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문제 정의
- 과산화지질은 oxygen radical이 세포막의 불포화지방산에 작용하여 생성되고, 세포막의 손상이나 세포괴사 등의 독성을 일으키며, 성인병, 암, 염증 및 노화 등 여러 질병들의 원인이 될 수 있다(21). 따라서 본 실험은 머위 엽병의 분획물이 지질의 과산화를 억제시켜 과산화물을 감소시키는 정도를 측정함으로써 항산화 활성을 검증하였다(Table 1). DPPH 라디칼 소거능 실험에서와 마찬가지로 최종농도 100μg/mL에서 ethyl acetate 분획물(37.
- 따라서 본 연구는 예로부터 약용 및 식용으로 사용되는 머위 중 잎에 비하여 효용가치가 다소 부족한 엽병의 항산화 활성을 탐색할 뿐만 아니라 activity-guided fractionation에 의해 활성 성분을 분리하고, 1H- 및 13C-NMR 분석을 통해 화학적 구조를 동정하고자 한다. 또한 머위 엽병 용매 분획물 및 순수 분리한 화합물의 항산화 효과를 검토함으로써, 미활용 식물자원인 머위 엽병의 기능성식품 소재 개발의 기초자료뿐만 아니라 실질적인 천연 항산화제로서의 이용가능성을 제시하고자 한다.
- C-NMR 분석을 통해 화학적 구조를 동정하고자 한다. 또한 머위 엽병 용매 분획물 및 순수 분리한 화합물의 항산화 효과를 검토함으로써, 미활용 식물자원인 머위 엽병의 기능성식품 소재 개발의 기초자료뿐만 아니라 실질적인 천연 항산화제로서의 이용가능성을 제시하고자 한다.
- Lipoxygenase 저해능 측정: DPPH free radical 소거능과 TBA에 의한 지질과산화 억제능을 살펴봄으로써 in vitro에서 머위 엽병 분획물의 항산화력을 측정하였다. 본 실험에서는 in vivo에서의 머위 엽병의 항산화 가능성을 제시하기 위해 머위 엽병 용매 분획물의 in vitro lipoxygenase 저해 효과를 측정하였다. Lipoxygenase는 체내에서 linoleic acid의 산화를 촉진시켜 leukotrien류 등의 유해산물을 다량 생성하여 천식, 관절염, 심근경색 등의 만성질환의 주요 원인이 된다(23).
- 본 연구에서는 머위 엽병의 에탄올 추출물을 용매 극성에 따라 hexane, chloroform, ethyl acetate 및 n-butanol로 분배한 분획물에 대해 전자공여능, 지질과산화 억제능 및 lipoxygenase 저해효과 효과를 살펴봄으로써 항산화능을 측정하였다. 분획물 중 ethyl acetate 분획물의 경우 100 μg/mL 농도에서 전자공여능, 지질과산화 억제능 및 lipoxygenase 저해능에서 각각 65.
제안 방법
- 1H-NMR spectrum에서 δ 6.19와 δ 6.43에서 관측되는 두 개의 doublet signal은 J값이 2 Hz로 두 수소가 meta coupling 상태임을 나타내어 각각 5,7-dioxygenated flavonoid A ring의 H-8과 H-6으로 추정하였다.
- 3(Fig. 2)에 대하여 추가적으로 silica gel chromatography(1.5×38 cm)를 수행하였다.
- O로 순차 분배하고 감압 농축하여 5개의 용매 분획물을 얻었다. 3가지 다른 항산화 실험 결과에서 가장 우수한 효과를 나타낸 ethyl acetate 분획물에 대하여 활성 성분을 분리하기 위하여 silica gel open column chromatography에 의해 7개의 소분획으로 나누었다. 이 중, DPPH법에 의해 가장 우수한 free radical 소거 효과를 나타낸 sub-fraction 3(Fig.
- Ethyl acetate 가용성 분획물(2.5 g)을 silica gel column(2.4×40 cm) chromatography하여 CHCl3-MeOH 혼합용매 40:1/20:1/15:1/10:1/5:1/MeOH 순으로 극성을 증가시키면서 용출하여 TLC 패턴에 따라 7개의 sub-fractions로 나누었다.
- Lipoxygenase 저해능 측정: DPPH free radical 소거능과 TBA에 의한 지질과산화 억제능을 살펴봄으로써 in vitro에서 머위 엽병 분획물의 항산화력을 측정하였다. 본 실험에서는 in vivo에서의 머위 엽병의 항산화 가능성을 제시하기 위해 머위 엽병 용매 분획물의 in vitro lipoxygenase 저해 효과를 측정하였다.
- 4×40 cm) chromatography하여 CHCl3-MeOH 혼합용매 40:1/20:1/15:1/10:1/5:1/MeOH 순으로 극성을 증가시키면서 용출하여 TLC 패턴에 따라 7개의 sub-fractions로 나누었다. TLC 패턴 확인을 위해 10% 황산을 사용하여 발색하였다. 이 중 소분획물의 DPPH 항산화 실험에서 가장 높은 활성을 보인 Fr.
- Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 측정: 0.1 M phosphate buffer(pH 7.0)와 ethanol을 4:1로 혼합한 용매에 linoleic acid를 첨가하여 최종농도가 0.03 M이 되도록 기질용액을 제조하였다. 기질용액 2.
- 머위 생체 50 kg을 건조하여 잎과 엽병을 구분하였다. 수세 후 음건한 머위 엽병 분말 1.
- 머위 엽병 ethanol 추출물을 용매의 극성 차이에 따라 hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 및 H2O로 순차 분배하고 감압 농축하여 5개의 용매 분획물을 얻었다. 3가지 다른 항산화 실험 결과에서 가장 우수한 효과를 나타낸 ethyl acetate 분획물에 대하여 활성 성분을 분리하기 위하여 silica gel open column chromatography에 의해 7개의 소분획으로 나누었다.
- 에탄올 추출물(280 g)은 증류수로 현탁한 후, hexane(500 mL×3), chloroform(500 mL×3), ethyl acetate(500 mL×3) 및 n-butanol(500 mL×3)로 순차적으로 분배 추출하였다.
- 반응액을 실온에서 냉각시켜 acetic acid 1 mL와 chloroform 2 mL를 가하여 vortex mixing 한 후, 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 하여 얻은 상징액의 흡광도를 532 nm에서 측정하여 TBA값을 산출하였다(16). 양성 대조군으로는 BHT를 사용하였으며, 계산식은 다음과 같다.
- 3가지 다른 항산화 실험 결과에서 가장 우수한 효과를 나타낸 ethyl acetate 분획물에 대하여 활성 성분을 분리하기 위하여 silica gel open column chromatography에 의해 7개의 소분획으로 나누었다. 이 중, DPPH법에 의해 가장 우수한 free radical 소거 효과를 나타낸 sub-fraction 3(Fig. 2)으로부터 계속적인 silica gel open column chromatography를 수행하여 화합물 PJ-4를 분리, 정제하였으며, 1H- 및 13C-NMR data는 다음과 같다. 1H-NMR(300MHz, δ, DMSO-d6): 6.
- 5×38 cm)를 수행하였다. 이동상은 CH2Cl2-MeOH 혼합용매 40:1/30:1/20:1/15:1/10:1을 이용하였으며 최종적으로 PJ-4(20.0 mg)를 분리, 정제하였다.
- Lipoxygenase는 체내에서 linoleic acid의 산화를 촉진시켜 leukotrien류 등의 유해산물을 다량 생성하여 천식, 관절염, 심근경색 등의 만성질환의 주요 원인이 된다(23). 이러한 유해 생성물을 줄이는 방법으로서 lipoxygenase 활성저해물질의 섭취가 중요하며, 머위 엽병에서 이의 가능성을 모색하고자 인체 내 효소와 가장 유사한 형태인 soybean lipoxygenase(Type V)를 이용하여 실험을 실시하였다. 그 결과, DPPH free radical 소거능과 TBA에 의한 지질과산화 억제능이 가장 높았던 ethyl acetate 분획물(50.
- 67%로 가장 우수한 항산화능을 나타내었다. 이를 근거로 하여 ethyl acetate 분획물로부터 머위 엽병의 항산화 활성 성분을 규명하기 위하여 open column chromatography를 이용하여 화합물 PJ-4를 분리, 정제하였으며, 1H- 및 13C-NMR 분석을 통해 kaempferol로 동정하였다. 단리된 kaempferol의 항산화 활성을 확인하기 위하여 앞에서 언급한 세 가지 항산화 측정법을 통해 실험한 결과, 농도 의존적으로 활성이 증가하는 양상을 보였다.
- 9 kg을 95% 에탄올(10 L)에 5일간 실온에서 냉침한 후 추출하였다. 추출물은 여과하고 동일한 방법으로 총 3회 반복 추출하였으며, 얻어진 여액은 감압 농축하였다. 에탄올 추출물(280 g)은 증류수로 현탁한 후, hexane(500 mL×3), chloroform(500 mL×3), ethyl acetate(500 mL×3) 및 n-butanol(500 mL×3)로 순차적으로 분배 추출하였다.
- Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 흡광도는 UV/Vis spectrophotometer(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 사용하여 측정하였고, 1H-NMR 및 13C-NMR은 Bruker Avance 300 spectrometer(Karsruche, Germany)를 이용하여 각각 300 MHz, 75 MHz에서 측정하였으며 chemical shift는 내부 표준물질로서 tetramethylsilane(TMS)를 사용하여 ppm으로 나타내었다.
대상 데이터
- 추출, 분획 및 column chromatography용 용매는 모두 특급을 사용하였다. 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)은 Aldrich사(Milwaukee, WI, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며 ascorbic acid, tert-butylated hydroxytoluene(BHT), nordihydroguaiaretic acid(NDGA), thiobarbituric acid(TBA), trichloroacetic acid(TCA), linoleic acid, lipoxygenase(Type V)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 흡광도는 UV/Vis spectrophotometer(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 사용하여 측정하였고, 1H-NMR 및 13C-NMR은 Bruker Avance 300 spectrometer(Karsruche, Germany)를 이용하여 각각 300 MHz, 75 MHz에서 측정하였으며 chemical shift는 내부 표준물질로서 tetramethylsilane(TMS)를 사용하여 ppm으로 나타내었다.
- 본 실험에 사용한 머위 줄기는 2006년 5월에 경상남도 밀양 얼음골 농가에서 구매하여 수세하고 음건한 다음 사용하였으며, 표본시료는(voucher No. NPC-PJ-06001) 경북대학교 전통기술첨단화 연구실에 보관되어 있다.
- 반응액에 기질인 linoeic acid(최종농도 110 μM) 50 μL를 첨가한 후, 5분간 반응시키고 234 nm에서 흡광도를 측정하였다(17). 양성 대조군으로 페놀계 식품 항산화제인 NDGA를 사용하였고 계산식은 다음과 같다.
- 원심분리 하여 얻은 상징액의 흡광도를 532 nm에서 측정하여 TBA값을 산출하였다(16). 양성 대조군으로는 BHT를 사용하였으며, 계산식은 다음과 같다.
데이터처리
- 각 실험은 독립적으로 3회 반복 실시하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 실험군 간의 유의성을 검정하기 위해서 SAS(Statistical Analysis System)를 사용하여 ANOVA test를 수행하였으며 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 전자공여능 측정: 머위 엽병의 분획물 및 화합물의 전자공여능 측정은 Blois(15)의 방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다. 일정농도의 시료 2 mL에 2×10-4 M DPPH용액 1 mL를 가한 후, vortex mixing하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 100 μg/mL 농도에서 ethyl acetate 분획물(65.41%)이 가장 높은 활성을 나타내었고, 다음으로 chloroform 분획물(40.26%), n-butanol 분획물(11.49%), hexane 분획물(6.68%), H2O 분획물(2.83%) 순으로 나타났다.
- 100 μg/mL의 농도에서 DPPH 라디칼 소거능 65.76%, TBARS에 의한 지질과산화 저해능 43.47%, lipoxygenase 저해도 58.60%의 활성을 나타내었다.
- DPPH 라디칼 소거능 실험에서와 마찬가지로 최종농도 100μg/mL에서 ethyl acetate 분획물(37.04%)이 가장 높은 지질과산화 억제효과를 보였고, H2O 분획물이 가장 낮은 활성을 나타내었다.
- DPPH 라디칼 소거능, TBARS 측정을 통한 지질과산화 억제효과 및 lipoxygenase 저해능 평가를 통해 각 분획물의항산화 활성을 확인한 결과, ethyl acetate 분획이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었다. Ethyl acetate 가용성 분획물(2.
- 01). TBARS를 통한 지질과산화 억제효과의 경우, 각 용매 분획물은 DPPH 라디칼 소거능에 비해 전체적으로 낮은 항산화 효과를 보였다. 이는 DPPH법이 항산화 물질이 산화를 개시하는 DPPH radical을 hydrazine 형태로 환원시킴으로써 초기의 전자공여능을 확인할 수 있는 방법(15)인 반면, TBARS를 통한 지질과산화 억제 효과는 linoleic acid 산화로 생성된 과산화지질의 분해 과정에서 생기는 peroxy radical의 소거를 통해 지질과산화의 이차분해산물인 malondialdehyde의 생성량을 측정하여 항산화능을 확인하는 방법(22)으로서, 이러한 각각의 작용기작에 있어서의 차이를 갖기 때문인 것으로 사료된다.
- 83%) 순으로 나타났다. 각 분획물의 항산화 활성은 유의적인 차이를 보였으며, 특히 ethyl acetate 분획물은 ascorbic acid(63.11%)보다 더 우수한 항산화 효과를 보였다. 머위에는 petasiphenone, eremophilenolidephenol 등의 phenol성 화합물과 kaempferol 3-O-(6"-acetyl)-β-glucopyranoside와 quercetin 3-O-(6"-acetyl)-β-glucopyranoside 등의 flavonoid가 분리된 바 있으며(7,19) 머위 엽병에서도 역시 이와 유사한 물질들이 항산화 활성에 관여한 것으로 사료된다.
- 그 결과, DPPH free radical 소거능과 TBA에 의한 지질과산화 억제능이 가장 높았던 ethyl acetate 분획물(50.67%)이 유의적으로 가장 높은 lipoxygenase 저해능을 보였다(Table 1, p<0.01).
- 단리된 kaemperol은 25, 50 및 100 μg/mL 농도로 실험을 수행하였으며 세 가지 측정법에서 모두 kaempfrol의 농도가 증가함에 따라서 inhibition(%)의 수치가 유의적으로 증가하는 양상을 보여 농도 의존적인 항산화 효과를 확인할 수 있었다.
- 이를 근거로 하여 ethyl acetate 분획물로부터 머위 엽병의 항산화 활성 성분을 규명하기 위하여 open column chromatography를 이용하여 화합물 PJ-4를 분리, 정제하였으며, 1H- 및 13C-NMR 분석을 통해 kaempferol로 동정하였다. 단리된 kaempferol의 항산화 활성을 확인하기 위하여 앞에서 언급한 세 가지 항산화 측정법을 통해 실험한 결과, 농도 의존적으로 활성이 증가하는 양상을 보였다. 특히 100 μg/mL의 농도에서 전자공여능, TBARS에 의한 지질과산화 억제 및 lipoxygenase 저해실험에서 각각 65.
- 본 연구에서 분리 동정된 kaempferol은 DPPH법, TBARS법 및 lipoxygenase법을 통한 각각의 in vitro 항산화 실험에서 탁월한 효과를 나타내었으며, 이는 머위 엽병의 항산화능에 기여하는 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 잎에 비하여 효용가치가 다소 부족한 머위 엽병의 기능성식품 소재로서의 활용방안을 마련할 수 있으며 이로부터 분리된 항산화 화합물의 천연 항산화제로서의 가능성을 나타내었다.
- 분획물 중 ethyl acetate 분획물의 경우 100 μg/mL 농도에서 전자공여능, 지질과산화 억제능 및 lipoxygenase 저해능에서 각각 65.41%, 37.04%, 50.67%로 가장 우수한 항산화능을 나타내었다.
- 본 연구에서 분리 동정된 kaempferol은 DPPH법, TBARS법 및 lipoxygenase법을 통한 각각의 in vitro 항산화 실험에서 탁월한 효과를 나타내었으며, 이는 머위 엽병의 항산화능에 기여하는 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 잎에 비하여 효용가치가 다소 부족한 머위 엽병의 기능성식품 소재로서의 활용방안을 마련할 수 있으며 이로부터 분리된 항산화 화합물의 천연 항산화제로서의 가능성을 나타내었다.
- 특히 100 μg/mL의 농도에서 전자공여능, TBARS에 의한 지질과산화 억제 및 lipoxygenase 저해실험에서 각각 65.76%, 43.47%, 58.60%로 높은 항산화 활성을 나타내었다.
- 화합물 PJ-4는 황색 분말로 FeCl3 반응에 양성을 나타내어 phenol성 화합물임을 예측할 수 있었고, 아니스알데히드-황산 시액에서 노란색을 나타내어 flavonoid계 물질로 추정되었으며, UV spectrum을 통하여 벤젠환의 존재를 확인하였다. 1H-NMR spectrum에서 δ 6.
후속연구
- 01). 양성 대조군인 NDGA의 항산화 활성에는 미치지 못했으나 분획물 수준에서 50% 이상의 lipoxygenase 저해효과를 나타낸 것으로 보아 머위 엽병 추출물이 in vivo에서도 역시 항산화 활성을 보여줄 것으로 기대되며 생체 내에서 산화적 스트레스로 인해 유발되는 손상과 질병을 예방할 수 있는 좋은 소재가 될 수 있을 것이라 사료된다.
- 60%로 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해 kaempferol은 머위 엽병의 항산화 활성에 있어서 기여하는 물질일 것으로 보이며, 이로써 머위 엽병을 이용한 천연항산화제 개발 및 활용에 긍정적인 가능성을 제시할 것으로 사료된다.
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