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문제 정의
- 신생아의 분변에서 분리 및 선발하였다. 선발균주에 의한 장내 유해미생물 억제, 혈중 cholesterol 저하, 과산화수소에 대한 저항성 등과 더불어 발효과정 중 생성되는 유기산, 풍미 성분 및 유단백질 유래 펩타이드 등에 관한 기초 지식을 확보하여 우수한 starter culture 종균으로 개발하고자 실시하였다.
제안 방법
- 7% 첨가하여 멸균한 다음 한천평판배지를 제조하였으며, 복합담즙산은 Sigma사(USA)의 것을 사용하였다. 0.2% sodium thioglycolate(Sigma Chem. Co., USA)가 첨가된 MRS 액체배지에서 2회 계대배양된 L. acidophius를 복합담즙산염이 첨가된 MRS 한천평판배지에 도말 접종한 후 Gaspak anaerobic system(BBL Co, USA)을 사용하여 37℃에서 3일간 배양하고, 복합담즙산 분해 반응의 정도는 균락 주위에 형성된 침전환을육안으로 관찰하였다.
- Lactobacillie 동정. 1차로 선발한 11균주를 API kit(API50 CHL, bioMerieux, France)# 이용하여 당 발효 시험을 실시한 후 그 결과를 LAB PLUS 프로그램 (API50 CHL, bioMerieux, France)尖로 분석하여 Beigey's Manual 기준으로 Lactobacillus 속 균의 22종의 당 이용성에 따라 L. acidophilus 5균주 SD 101, SD 102, SD 103, SD 104, SD 105를 선발하였으며 결과는 Table 2와 같다.
- 균체 지방산 조성. 2차 동정을 위해 선발된 11종의 Lactobacilli 의 균체 지방산 조성을 확인하기 위해 Rizzo 등7)의 방법을 일부 개선하여 다음과 같이 전처리 하였다. MRS액체배지에서 1R18시간 배양한 후 17, 400xg로 10분간 원심분리하여 얻어진 균체를 멸균 증류수로 2회 세척한 후 동결건조 하였으며, 동결건조된 균체 20 mg을 15 m/ 시험관에 넣은 뒤 45 g NaOH에 150ml의 MeOH와 증류수를 각각 첨가하여 제조된 검화용액을 Im/ 첨가한 후 5~10초간 강하게 교반하고 10(TC에서 3분간 cell lysis를 일으켜 세포지질로부터 인지질을 추출한 후 냉각하고, 6N HC1 325 m/와 275 ml MeOH가 혼합된 methylation 용액 2 m/ 첨가한 후 80℃에서 10분간 열처리하여 hexane과 methylene ether(MTBE, Sigma Chem.
- 3으로 조절한 다음 4P에서 4, 350xg로 10분간 원심분리한 후 상징액을 실험에 사용하였다. ACE 저해 효과는 Maiuyama와 Suzuki15^ 방법을 개선하여 다음과 같이 시행하였다. 실험에 사용한 borate-NaCl 완충용액은 0.
- ACE 저해 활성. ACE 활성 억제력이 있는 펩타이드를 탐색하기 위해 선발된 L. acidophilus 탈지유에서 배양한 후에 얻어진 펩타이드의 ACE 활성 억제를 실험하였으며 결과는 Fig. 2와 같다. 시험 균주들에 의해 생성된 펩타이드에 의해 약 8~18 %의 ACE활성이 억제되었고, 그 중 £.
- 1% peptone 용액으로 세척한 다음 적당한 비율로 희석하였다. API kit의 사용법에 따라 접종액 (inoculum)을 만들고 API50 CHL배지에 접종하여 strip을 만든 다음 37P에서 48시간 배양한 후색 변화를 관찰하였으며, 실험 결과는 Bergey's manual과 API LAB PLUS 프로그램 (API50 CHL, bioMerieux, France)으로비교 분석하였다.
- acidophilus SD 105를 Listeria와 혼합 배양하여 생육 억제 효과를 실험하였다. L. acidophilus SD 105를 24시간 배양한 MRS액체배지에 L. monocytogenes 및 L. iwm/vzT를 첨가하여 생육 억제 효과를 측정하였으며 결과는 Fig. 1에 나타난 바와 같다. 혼합 배양 1시간 이후부터 시험 균주들에 의한 1.
- acidophilus 의 hydrogen peroxide에 대한 저항성을 Kullisaar 등(3)의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 실시하였다. L. acidophiluse: MRS액체배지에서 24시간 배양한 후 isotonic saline으로 2회 세척한 다음 107 cfU/mf수준이 되도록 isotonic saline에 접종하고 0.4 mM hydrogen peroxide를 첨가한 후 37P에서 보관하면서 시료를 취하여 생균수를 측정하였다. 생균수는 시료를 0.
- , USA) 에무균적으로 접종하고 냉장 상태에서 실험실로 운송하였다. Lactobacilli의 분리를 위해 신생아의 분변 시료를 37P에서 약 3일간 배양한 후 MRS 한천배지 상에 나타난 특징적인 균락을백금이로 채집하여 MRS액체배지에 접종하고, 다시 배양한 후 얻어진 균주들을 4, 350xg에서 15분간 원심분리(J2-21ME, JA- 20, Beckmann, Germany)하여 상징액을 제거한 후 2.5ml의 12% 탈지유(DifS lab., USA)와 2.5 nW의 MRS 액체배지를 넣어 혼합한 다음 시험에 사용될 때까지 -6(TC에서 보관하였으며, 분리된 균주들은 해동하고 37P에서 2회 계대배양하여 pH 2.5에서 생존율이 약 85% 이상이며 homo 유산 발효를 하는 균주를 우선 선발하여 시험에 사용하였다.
- Listeriae 흔합 배양. Listeria에 대한 생육억제 효과가 다른 병원성 미생물에 비해 매우 뚜렷하게 나타남에 따라 L. acidophilus SD 105를 Listeria와 혼합 배양하여 생육 억제 효과를 실험하였다. L.
- yvelshimeri KCTC 3587, Listeria ivanovii KCTC 3444, Bacillus cereus KCTC 1014 및 Streptococcus mutans NN2025에 대한 억제효과를 다음과 같이 실험하였다. Metal boring cylinder(diameter; 8 mm)를 이용하여 Listeria는 Listeria 선택배지(Oxoid Ltd., England)에 E. coli, S. typhimurium, B. cereus 및 S. nntans는 Tryptic Soy 한천배지 (Difbo Lab., USA)에 천공된 평판을 만든 다음 각각의 한천평판에 멸균한 면봉으로 병원균을 도말하였다. Well의 바닥에 Listeria 선택배지 또는 Tryptic Soy 한천배지를 30 μ/씩 주입하여 믄]고, 시 험공에 72시간 배양한 L.
- 선발된 L acidophilus의 복합담즙산염 분해능력을 즉정하기 위해 Dashkevicz와 Feighmer(2)의 agar plate assay를 개선하여 실험하였다. Taurocholate(TCA), taurocheno- deoxycholate(TCDCA), taurodeoxycholate(TDCA), taurolitho- cholate(TLCA), glycocholate(GCA), glycochenodeoxycholate (GCDCA) 및 glycodeoxycholate(GDCA)를 MRS 액체배지에 0.05% 또는 0.5%를 각각 첨가하고 한천 (DifS Lab., USA)을 1.7% 첨가하여 멸균한 다음 한천평판배지를 제조하였으며, 복합담즙산은 Sigma사(USA)의 것을 사용하였다. 0.
- , USA)에 천공된 평판을 만든 다음 각각의 한천평판에 멸균한 면봉으로 병원균을 도말하였다. Well의 바닥에 Listeria 선택배지 또는 Tryptic Soy 한천배지를 30 μ/씩 주입하여 믄]고, 시 험공에 72시간 배양한 L. acidophilus 배양물을 150μ씨 접종한 후 각 한천평판을 4℃에서 12시간 방치한 다음 37C에서 24시간 배양 후 억제환을 관찰하였다. 또한 유산균이 생성하는 산에 의한 병원균 억제 효과를 배제하기 위하여 유산균 배양액을 4, 350x응로 10분간 원심분리하여 균체를 침전시킨 후 pH 7.
- , USA)을 사용하였다. 가용성 철분의 농도를 측정하기 위해 선발 균주 중 상대적으로 철분 가용화율이 높은 것으로 나타난 4종의 L. acidophlims 의해 얻어진 1 mg의 동결건조된 펩타이드 시료를 10mZ의 증류수에 용해시킨 다음 2.5 m/의 FeCL와혼합하고 IN NaOH를 이용하여 pH 6.0으로 조절한 후 37℃ 에서 시간 반응시키고, 40℃에서 4, 350xg로 30분간 원심분리하여 상징액내 가용성 철분의 양을 Inductively coupled plasma (ICP) spectrophotometer(SPECTRO Anal. Inc., Germany)를 이용하여 측정하였다.
- acidophilus 배양물을 150μ씨 접종한 후 각 한천평판을 4℃에서 12시간 방치한 다음 37C에서 24시간 배양 후 억제환을 관찰하였다. 또한 유산균이 생성하는 산에 의한 병원균 억제 효과를 배제하기 위하여 유산균 배양액을 4, 350x응로 10분간 원심분리하여 균체를 침전시킨 후 pH 7.0으로 중화시킨 유산균 배양물의 상층액을 다시 well diffusion assay 하였다.
- acidophilus 8% 탈지유에 각각 접종하여 37C에서 24시간 배양한 후 배양액내 유기산을 Laye 등)의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 측정하였다. 발효 과정 중 각 시간대별 배양액 5g을 취하여 여기에 0.0085N H2SO4(Matsunoen Chem. Ltd., Japan) 25 ml를 첨가한 후 실온에서 2시간 방치하고, 4, 350xg로 10분간 원심분리한 후 얻어진 상징액을 0.2 μm membrane필터로 여과하여 분석 시료로 사용하였다. 유기산 분석은 HPLC(Model LC6A, Shimazu Co, Japan)를 이용하였고 분석 조건은 UVMsible detector (Shimazu, Model SPD-6AV Japan) 와 Aminex HPX-87H column(Bio- Rad, USA)을 사용하였다.
- acidophilus 8% 탈지유에 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액내 휘발성 향미 성분을 Bassette과 Ward11)의 방법에 따라 분석하였다. 배양액 50 g을 Kemmerer-hallet type micro-kjeldahl distillation unit 의증류 플라스크에 넣고 내부표준용액으로 ethyl acetate 5 ppm을 첨가한 후, 증류시켜 증류액 5 ml를 수집하고 이 중 2 ml를 20 m/의 space vial에 취한 후 여기에 Na2SO4 anhydrous 05 함을 첨가한 후 Teflon 마개로 막고 60℃ 수조에서 2분간 정치시킨 후, 5분간 교반하고 다시 8분간 정치시킨 후 headspace 1 m® 취하여 GC로 분석하였으며 FID detector와 Supelcowax-10 fused silica capillary column(Supelco Inc., USA)을 사용하였다. 정량 분석한 성분은 발효유의 주요 휘발성 향미성분인 acetaldehyde, acetone, ethanol 및 diacetyl이었다.
- Lactobacillie} 동정. 분리된 균주들은 crystal violet 용액으로 염색한 후 광학현미경 (Leitz Ltd., Germany)을 이용하여 선발된 11종의 Lactobacili의 형태를 관찰하고 Gram 염색, 15℃와 45 I에서의 생장 여부와 catalase 생성 여부 및 37℃에서 24시간 배양 후 정치한 MRS배지에서 hot loop 시험을 통한 gas 생성시험을 실시하여 생화학적 조사를 하였다. 선발된 11종의 Lactoba′의 당 이용성을 측정하기 위해 API kit(API 50 CHL, bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당 발효성을 하였다.
- 33 pm film thicknesses 사용하였다. 분석조건에 따라 측정된 유산균의 균체 지방산의 조성비 를 통해 Sherlock microbial identification system(SMIS, MIDI inc., USA)을 이용하여 동정하였다.
- 4 mM hydrogen peroxide를 첨가한 후 37P에서 보관하면서 시료를 취하여 생균수를 측정하였다. 생균수는 시료를 0.1% peptone 용액으로 희석하고 적당한 희석액을 MRS 한천배지에 접종하여 37℃에서 2일간 anaerobic jar(BBL Co, USA)를 이용하여 혐기 배양한 후 한천평판배지에 형성된 균락을 측정하였으며 생존율은 다음과 같이 계산하였다.
- , Germany)을 이용하여 선발된 11종의 Lactobacili의 형태를 관찰하고 Gram 염색, 15℃와 45 I에서의 생장 여부와 catalase 생성 여부 및 37℃에서 24시간 배양 후 정치한 MRS배지에서 hot loop 시험을 통한 gas 생성시험을 실시하여 생화학적 조사를 하였다. 선발된 11종의 Lactoba′의 당 이용성을 측정하기 위해 API kit(API 50 CHL, bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당 발효성을 하였다. 시험 균주를 MRS액체배지에서 16시간 배양한 후 0.
- acidophilusee 생산하는 펩타이드 또는 유단백질 가수분해물은 Nakamura 등14) 의 방법을 개선하여 다음과 같이 제조하였다. 선발된 5종의 L. acidophilus를 12% 탈지유에 2% 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 다음 50% lactic acid와 10N NaOH를 이용하여 탈지유 배양액의 pH를 4.6으로 조절한 후 4℃에서 4, 350xg로 10분간 원심분리하였다. 상징액의 pH를 10N NaOH를 이용하여 다시 pH 8.
- Listeriae 혼합 배양. 선발된 L acidophiluse 3기에서 24시간 라양시킨 MRS 액체배지 배양액에 Listeriae를 108 cfu/ml의 수준이 되도록 첨가하고 1시간 간격으로 L acidphilus와 Listened 생균수를 측정하였으며, 이때 생균수는 0.1% peptone 용액으로 적당히 희석한 후 시료를 0.02% sodium azide가 첨가된 MRS 한천배지에 접종하여 굳힌 다음 37P에서 48시간 배양한 후 측정하였으며, Listeriae] 생균수는 L. acidophiluse 동일한 방법으로 희석한 후 Listeria 선택배지에 도말하여 측정하였다.
- 복합담즙산염 분해. 선발된 L acidophilus의 복합담즙산염 분해능력을 즉정하기 위해 Dashkevicz와 Feighmer(2)의 agar plate assay를 개선하여 실험하였다. Taurocholate(TCA), taurocheno- deoxycholate(TCDCA), taurodeoxycholate(TDCA), taurolitho- cholate(TLCA), glycocholate(GCA), glycochenodeoxycholate (GCDCA) 및 glycodeoxycholate(GDCA)를 MRS 액체배지에 0.
- , USA)를 반응시 켜 Ferrozine 방법으로 용해도를 측정하였고, 펩타이드에 의한 철분의 가용화 실험은 다음과 같이 실시하였다. 선발된 L. acidophih 12% 탈지유에 2% 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 50% lactic acid와 10N NaOH를 이용하여 탈지유 배양액을 pH 4.6으로 조절하고 4, C에서 4, 350xg로 10분간 원심분리 하였다. 얻어진 상징액을 투석막(MW cut-off IkDa)에 담그고 증류수로 41에서 24시간 동안 투석시킨 후 동결건조 시켜 시료로 사용하였다.
- 유기산 측정. 선발된 L. acidophilus 8% 탈지유에 각각 접종하여 37C에서 24시간 배양한 후 배양액내 유기산을 Laye 등)의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 측정하였다. 발효 과정 중 각 시간대별 배양액 5g을 취하여 여기에 0.
- 유해 미생몰 생육억제. 선발된 L. acidophiluse 의한 병원성 미생물 억제 능력을 시험하기 위하여 well difiusion assay 방법을 개선하여 Escherichia coll ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Listeria monocytogenes KCTC 3710, L. yvelshimeri KCTC 3587, Listeria ivanovii KCTC 3444, Bacillus cereus KCTC 1014 및 Streptococcus mutans NN2025에 대한 억제효과를 다음과 같이 실험하였다. Metal boring cylinder(diameter; 8 mm)를 이용하여 Listeria는 Listeria 선택배지(Oxoid Ltd.
- 선발된 11종의 Lactoba′의 당 이용성을 측정하기 위해 API kit(API 50 CHL, bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당 발효성을 하였다. 시험 균주를 MRS액체배지에서 16시간 배양한 후 0.1% peptone 용액으로 세척한 다음 적당한 비율로 희석하였다. API kit의 사용법에 따라 접종액 (inoculum)을 만들고 API50 CHL배지에 접종하여 strip을 만든 다음 37P에서 48시간 배양한 후색 변화를 관찰하였으며, 실험 결과는 Bergey's manual과 API LAB PLUS 프로그램 (API50 CHL, bioMerieux, France)으로비교 분석하였다.
- 25m/의 IN HCF을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, L5 mJ의 ethyl acetate를 첨가하여 30초간 혼합하고 4, 350xgel]^ 10분간 원심분리 하였다. 얻어진 상징액 Iml를 시험관에 옮긴 후 8(TC에서 완전히 건조시키고 3 m/의 IM NaCl을 첨가하여 용해시키고 228nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 ACE 저해율은 아래와 같이 계산하였다.
- 6으로 조절하고 4, C에서 4, 350xg로 10분간 원심분리 하였다. 얻어진 상징액을 투석막(MW cut-off IkDa)에 담그고 증류수로 41에서 24시간 동안 투석시킨 후 동결건조 시켜 시료로 사용하였다. 1 mg의 동결건조된 시료를 10 m/의 증류수에 용해시킨 다음 2.
- 25 ml 첨가하고 서서히 회전하며 10분간 반응시킨 후 지방산을 추출하였다. 얻어진 용액의 하층 부분을 Pasteur 피펫을 이용하여 제거하고 여액에 NaOH 용액(10.8 g NaOH/ 900 m/ in deionized water) 3 ml를 첨가한 뒤 5분간 반응 시켜 유리지방산과 잔류 용매를 제거한 후 Na2SO4 anhydrous(Junsei Chem. Co., Japan)를 첨가하여 수분을 제거하고 분석시료로 하였다. 유산균의 지방산 조성을 분석하기 위해서 HP G1512A auto sampler가 장착된 HP 5890 Series II GC(Agilent Co.
- 2 μm membrane필터로 여과하여 분석 시료로 사용하였다. 유기산 분석은 HPLC(Model LC6A, Shimazu Co, Japan)를 이용하였고 분석 조건은 UVMsible detector (Shimazu, Model SPD-6AV Japan) 와 Aminex HPX-87H column(Bio- Rad, USA)을 사용하였다.
- ACE 저해 활성. 유단백질 분해에 의해 L. acidophilusee 생산하는 펩타이드 또는 유단백질 가수분해물은 Nakamura 등14) 의 방법을 개선하여 다음과 같이 제조하였다. 선발된 5종의 L.
- La어어cilli의 분리. 인체의 장내 환경에서 생존력과 정착성이 우수하고 발효유의 starter로서 적합한 L. acidophils를 분리하기 위하여 생후 2주일 이내 10명의 신생아의 분변에서 pH 5.5에서 생장이 가능한 Lactobacilli 34균주를 분리하였으며, 분리된 Lactobacilli 중에서 pH 2.5에서 생존율이 85% 이상이면서 homo 유산 발효를 하는 11균주를 선발하여 생화학적 특성을 확인하였다. 1차로 선발된 유산균주들의 공통된 생육 조건은 Table 1에서 보는 바와 같으며, 분리된 균주들은 Gram의 간균로 catalase를 생성하지 않고 45(C에서는 잘 생장하였으나 15에서는 생장하지 않았다.
- 철분 가용성 중가. 펩타이드 첨가 실험전 pH 변화에 따른 철분의 용해성 변화를 확인하기 위해 pH 2.0~7.0까지 pH를 달리하여 FeCl3(50 p, g/m/, Sigma Chem. Co., USA)를 반응시 켜 Ferrozine 방법으로 용해도를 측정하였고, 펩타이드에 의한 철분의 가용화 실험은 다음과 같이 실시하였다. 선발된 L.
- 8 mM의 농도가 되도록 borate-NaCl 완충용액에 용해하여 사용하였다. 펩타이드가 함유된 0.05 m/의 시료를 150 m/ 의 기질(3.8mM HippuiyUlistidyl-L-leucine)과 혼합하고 37 ℃에서 5분간 반응시킨 다음 0.05 m/의 ACE 조효소액을 첨가한 후 37℃에서 3(분간 반응시키고 0.25m/의 IN HCF을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, L5 mJ의 ethyl acetate를 첨가하여 30초간 혼합하고 4, 350xgel]^ 10분간 원심분리 하였다. 얻어진 상징액 Iml를 시험관에 옮긴 후 8(TC에서 완전히 건조시키고 3 m/의 IM NaCl을 첨가하여 용해시키고 228nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 ACE 저해율은 아래와 같이 계산하였다.
대상 데이터
- Lactobacilli 분리. 신생아(생후 2주 이내)의 분변을 무균 면봉으로 채취하여 0.02% sodium azide(Sigma Chem. Co., USA)가 첨가된 pH 5.5의 MRS액체배지(Difbo Lab., USA) 에무균적으로 접종하고 냉장 상태에서 실험실로 운송하였다. Lactobacilli의 분리를 위해 신생아의 분변 시료를 37P에서 약 3일간 배양한 후 MRS 한천배지 상에 나타난 특징적인 균락을백금이로 채집하여 MRS액체배지에 접종하고, 다시 배양한 후 얻어진 균주들을 4, 350xg에서 15분간 원심분리(J2-21ME, JA- 20, Beckmann, Germany)하여 상징액을 제거한 후 2.
- ACE 저해 효과는 Maiuyama와 Suzuki15^ 방법을 개선하여 다음과 같이 시행하였다. 실험에 사용한 borate-NaCl 완충용액은 0.2M H3BO4 (Sigma Chem. Co., USA)와 0.005 M Na2B4O7(Signia Chem. Co., USA)을 5.5:4.4의 비율로 혼합하여 pH 8.3으로 조절한 다음 최종 농도가 0.4M이 되도록 NaCl을 첨가하여 제조하였으며, 1 g의 rabbit acetone powder(Sigma Chem. Co., USA) 를 50 mN borate-NaCl 완충용액 (pH 8.3) 10 m/에 현탁하여 4, C에서 24시간 교반한 다음 4, C에서 17, 400xge 30분간 원심분리한 후 얻어진 상징액을 냉동보관하면서 ACE 조 효소액으로 사용하였다. ACE의 기질은 Hip-His-Leu(Sigma Chem.
- , Japan)를 첨가하여 수분을 제거하고 분석시료로 하였다. 유산균의 지방산 조성을 분석하기 위해서 HP G1512A auto sampler가 장착된 HP 5890 Series II GC(Agilent Co., USA)를 이용하였고 FID detects와 Ultra 2 column(Agilent Co., USA, 25 mx0.2mm id, 0.33 pm film thicknesses 사용하였다. 분석조건에 따라 측정된 유산균의 균체 지방산의 조성비 를 통해 Sherlock microbial identification system(SMIS, MIDI inc.
- , USA)을 사용하였다. 정량 분석한 성분은 발효유의 주요 휘발성 향미성분인 acetaldehyde, acetone, ethanol 및 diacetyl이었다.
이론/모형
- 얻어진 상징액을 투석막(MW cut-off IkDa)에 담그고 증류수로 41에서 24시간 동안 투석시킨 후 동결건조 시켜 시료로 사용하였다. 1 mg의 동결건조된 시료를 10 m/의 증류수에 용해시킨 다음 2.5m/의 FeCls와 혼합하고 IN NaOH를 이용하여 pH 6.0으로 조절한 후, 37P에서 1시간 반응하고 4, 000xg에서 30분간 40℃에서 원심분리하여 침전되지 않고 잔존한 상징액내의 가용성 철분의 양을 Ferrozine 방법으로 정량하였다. 가용성 철분이 함유된 10 m/의 상징 액에 0.
- 3. Changes of the iron solubility at various pH measured by Ferrozine method.
- 담즙산에 대한 내성 측정실험은 Ahn 등9)의 방법에 따라 16T8시간 배양한 L. acidophiluse: 1% bile extract(porcine; Sigma Chem. Co., USA)가 첨가된 MRS 액체배지에 1% 접종하여 37℃에서 2시간 배양한 후 생존율을 아래와 같은 식에 의해 측정하였다.
- acidophilus의 Probiotic 륵성. 위의 산성도에 대한 내성실험은 Hood와 Zottola, )의 방법에 따라 MRS 액체배지에서 16~18시간 배양한 L. acidophilus 4, 350xg로 15분간 원심분리하여 상징액을 제거한 후 0.8% NaCl로 희석하고, 10N HC1 를 이용하여 pH 2.0, 2.5 및 7.0으로 각각 조절된 0.05M sodium phosphate 완충용액에 10 cfu/m/ 수준이 되도록 유산 균주를 접종하고 37P에서 2시간 동안 배양한 후 생존율을 측정하였다.
- 휘발성 향미성부 선발된 L. acidophilus 8% 탈지유에 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액내 휘발성 향미 성분을 Bassette과 Ward11)의 방법에 따라 분석하였다. 배양액 50 g을 Kemmerer-hallet type micro-kjeldahl distillation unit 의증류 플라스크에 넣고 내부표준용액으로 ethyl acetate 5 ppm을 첨가한 후, 증류시켜 증류액 5 ml를 수집하고 이 중 2 ml를 20 m/의 space vial에 취한 후 여기에 Na2SO4 anhydrous 05 함을 첨가한 후 Teflon 마개로 막고 60℃ 수조에서 2분간 정치시킨 후, 5분간 교반하고 다시 8분간 정치시킨 후 headspace 1 m® 취하여 GC로 분석하였으며 FID detector와 Supelcowax-10 fused silica capillary column(Supelco Inc.
성능/효과
- L acidophilus 소화관 내의 낮은 pH, 담즙산 및 lysozyme에 대한 저항성이 있고 장관 상피세포에 흡착할 수 있는 성질 등이 있어서 소화기관 내에서 생존력과 정착성이 우수하며 특히 회장 말단 부위에서의 생장력이 높은 것으로 보고되었으며 건강증진 효과가 우수한 것으로 알려졌다.2) 최근 발효유 제조에 사용되는 starter culture와 더불어 L. acidoph血s와 같은 probiotic 유산균이 함유된 상업적 발효유의 생산이 급증하고 있다. 이로 인해 probiotic 유산균이 첨가되어 형성되는 발효유의 풍미 및 조직감과 같은 관능적 특성에 미치는 영향에 대해서도 많은 관심을 가지게 되었으며4)또한 probiotic 유산균의 인체유용효과와 생리활성 물질 생성에 관한 연구도 매우 다양해지고 있다.
- 실험 결과 모든 시험 균주들이 실험에 사용한 복합담즙산의 종류에 따라 유산균의 분해반응 정도의 차이는 있으나 복합담즙산염들을 분해하는 것으로 나타났다.2D 전반적으로 gly&ne과 결합된 복합담즙산염보다는 taurine과 결합된 복합담즙산염이 첨가된 MRS 한천 평판배지에서 잘 생장하였고, glycine과 결합된 복합담즙산염의 농도가 증가할수록 생장이 억제되었으며, 0.5%를 첨가할 때 생장이 크게 억제되었다. 따라서 glycine보다는 taurine과 결합한 복합담즙산염에 대해 저항성 및 분해 활성이 높은 것으로 나타났으며, 시험 균주들 중 특히 L.
- 유산균은 자신이 생산하는 여러 종류의 protease와 peptidase에 의해 단백질을 펩타이드와 아미노산으로 분해하여 스스로의 생육에 사용하며, 우유 단백질은 유산균에 의한 단백질의 분해과정 중 일정한 아미노산 배열의 생리활성을 가진 펩타이드를 생성하게 된다.4) Angiotensin Ie 혈압상승에 중요한 역할을 하는 angiotensin Ⅱ의 전구체 역할을 하며 ACE 작용에 의해 angiotensin II로 전환된다. 따라서 ACE inhibition activity를 측정하므로서 혈압강하작용을 하는 유단백질 유래 펩타이드 생성정도를 측정할 수 있다.
- acidophilus SD 103에 의해 생성된 펩타이드는 약 70% 이상의 철분을 가용성 상태로 존재하게 하였다. Ferrozin 방법에 의해 시험 균주들 증 pH 6.0에서의 철분가용화능이 우수한 것으로 나타난 L. acidophilus SD 102, SD 103 및 SD 104에 있어 추출물이 첨가된 시료내 가용성 철분의 농도를 ICP spectrophotometer를 이용하여 측정하였으며, 결과는 Table 11에 제시된 바와 같이 L. acidophilus SD 103에 의해 생성된 펩타이드를 첨가하였을 때 가용성 철분의 농도가 가장 높은 것으로 확인되었다. 유단백질내 케이신의 phosphoseryl 잔기에 철분이 강력하게 결합하여 십이지장내 알카리 조건에서 용해성을 유지하게 함에 따라 철분의 흡수를 용이하게 해주며26)또한 칼슘의 체내 흡수율을 증가시키는 casein phospho peptide(CPP)는 칼슘이나 철분과 같은 2가 또는 3가 양이온들과 가용성 복합체를 형성할 수 있으므로 유산균에 의해 분해된 우유 유래 펩타이드의 이용 가능성이 매우 높다고 하였다.
- 대부분 시험 균주의 균체 지방산 조성 중에서 oleic acid(G&i)의 함량이 40% 이상으로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 11, 12-methylene hexadecanoic acid(C]9:o cyc) 비율이 높게 나타났다. SMIS library 와의 유사성 (similarity)을 확인한 결과 5종의 L. acidophilus 중 1종은 L. acidophiluse 80% 이상의 유사성을 나타내었으며, 나머지 2종은 L acidophiluse 유사성은 50% 대로 낮았으나 다른 LactobaciHus로서의 유사성은 결과에 나타나지 않아 L. acidophilus로서 인정하였다. Rizzo 등의 보고에 의하면 Lactobacillie 균체 지방산 조성을 분석한 결과 %.
- 시험 균주들에 의해 생성된 펩타이드에 의해 약 8~18 %의 ACE활성이 억제되었고, 그 중 £. acidophilus SD 102는 배지에 생성된 펩타이드의 ACE 억제력이 18% 로 시험 균주 중 가장 높은 것으로 나타났으며, L. acidophilus SD 105의 경우 약 8%^ ACE 활성 억제 효과가 나타났다. 유산균은 자신이 생산하는 여러 종류의 protease와 peptidase에 의해 단백질을 펩타이드와 아미노산으로 분해하여 스스로의 생육에 사용하며, 우유 단백질은 유산균에 의한 단백질의 분해과정 중 일정한 아미노산 배열의 생리활성을 가진 펩타이드를 생성하게 된다.
- 철분 가용성 중가. pH에 따른 철분의 용해성 변화를 실험한 결과는 Fig. 3에 나타난 바와 같이 위(胃)의 조건과 유사한 pH 2.0 부근에서는 대부분의 철분이 가용성 상태로 존재하나, pH 가 높아지면서 철분의 가용성이 급격히 감소하여 pH 4.0에서는 10%의 가용성을 나타냈으며, 철분이 흡수되는 십이지장의 pH인 6.0에서는 약 8% 정도의 철분이 가용성 상태로 존재하는 것으로 확인되었다. 철분의 체내흡수는 소장 상부의 십이지장에서 일어나는 것으로 알려져 있으며 체내 철분 저장 상태에 따라 다르지만 성인의 경우 섭취한 철분의 약 5~10%만이 흡수된다고 알려져 있다.
- ivanovii KCTC 3444에 대한 억제능이 제일 높았으며 결과는 Table 8과 같다. 각 균주의억제환의 크기는 크게 차이가 없었으나 SD 105가 제일 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. L.
- 0에서는 약 40~50%의 생존율을 보였다. 그 중 L. acidophilus SD 102는 내산성이 높아 pH 2.0에서도 71%의 높은 생존율을 보였다. Hood와 Zottola 등은 Lactobacillus 중 L.
- acidophs를 SMIS를 이용하여 지방산 조성을 분석하여 확인하였으며 결과는 Table 3에 나타난 바와 같다. 대부분 시험 균주의 균체 지방산 조성 중에서 oleic acid(G&i)의 함량이 40% 이상으로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 11, 12-methylene hexadecanoic acid(C]9:o cyc) 비율이 높게 나타났다. SMIS library 와의 유사성 (similarity)을 확인한 결과 5종의 L.
- acidophiluse: bile extract가 1% 첨가된 배지에서 배양하며 담즙산에 대한 내성을 측정한 결과는 Table 5와 같다. 대부분의 균주가 생존율이 80% 이상으로 매우 우수하였고, 선발 균주들 중 L. acidophilus SD 103의 생존율이 90.4%로 가장 높게 나타났다. Klaenhammer와 Kleeman1^ Lactobacillus 와 같은 유산 간균은 세포 형태에 따라 담즙에 대한 내성에 차이가 있으며, 표면이 매끈한 형태보다는 거친 형태의 표면을 가진 L.
- 5%를 첨가할 때 생장이 크게 억제되었다. 따라서 glycine보다는 taurine과 결합한 복합담즙산염에 대해 저항성 및 분해 활성이 높은 것으로 나타났으며, 시험 균주들 중 특히 L. acidphilus SD 105는 다른 균주에 비해 이ycine과 결합된 복합담즙산염에 대해 내성이 높아 잘 생장하였고, 0.5% GCA를 첨가했을 때 높은 분해활력을 나타냈다. 유산균에 의한 혈중 콜레스테롤의 저하는 콜레스테롤 동화, 복합담즙산 분해, 유산균 세포와 콜레스테롤의 결합 등에 의해 직간접적으로 장내의 콜레스테롤 대사에 영향을 줌으로써 이루어진다고 보고되고 있으며, 그 중 복합담즙산 분해가 유산균에 의한 혈중 콜레스테롤의 저하에 있어 주요 기작으로 확인되고 있다.
- 따라서 이 연구에서는 위의 산성도와 담즙산에 대한 내성이 뛰어나고 건강증진 효과가 우수한 것으로 알려진 L acidophilus 를 외부환경 유래 유산균으로 구성된 성인보다 장정착성이 우수한 신생아의 분변에서 분리 및 선발하였다. 선발균주에 의한 장내 유해미생물 억제, 혈중 cholesterol 저하, 과산화수소에 대한 저항성 등과 더불어 발효과정 중 생성되는 유기산, 풍미 성분 및 유단백질 유래 펩타이드 등에 관한 기초 지식을 확보하여 우수한 starter culture 종균으로 개발하고자 실시하였다.
- 0에서 철분의 가용화가 전반적으로 증가하는 것으로 나타났다. 모든 시험 균주들에 의해 생성된 펩타이드 첨가에 따라 50% 이상의 철분이 가용성 상태로 존재하였으며, L. acidophilus SD 102, SD 103 및 SD 104에 의해 생성된 펩타이드는 약 60%의 철분 가용화 효과를 나타내었고, 특히 L. acidophilus SD 103에 의해 생성된 펩타이드는 약 70% 이상의 철분을 가용성 상태로 존재하게 하였다. Ferrozin 방법에 의해 시험 균주들 증 pH 6.
- acidophilus SD 103은 가장 높은 감소율을 나타내었다. 반면 L acidophilus SD 105 는 배양 1시간대에서는 80%의 생존율을 보였으며, 배양 2시간 후에도 생존율이 60% 이상으로 나타나 0.4 mM hydrogen peroxide에 대한 저항성이 높은 것으로 확인되었다. Klebanoff 등23은 이러한 Lactobacillie] hydrogen peroxide에 대한 저항성은 이들 유산균이 hydrogen peroxide와 peroxidase를 함께 생산하며, 생산된 peroxidase가 hydrogen peroxide를 hypochlorous acid로 전환시켜 유해 미생물 억제기능을 가지며 동시에 과도한 hydrogen peroxide의 농도를 조절한다고 하였다.
- 4 mM hydrogen peroxide를 첨가하여 2시간 동안 배양하며 생균수를 측정한 결과는 Table 10에 나타난 바와 같다. 배양 1시간 전까지는 대부분의 실험 균주들이 약 70% 이상의 생존율을 나타냈으며 배양시간이 증가함에 따라 생존율이 전반적으로 낮아졌으며, 배양 2시간 후에는 0.4mM hydrogen peroxide에 의해 대부분의 실험 균주들의 생존율이 급격히 감소하였고, 시험 균주 중 L. acidophilus SD 103은 가장 높은 감소율을 나타내었다. 반면 L acidophilus SD 105 는 배양 1시간대에서는 80%의 생존율을 보였으며, 배양 2시간 후에도 생존율이 60% 이상으로 나타나 0.
- 유해 미생물 생육억제. 선발된 L. acidophilue 의한 유해 미생물 생장 억제를 well diffusion assay 방법을 이용하여 실험한 결과 E. coli, S. typhimurium에 대한 생육억제효과는 없었으며, B. cereuse\- S. mutants에 대해서는 약한 생육억제효과를 나타냈다. 그러나 대부분의 실험 균주들에 있어 특이적으로 Listeria 균주들에 대한 억제 효과가 매우 높게 나타났으며 L.
- acidophiluA 8% 탈지유에 배양하여 생성되는 유기산을 측정하였으며 결과는 Table 6에 나타난 바와 같다. 시험 균주 중 L acidophilus SD 105에 의해 제조된 발효액 내 유기산 함량이 전체적으로 높게 나타났다. Lactic acid의 경우 전 처리구에서 다른 유기산에 비해 높게 생성되어 전형적인 homo형 유산발효가 이루어졌다.
- acidophihus의 복합담즙산염 분해를 실험한 결과는 Table 9과 같다. 실험 결과 모든 시험 균주들이 실험에 사용한 복합담즙산의 종류에 따라 유산균의 분해반응 정도의 차이는 있으나 복합담즙산염들을 분해하는 것으로 나타났다.2D 전반적으로 gly&ne과 결합된 복합담즙산염보다는 taurine과 결합된 복합담즙산염이 첨가된 MRS 한천 평판배지에서 잘 생장하였고, glycine과 결합된 복합담즙산염의 농도가 증가할수록 생장이 억제되었으며, 0.
- 4에 제시된 바와 같다. 펩타이드 첨가에 의해 pH 6.0에서 철분의 가용화가 전반적으로 증가하는 것으로 나타났다. 모든 시험 균주들에 의해 생성된 펩타이드 첨가에 따라 50% 이상의 철분이 가용성 상태로 존재하였으며, L.
- 1에 나타난 바와 같다. 혼합 배양 1시간 이후부터 시험 균주들에 의한 1.monocytogenes 및 L. ivanovii 대한 생육 억제 효과가 뚜렷하게 나타났으며, 배양 3시간대 이후부터 대부분 사멸하는 것으로 나타나 시험 균주들의 특이적인 Listeriae 대한 생육억제 효과가 확인되었다.
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