 양성 대조군을 1시간 전처리한 후 LPS (1 μg/mL)를처리하고 24시간 배양하였다.
- 5 μg/μ 1 를 이용하여 1 μg의 RNA 를 역전사하여 cDNA를 얻었다. cDNA에 Taq DNA polymemse 1 unit, 0.2 mM dNTP, 乂10 reaction buffer 그리고 5' 와 3' primers 100 pmot을 포함한 전체 부피 25 μL의 시료를 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA)를 이용하여 PCR 분석을 하였다. PCR 반응은 95℃ 에서 2분간 initial denaturation 시킨 후 iNOS (95℃ 1 분 danaturation, 60℃ 1 분 annealing 그리고 72℃ 1.
- 9 g) 및 물 분획물을 얻었다. n-BuOH 분획물 (81 g)을 CHCkMeOH의 혼합용매를 용출 용매로 사용하여 기울기 용리 방식으로 silica gel column chromatography (c.c)를 실시하여 총 11개의 소분획 (B1 ~B11)으로 나누었다. 이 중 B7번 분획을 silica gel c.
- 시킨 후 EtOAc (1 Lx2) 및 n-BuOH (750mLx2)로 순차적으로 분획하였다. 각각의 분획물을 농축하여 EtOAc 분획물 (9.42 g), n-BuOH 분획물 (81.9 g) 및 물 분획물을 얻었다. n-BuOH 분획물 (81 g)을 CHCkMeOH의 혼합용매를 용출 용매로 사용하여 기울기 용리 방식으로 silica gel column chromatography (c.
- 각각의 시료에서 MuLV reverse transcriptase, IrnM dNTP 그리고 oligo (dT]2.]8) 0.5 μg/μ 1 를 이용하여 1 μg의 RNA 를 역전사하여 cDNA를 얻었다. cDNA에 Taq DNA polymemse 1 unit, 0.
- cells/welE. 세포를 동일하게 분주하고 24시간동안 배양한 후 여러 농도의 시료 용액을 두 군으로 나누어 배지에 희석하여 첨가 하였다. 1시간후 한 군에만 LPS (1 μg/ml)를 처리하였다.
- (CHCl3-MeOH-H2O=65:35:10)eM 노란분말상의 kaempferol-3-O-P-D-sophoroside (650 mg)을 분리하였다. 이 화합물의 H 13C-NMR 및 MS의 데이터를 기존 문헌과 비교하여 구조를 동정하였다.
- 7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO」의 형태로서 측정하였다. 즉 세포배양 상둥액 100 μ1와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid 와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine- HC1] 100 μ}를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540mm에서 흡광도를 측정하였다.
- 후에 PCR 반응 시킨 시료를 2% agarose gel 에서 전기영동하고 etfiidim bromide 염색과 UV 조사를 통해 확인하였다.
대상 데이터
- Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60 (Merck, Germany)을 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA)으로, FABMS는 JMS- 700 (JEOL, Japan)로 측정하였다.
- 2% 저해하였다. Kaempf&ole 25 μM에서 NO 생성을 49.4% 저해하였으며 양성 대조군으로는 L.arginene과의 기질 경쟁에 의하여 iNOS 저해제로 알려진 L-NIL (10 pM>을 사용하였다. KS에 의한 Nitrite의 생성 억제와 iNOS 발현의 상관성을 알아 보- 기 위하여 Western blot 과 RTPCR로 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 조사하였다.
- (Grand Island, 1PY。에서 구입 하였다. Kaempferol, 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), sulfanilamide, aprotinin, leupeptin, phenylmethylsulfonylfluride (PMSF), dithiothreitol (DTT), L-N6-(1 -iminoethyl)lysine (L-NIL), NS-398, Escherichia coli 1 ipopolysaccharide (LPS)는 Sigma Chemical Co. (CA, U.S A)에서 구입하였으며, COX- 2 와 iNOS monoclonal antibodies 및 peroxidase conjugated secondary antibody는 Santa Cniz Biotechnology (CA, U.S.A.)에서 구입하였다. iNOS, COX-2, TNF-a, IL-6 그리고 P-actin oligonucleotide primers 는 Bioneer (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- 7 세포에서 LPS] 의한 pro- inflammatory cytokine의 형성을 억제히는지 알아보기 위해 ELISA 와 RFPCR 을 이용하여 TNF-a와 IL-6 의 생성 및 mRNA 발현을 측정하였다. LPS 처리에 의한 TW-a의 생성이 KS의 12.5 μM에서 유의성 감소되는 것을 획인하였으며 (26.1%). 25 μM에서 TNF-a의 생성을 36.
- )에서 구입하였다. iNOS, COX-2, TNF-a, IL-6 그리고 P-actin oligonucleotide primers 는 Bioneer (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 그리고 TNF-a, IL-6, prostaglandin 旦 측정을 위한 kit는 R&D systems (MN, U.
- iNOS, COX-2, TNF-a, IL-6 그리고 P-actin oligonucleotide primers 는 Bioneer (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 그리고 TNF-a, IL-6, prostaglandin 旦 측정을 위한 kit는 R&D systems (MN, U.S.A.:에서 구입하였다.
- 시료의 주줄과 분획에 사용한 유기 용매는 대정 화학주식회사 (Gyonggi-do, Korea)에서 생산한 1급 시약을 사용하였다.Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60 (Merck, Germany)을 사용하였다.
- 5분 extension), COX-2 (94℃ 1 분 danaturaion" 60℃ 1 분 annealing 그리고 72℃ 1 분 extension), TNF-a (95℃ 1 분 denaturation, 55℃ 1 분 annealing 그리고 72 1 분 extension) 그리고 IL-6 (94℃ 1 분 denaturation, 56℃ 1 분 annealing 그리고 72℃ 1 분 extension) 를 30 회 amplification 하였다. 아번 연구에서 아래의 목록과 같은 PCR primers 가 사용되었으며 Bioneer (Seoul, Korea) 에서구입하였다. : sense strand iNOS, 5'-ATT GGC AAC ATC AGG- TCG GCC ATC ACT-3\ anti-sense strand iNOS, 5‘- GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA- CTC-3'; sense strand COX-2, 5'-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT-3' anti-sense strand COX-2, 5'-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA-3'; sense strand TNF-a, 5'-ATG AGC ACA GAA AGC ATG- ATC-3\ anti-sense strand TNF-a, 5‘- TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT-3'; sense strand IL-6, "GAG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CC-3\ anti-sense strand IL-6, 5'-AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA-3',5'-GTG CTG CCF AAT GTC CCC TTG AAT C-3'; sense strand p-actin, 5'-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA- TCC GT-3\ anti-sense strand p-actin, 5'-CCT AGA AGC AH' TGC GGT GCA CGA TG-3L Amplification
- 5% 저해하였다. 양성 대조군으로는 선택적'인 COX-2 저해제로 알려진 NS398 (5 μM)을 시용하였다. KS 에 의한 PGE, 생성 저해와 COX-2 발현의 상관성을 알아보기 위하여 Western blot 과 RFPCR로 COX-2 단백 질과 mRNA 발현을 조사하였다.
- - KS를 처리한 세포 및 대조군을 PBS로 씻어낸 후 lysis buffol.인 PRO-PREP (Intron Biotechnology)으로 단백질을 추출한 후 원심분리하여 상둥액을 취하였다. 상둥액을 Bradford 시약을 사용해 단백질 농도를 정량하여 50 μg의 단백질을 취했다.
데이터처리
- - 실험치의 값은 mean士S.D로 나타냈으며 분석은 Studenㅅ's t-test로 그 유의성을 나타내었다.
- of three independent experiments. ^<0.05 vs. the control group; *pv0.05, **p<0.01 vs. the LPS-treated group; the significances of the difference between the treated groups was evaluated using the Student's z-test.
성능/효과
- 100 μMKS에서 57.4%의 PGEe 생성억제 효과를 나타내었으며, KS 의 aglycone인 kaempferol (25 μM) 에서 PGEe의생성을 54.5% 저해하였다. 양성 대조군으로는 선택적'인 COX-2 저해제로 알려진 NS398 (5 μM)을 시용하였다.
- 7 세포에 일시적으로 pNF-KB-luc plasmid 를 transfection 시키고 KS 또는 kaempfferol을 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에 LPS (1 ㎍/㎖)로 자극을 가한다. KS가 LPS에 의해 유도된 NF-kB 의존적인 luciferase 효소의 발현을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰으며 50 (1M에서 22.4% 감소하였다. kaempfferole 25 |1M에서 이와 비슷한 효과(22.
- 94 μM로 확인되었다. Kaempf&ole 50 μM에서 14.5%의 세포가 사멸하여 독성을 나타내었으며 IC50는 196.18 μM로 KS에 비해 RAW 264.7 세포에서 독성이 높게 나타났다 (Fig.2b).
- 5a). LPS에 의한 IL-6생성은 100 μM KS에서 73.1% 저해 되었으며 KS의 aglycone인 kaempferol (25 liM) 에서는 78.9%가 저해됨을 확인하였다 (Fig.6a). 또한 KS는 LPS에 의한 TW-a와 IL-6 mRNA 의 발현을 유의성 있게 저해하며 TNF-a 와 IL-6 생성 저해효과와 상관성이 있음을 확인하였다 (Fig.
- 5 iM에서부터 유의성 있게 감소 시켰으며 IL-6의 생성도 농도 의존적으로 유의성 있게 저해하였다. PCR로 분석한 결과 IW-a와 IL-6 mRNA 발현과 매우 유사한 경향을 나타냄으로써 TNF- a와 IL-6 형성 억제는 mRNA의 발현저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.
- KS 는 LPS에 의해 형성되는 PGE?를 유의성 있게 감소시키며 NO 생성저해 보다 더 뚜렷하게 나타났다. Western blot과 PCR을 이용하여 COX-2 단백질과 mRNA의 발현을 확인한 결과 KSSq- kaempferoH] 의한 PGE, 생성 저해가 유전자 단계에서 조절됨을 확인할 수 있었다.
- 작용한다.迨 본 실험에서는 luciferase assay를 이용하여 Kg kaempfferolol NF-kB 전사 활성을 감소시킴을 확인 함으로써 Kg kaempf&olol NF-kB 신호전달의 조절에 의해 염증 전구물질의 형성을 억제함을 확인하였다.
- 6a). 또한 KS는 LPS에 의한 TW-a와 IL-6 mRNA 의 발현을 유의성 있게 저해하며 TNF-a 와 IL-6 생성 저해효과와 상관성이 있음을 확인하였다 (Fig.5b and 6b).
- 7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NOS] 생성을 저해함을 확인하였다. 또한 Western bkrt과 RT- PCR로 분석한 결과 KS와 kaempf&ol에 의한 iNOS의 발현억제는 NO 형성 억제와 유사한 경향을 나타냄으로 NO 형성 억제는 iNOS의 발현저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.
- 본 실험결과를 요약하면 KS는 kaempferoM] 비해 낮은 세포독성을 나타내며 RAW 264.7 세포에서 NF-kB 전사 활성을 억제 함으로써 LPS에 의해 유도되는 iNOS 그리고 COX-2 단백질과 iNOS, COX-2, TNF-a 그리고 IL-6 유전자의 발현을 효과적으로 저해한다. 그러므로 이러한 결과들은 KS를 이용하여 염증성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 의약품의 개발가능성을 제시하고 있다
- 본 연구진은 이전의 보고에서 회화나무(Sophora japonica L.)의 성숙한 열매인 괴화에서 분리한 genistein-4-O-a-L- rhamnopyranosyl-( W2)-p-D-glucopyranoside (GRG)가 RAW 264.7 세포에서 항염증 효과가 있음을 밝혔다. 24)본연구에서는 괴화에서 분리한 새로운 검색물질인 kaempferol- 3-O-P-D-sophoroside (KS)의 항염증 효과와 그 aglycone인 kaempf&ol과의 작용을 비교하여 KS가 어떤 기전을 통해 항염증 효과를 나타내는지 연구하였다.
- - LPS 처리에 의해 RAW 264.7 세포에서 PGE?의 생성이 뚜렷하게 증가하였으며' KS가 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.4a).
- 이의 배당체인 KS는 LPS에 의한 PGE, , NO 그리고 여러 cytokines들의 형성억제에 있어 kaempf&ol에 비해 효과가 낮게 나타났다. 그러나 kaempfferole RAW 264.
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