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문제 정의
- 머위추출물의 항산화 효과 및 항염증 효과에 대한 연구를 하였다. 머위추출물의 지질과산화 억제효과는 100 μg/mL에서 70.
- 본 연구는 머위 추출물의 라디칼 소거 효과, 지질과산화 억제 효과 및 각질형성 세포에서의 IL-lα, PGE2 억제효과를 연구하여 화장품에서 노화 및 자극 완화 소재로 이용하고자 하였다.
제안 방법
- 1% pluronic F-127 (Molecular ProbeX 빛이 들어가지 않도록 주의하여 처리한다. 37℃, 30 min 반응시킨 후 UVB 20 mJ/ cm2 (UVB G15T8E, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. 모든 시료를 처리 후 37℃ 에서 반응시켜 luminescence spectrophotometer를 사용하여 DCF (Ex= 488 nm; -Em= 525 nm)에 의한 세포내 형광값을 측정하였다[13, 14].
- DCFH의 산화로 생성된 DCF의 형광값을 측정한 실험으로 세포내에 생성된 과산화수소나 산화적 스트레스를 실험하였다. DCFH는 hydroxyl radical, nitrogen oxide radical (NO2), thiyl radical, bicarbonate radical anion 등에 의해 산화된다.
- 각질형성세포(1 × 105 cells/ml)를 UVB 10 mJ/cm2 세기로 조사한 후 serum free DMEM 배지를 500 pL 첨가하고 머위추출물 시료를 농도별로 첨가하였다. 24 h 동안 배양 후 배양상등액을 well plate에 4℃ 에서 코팅한다.
- 구입하였다. 그늘진 곳에서 건조한 머위 100g을 분쇄하여 70% 에탄올 1 L로 환류하면서 3 h씩 2회 반복 추출하였다. 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 실험에 사용하였다.
- 37℃, 30 min 반응시킨 후 UVB 20 mJ/ cm2 (UVB G15T8E, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. 모든 시료를 처리 후 37℃ 에서 반응시켜 luminescence spectrophotometer를 사용하여 DCF (Ex= 488 nm; -Em= 525 nm)에 의한 세포내 형광값을 측정하였다[13, 14].
- 세포내 free radical 확인을 위해 5-(6-)chloromethy- 2,'7'-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate (CM-H2DCFDA) 는 Molecular Probe사 (Eugene, OR, USA)에서 구입하였고, 형광스펙 트로포토미터(luminescence spectrophotometer, Perkin Elmer, UK)로 측정하였다. Anti-human interleukin-1 α, anti-rabbit IgG conjugated with horse radish peroxidase(HRP)는 Sigma Chemical Co.
- 각 well을 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 2회 세척 후 500 μL의 인산완충용액(PBS)을 첨가하였다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(model: F15T8, UVB15W, Sankyo Dennki, Japan) 를 이용하여 UVB 를 10 mJ/cm2를 조사한 후, 배양배지로 교환하여 시료처리 하였다. 24 h 후 상층액을 회수하여 상층액에 유리된 PGE2의 양을 효소면역분석법 (Cayman Chemical, MI, USA) 으로 정량하였다 [4].
대상 데이터
- HaCaT 사람 각질형성세포주는 American Type Culture Collection으로부터 구입하였고, Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM, BioWhittaker, MD, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, BioWhittaker, MD, USA), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 세포를 실험에 이용하였다.
- 본 실험에서 사용한 머위 (Petasites japonicus)는 국내 약초시장에서 구입하였다. 그늘진 곳에서 건조한 머위 100g을 분쇄하여 70% 에탄올 1 L로 환류하면서 3 h씩 2회 반복 추출하였다.
- 그늘진 곳에서 건조한 머위 100g을 분쇄하여 70% 에탄올 1 L로 환류하면서 3 h씩 2회 반복 추출하였다. 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균士표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 student's t-test로 하였으며 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 이 각질형성세포에 UVB 램프(model: F15T8, UVB15W, Sankyo Dennki, Japan) 를 이용하여 UVB 를 10 mJ/cm2를 조사한 후, 배양배지로 교환하여 시료처리 하였다. 24 h 후 상층액을 회수하여 상층액에 유리된 PGE2의 양을 효소면역분석법 (Cayman Chemical, MI, USA) 으로 정량하였다 [4].
- Linoleic acid model system을 이용하여 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 법으로 지질과산화 억제효과를 측정하였다[12]. Linoleic acid (2.
- UV나 ROS에 의해 발현되는 염증성 사이토카인인 PGE2의 양을 경쟁적 효소 면역분석법으로 정량하였다. 세포자체의 생리작용에 의한 기본적인 PGE2의 농도는 17.
- 체내의 세포, 막 또는 지단백질의 지질은 활성산소의 유리기에 의해 연쇄반응을 일으켜 산화적 손상을 받아 지질 유동성의 감소, 막 투과성의 변질 등이 일어나며, 또한 수명이 길고, 독성이 있는 malondialdehyde (MDA), 4-hydroxynonenal 같은 과산화물을 만들어 급성조직장애 및 세포노화를 유도하여 각종 성인병 및 발암의 원인이 된다. 이러한 지질의 과산화억제효과를 측정하기 위하여 2-thiobarbituiic acid (TBA) 법을 이용하여 머위 추출물의 지질과산화 억제효과를 평가하였다. 머위를 100, 1000μg/mL의 농도로 처리한 경우 각 지질과산화 억제효과는 70.
성능/효과
- 세포 내에서 ROS에 의해 형광을 띠는 물질로 전환되는 CM-H2DCFDA를 이용하여 ROS의 양을 측정한 결과 자외선에 의해 증가된 세포내 ROS의 양이 머위추출물을 처리함으로써 500 μg/mL 농도에서 45% 이상의 우수한 소거효과를 나타냈다. 또한 각질형성세포에서 UVB에 의해 생합성이 증가되는 IL-la 및 PGE2의 생합성 억제효과는 100 μg/mL에서 25.7%, 59.3%를 저해하여 우수한 효과를 나타내었다.
- 2 ng/mL에 정도로 증가하였다. 머위추출물을 농도별로 처리한 결과 자외선에 의해 높아졌던 PGE2 생성량이 농도의존적으로 다시 감소하였으며, 소거효과를 분석한 결과 100 μg/mL의 농도에서 59.3%의 우수한 PGE2 생성 억제효과를 나타내었다(Figure 4). 머위의 주성분으로는 염증억제효과를 갖는 sesquitriterpen류인 petasin과 isopetasin이 함유되어 있다고 알려져 있으며[9], 이러한 성분을 함유하여 우수한 PGE2 발현억제 효과를 갖는 것으로 사료된다.
- 하였다. 머위추출물의 지질과산화 억제효과는 100 μg/mL에서 70.1%로 지질과산화 억제효과도 우수하게 나타났다. 세포 내에서 ROS에 의해 형광을 띠는 물질로 전환되는 CM-H2DCFDA를 이용하여 ROS의 양을 측정한 결과 자외선에 의해 증가된 세포내 ROS의 양이 머위추출물을 처리함으로써 500 μg/mL 농도에서 45% 이상의 우수한 소거효과를 나타냈다.
- 1%로 지질과산화 억제효과도 우수하게 나타났다. 세포 내에서 ROS에 의해 형광을 띠는 물질로 전환되는 CM-H2DCFDA를 이용하여 ROS의 양을 측정한 결과 자외선에 의해 증가된 세포내 ROS의 양이 머위추출물을 처리함으로써 500 μg/mL 농도에서 45% 이상의 우수한 소거효과를 나타냈다. 또한 각질형성세포에서 UVB에 의해 생합성이 증가되는 IL-la 및 PGE2의 생합성 억제효과는 100 μg/mL에서 25.
- 형광스펙트로포토미터를 이용하여 세포가 well plate에 부착되어 살아있는 상태에서의 형광값을 측정한 결과, 세포가 없는 CM-H2DCFDA 용액 상태의 형광값이 약 50 AU 정도의 값으로 나타났으며 , 각질형성 세포를 배 양함으로써 세포자체 의생리작용에 의한 기본적인 형광값이 120 〜 140 AU 정도의 값으로 높아졌으며, 자외선 (UVB 20 mJ/cm2) 조사결과 420 AU 정도로 급격히 증가하였다. 이러한 조건에서 머위추출물을 농도별로 처리한 결과 자외선에 의해 높아졌던 형광값이 농도 의존적으로 다시 감소하였으며, 이 결과로 자외선 조사군과 비교하여 프리라디칼 소거효과를 분석한 결과 500 μg/mL의 농도에서 45% 이상의 효과가 나타났다(Figure 2).
- 피부 이상 반응을 유발인자에는 화학물질, 세정제, 자외선 등 여러가지가 있으며, 이에 대한 피부보호 작용을 평가하기 위해 자외선에 의해 유도된 염증관련 사이토카인인 IL-la 의 생성량을 측정한 결과 UVB에 의해 유발된 염증관련 싸이토카인인 IL-la의 생성율은 머위추출물 100 μg/mL에 의해 25.7% 정도 감소되는 것으로 나타났다 (Figure 3).
- DCFH는 apoptosis 동안 세포내 산화적 스트레스를 평가하는데 사용되어져 왔으며, H2O2나 자외선에 의해 생성된 라디칼 및 세포내 신호전달과 관련된 연구에 최근 사용되고 있다. 형광스펙트로포토미터를 이용하여 세포가 well plate에 부착되어 살아있는 상태에서의 형광값을 측정한 결과, 세포가 없는 CM-H2DCFDA 용액 상태의 형광값이 약 50 AU 정도의 값으로 나타났으며 , 각질형성 세포를 배 양함으로써 세포자체 의생리작용에 의한 기본적인 형광값이 120 〜 140 AU 정도의 값으로 높아졌으며, 자외선 (UVB 20 mJ/cm2) 조사결과 420 AU 정도로 급격히 증가하였다. 이러한 조건에서 머위추출물을 농도별로 처리한 결과 자외선에 의해 높아졌던 형광값이 농도 의존적으로 다시 감소하였으며, 이 결과로 자외선 조사군과 비교하여 프리라디칼 소거효과를 분석한 결과 500 μg/mL의 농도에서 45% 이상의 효과가 나타났다(Figure 2).
후속연구
- 머위추출물은 라디칼 소거효과, 지질과산화 억제효과, UVB에 의한 세포내 ROS 소거 및 IL-1a, PGE2 생합성저해 효과를 갖는 것으로 보아, 자외선 및 외부자극에 의해서 발생할 수 있는 피부손상을 효과적으로 보호하고 염증을 완화할 수 있는 화장품 소재로써 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 머위의 주성분으로는 염증억제효과를 갖는 sesquitriterpen류인 petasin과 isopetasin이 함유되어 있다고 알려져 있으며[9], 이러한 성분을 함유하여 우수한 PGE2 발현억제 효과를 갖는 것으로 사료된다. 향후 고기능성 제품에 적용하여 안전하고 다양한 자극 완화 효과를 가지는 천연화장품 개발에 적용할 수 있을 것이라 생각된다.
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