실크피브로인을 처리한 MC3T3-E1 조골세포 조건배양액의 파골세포 분화억제효과 Inhibitory Effect of Conditioned Medium of Silk Fibroin-Treated Osteoblasts in Osteoclast Differentiation원문보기
본 연구는 MC3T3-E1 조골전구세포에 실크피브로인 처리 시 파골세포분화 관련 국소인자 중 파골세포로의 분화를 강력히 유도하는 IL-$1{\beta}$의 발현 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건 배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제하는지를 알아보았다. 조골세포 조건배양액에서 OPG의 발현은 농도별($0.001\;mg/mL{\sim}0.1\;mg/mL$) 실크피브로인 처리 시 $86%{\sim}100%$로 양성대조군(+C)과 유의적 차이가 없었다. 그러나 IL-$1{\beta}$의 발현은 0.1 mg/mL 실크피브로인 처리 시 양성대조군(+C)의 1.8% 수준으로 그 발현을 현저히 억제 하였다. 조골세포조건배양액을 처리한 RAW264.7 세포의 파골세포로의 분화정도는 농도 의존적으로 현저히 감소 하였다. 특히, 0.1 mg/mL의 실크피브로인을 처리한 조골세포 조건배양액 처리 시 파골세포로 분화하지 않은 음성대조군(-RANKL) 수준으로 파골세포 분화를 현저히 억제한 것은 OPG의 발현 증가가 아닌 IL-$1{\beta}$의 발현 억제에 의한 것으로 사료되며, 추후 연구를 통해 관련 기전의 연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
본 연구는 MC3T3-E1 조골전구세포에 실크피브로인 처리 시 파골세포분화 관련 국소인자 중 파골세포로의 분화를 강력히 유도하는 IL-$1{\beta}$의 발현 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건 배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제하는지를 알아보았다. 조골세포 조건배양액에서 OPG의 발현은 농도별($0.001\;mg/mL{\sim}0.1\;mg/mL$) 실크피브로인 처리 시 $86%{\sim}100%$로 양성대조군(+C)과 유의적 차이가 없었다. 그러나 IL-$1{\beta}$의 발현은 0.1 mg/mL 실크피브로인 처리 시 양성대조군(+C)의 1.8% 수준으로 그 발현을 현저히 억제 하였다. 조골세포조건배양액을 처리한 RAW264.7 세포의 파골세포로의 분화정도는 농도 의존적으로 현저히 감소 하였다. 특히, 0.1 mg/mL의 실크피브로인을 처리한 조골세포 조건배양액 처리 시 파골세포로 분화하지 않은 음성대조군(-RANKL) 수준으로 파골세포 분화를 현저히 억제한 것은 OPG의 발현 증가가 아닌 IL-$1{\beta}$의 발현 억제에 의한 것으로 사료되며, 추후 연구를 통해 관련 기전의 연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
In this study, we investigated the indirect effect of silk-fibroin on osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells. The conditioned medium were collected from MC3T3-E1 osbeoblasts treated with $0.001\;mg/mL{\sim}0.1\;mg/mL$ silk fibroin for 6 days, mixed in 1:1 ratio with osteoclast med...
In this study, we investigated the indirect effect of silk-fibroin on osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells. The conditioned medium were collected from MC3T3-E1 osbeoblasts treated with $0.001\;mg/mL{\sim}0.1\;mg/mL$ silk fibroin for 6 days, mixed in 1:1 ratio with osteoclast medium, and then added into RAW264.7 cells with receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL), a differentiation inducer for 3 days. Of osteoclastic cytokines in the conditioned medium, the protein expression of osteoprotegerin (OPG) with silk-fibroin was not significantly different. However, the protein expression of interleukin (IL)-$1{\beta}$ was specifically lower in a dose dependent manner. In RAW264.7 cells, the conditioned medium with silk-fibroin inhibited RANKL induced osteoclastic differentiation as total number of multinucleated tartrate-resistant alkaline phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts in a dose dependent manner. Taken together, we demonstrated that the conditioned medium of silk-fibroin treated osteoblasts inhibits RANKL induced differentiation of osteoclasts with inhibiting selective expression of IL-$1{\beta}$.
In this study, we investigated the indirect effect of silk-fibroin on osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells. The conditioned medium were collected from MC3T3-E1 osbeoblasts treated with $0.001\;mg/mL{\sim}0.1\;mg/mL$ silk fibroin for 6 days, mixed in 1:1 ratio with osteoclast medium, and then added into RAW264.7 cells with receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL), a differentiation inducer for 3 days. Of osteoclastic cytokines in the conditioned medium, the protein expression of osteoprotegerin (OPG) with silk-fibroin was not significantly different. However, the protein expression of interleukin (IL)-$1{\beta}$ was specifically lower in a dose dependent manner. In RAW264.7 cells, the conditioned medium with silk-fibroin inhibited RANKL induced osteoclastic differentiation as total number of multinucleated tartrate-resistant alkaline phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts in a dose dependent manner. Taken together, we demonstrated that the conditioned medium of silk-fibroin treated osteoblasts inhibits RANKL induced differentiation of osteoclasts with inhibiting selective expression of IL-$1{\beta}$.
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문제 정의
본 연구는 MC3T3-E1 조골전구세포에 실크피브로인 처리 시 파골세포분화 관련 국소인자 중 파골세포로의 분화를 강력히 유도하는 IL-1β의 발현 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제하는지를 알아보았다.
이에 본 연구에서는 실크피브로인을 처리한 MC3T3-E1 조골세포 조건배양액에서 파골세포분화관련 국소인자 중 IL-1β 및 OPG의 발현 변화를 살펴보고, 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제하는지를 알아보고자 하였다.
가설 설정
The region of each gel shown was 48 kDa (OPG) prestained molecular markers. B: The signal intensities from multiple experiments of A were quantified and the integrated areas were normalized to the signal observed in positive control cells (100%). Values are mean±SD.
제안 방법
01% Tween-20을 함유한 PBST로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1:10000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 이차항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 3차례 세척하고 발색은 ECL heperfilm으로 확인하였고(27) imaging densitometer(model GS-700, BIO-RAD, USA)를 사용하여 정량하였다.
MC3T3-E1 세포의 조골세포로의 분화는 이들 세포가 단층을 형성한 후 50 μg/mL 비타민 C(ascorbic acid) 와 10 mM β-glycerophosphate처리에 의해 유도하였으며(24), RAW264.7 세포의 파골세포로의 분화는 30 ng/mL recombinant murine RANKL 처리에 의해 유도하였다(25).
MC3T3-E1 조골전구세포와 RAW264.7 파골전구세포는 polystyrene 세포배양접시에 부착시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% antibacterial-antifungal solution(Gibco, USA)과 10% FBS(Gibco, USA)를 첨가한 α-MEM(Gibco, USA) 및 DMEM(ATCC, USA)을 각각 사용하여 5% CO2와 95% 습도가 유지되는 37℃ incubator에서 기본배양하였다(23).
RAW264.7 파골전구세포에 기존의 분화유도인자(28)인 RANKL 및 실크피브로인을 처리한 조골세포 조건배양액(conditioned medium: CM)이 파골세포 분화에 미치는 효과를 TRAP염색을 통해 확인하여 Fig. 1에 나타내었다. TRAP 효소의 활성은 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가되는 것으로 보고(29)되었는데, 파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로서 RANKL에 의한 분화초기에는 단핵의 전구세포를 형성하지만 세포가 유합되어 다핵의 성숙 파골세포로 분화되면 골 표면에 부착하여 주름 막을 형성하여 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되는 특징을 가진다(30).
정량된 단백질을 10% polyacrylamide/SDS gel에서 전기영동 시킨 후 Hybond ECL nitrocellulose membrane에 흡착시켰다. 각각의 1차 항체는 5% skim milk, 0.1% Tween 20을 함유한 PBST에 희석시켜서 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 0.01% Tween-20을 함유한 PBST로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1:10000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 이차항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.
45 μm, Sartorius, Germany)을 하여 잔유물을 제거한 후 평균분자량(Mw)이 1500 내외인 실크피브로인을 얻었다. 분자량은 gel permeation chromatography(GPC) 장치(Viskotec, USA)를 이용하였으며, 0.2 N NaOH를 완충용액으로 사용하여 refractive index(RI)로 환산하였다. 이러한 과정을 거쳐 얻어진 피브로인은 -5℃ 내외를 유지하는 감압건조장치(삼원냉열사, model: Vacuum Freeze Dryer)를 이용하여 수용성 분말의 형태로 얻었다(22).
이 용액을 Sephadex G-25 gel filtration chromatography(Pharmacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 피브로인과 염을 완전히 분리하였으며, 분리된 피브로인용액에 3%(v/v)의 단백질분해효소(Nove, Denmark)를 첨가하여 질소가스 충진 조건 및 55℃에서 24시간 가수분해하고, 100℃에서 5분간 효소의 불활성 처리를 한 후, 필터링(0.45 μm, Sartorius, Germany)을 하여 잔유물을 제거한 후 평균분자량(Mw)이 1500 내외인 실크피브로인을 얻었다.
이후, 배지를 제거하여 citrate-acetone 및 formaldehyde 혼합 용액으로 고정한 세포에 기질용액(1.36 mg/mL 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate 완충용액(PH 4.6))을 100 μL/well 분주하여 37℃에서 30분 반응시킨 후 현미경으로 분화된 파골세포를 관찰하였다.
대상 데이터
그리고 1차 항체(anti-rabbit IL-1β, anti-goat OPG)는 Abcam(MA, USA)에서 구입하였다. 그 외 다른 시약은 (주)KDR에서 구입하여 별다른 정제과정 없이 그대로 사용하였다.
누에고치는 가잠(Bombyx mori)을 상엽으로 사육하여 얻은 누에고치를 정련하여 준비하였다. 실크피브로인은 정련과정에 의해 추출되었는데, 먼저 누에고치에 30배량의 물을 첨가하고 110℃에서 5시간 가열한 후 필터링(Whatman No.
본 연구에 사용한 RAW264.7 세포와 MC3T3-E1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 분양받아 본 연구실에서 계대 배양하여 사용하였다. α-Minimal essential medium(α-MEM), penicillin-streptomycin(5000 U/mL penicillin; 5000 μg/mL streptomycin) 및 fetal bovine serum(FBS)는 Gibco®사(CA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
결과는 각 군별 평균과 표준오차로 나타내었고 각 실험군간의 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 general linear model(GLM) test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.
실험 결과의 자료는 SPSS(Ver 12.0 program Statistical package for social science)을 이용하여 통계처리 하였다. 결과는 각 군별 평균과 표준오차로 나타내었고 각 실험군간의 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 general linear model(GLM) test로 p<0.
이론/모형
2 paper)을 하여 잔유물을 제거하였다. 이후 Madyarov 등(22)의 방법에 따라 제조하였다. 이 용액을 Sephadex G-25 gel filtration chromatography(Pharmacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 피브로인과 염을 완전히 분리하였으며, 분리된 피브로인용액에 3%(v/v)의 단백질분해효소(Nove, Denmark)를 첨가하여 질소가스 충진 조건 및 55℃에서 24시간 가수분해하고, 100℃에서 5분간 효소의 불활성 처리를 한 후, 필터링(0.
조골세포에서 합성된 후 분비되어 파골세포에 영향을 미치는 국소인자(IL-1β, OPG)의 단백질수준의 발현을 조골세포 조건배양액에서 western blotting에 의해 확인하였다.
파골세포의 분화정도를 Hotokezaka 등(26)의 방법에 따라 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 염색으로 확인하였다. RAW264.
성능/효과
이는 여러 사전연구(31,32)와 일치하는 결과로서 RANKL은 파골세포 분화에 필수물질임을 확인하였다. RANKL처리에 의한 파골세포 분화와 함께 농도별(0.001 mg/mL～0.1 mg/mL) 실크피브로인을 처리한 조골세포 조건배양액(CM) 처리 시 파골세포 분화는 농도 의존적으로 현저히 억제되었다. 즉, 0.
1E). 그러나, 0.01 mg/mL 실크피브로인을 처리한 CM처리 시 양성대조군(+RANKL)에 비해서 TRAP 염색된 파골세포수가 감소하였으나, 주름막을 형성하고 다수의 TRAP 염색된 세포가 관찰되어 파골세포분화 억제 효과가 실크피브로인 0.1 mg/mL 처리에 비해서는 미비하였다(Fig. 1D). 이는 세포독성을 나타내지 않는 농도 내에서 특히, 실크피브로인 0.
TRAP 효소의 활성은 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가되는 것으로 보고(29)되었는데, 파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로서 RANKL에 의한 분화초기에는 단핵의 전구세포를 형성하지만 세포가 유합되어 다핵의 성숙 파골세포로 분화되면 골 표면에 부착하여 주름 막을 형성하여 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되는 특징을 가진다(30). 본 연구에서 30 ng/mL 농도의 RANKL 처리에 의해 파골세포로 분화된 RAW264.7세포(양성대조군: +RANKL, Fig. 1A)에서는 파골세포의 특징인 다핵이 관찰되었으며, 주름막을 형성하여 파골세포의 화학적 표지효소(marker enzyme)인 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되었다. 그러나 RANKL처리를 하지 않은 일반 RAW264.
조골세포로 분화되지 않은 MC3T3-E1세포(음성대조군, -C)의 IL-1β 발현은 조골세포로 분화된 MC3T3-E1세포(+C)에 비해 유의적으로 낮았다.
조골세포로 분화하지 않은 음성대조군(negative control: -C)의 OPG 발현은 vitamin C와 β-glycerophosphate 처리에 의해 조골세포로 분화 유도된 양성대조군(+C)의 9.8% 수준으로 현저히 낮았다.
8% 수준으로 현저히 낮았다. 조골세포로의 분화 유도와 함께 실크피브로인 0.001 mg/mL, 0.01 mg/mL 및 0.1 mg/mL 처리 시 OPG 발현은 각각 86%, 76%, 100%로 +C와 유의적 차이가 없었다. OPG는 조골세포에서 생성, 분비되는 RANKL의 수용성 유도인자로서, RANKL과 RANK의 결합을 저해하여 조골세포에서 파골세포로의 분화를 억제하는 주요 인자로 알려져 있다(10).
조골세포로 분화되지 않은 MC3T3-E1세포(음성대조군, -C)의 IL-1β 발현은 조골세포로 분화된 MC3T3-E1세포(+C)에 비해 유의적으로 낮았다. 조골세포의 분화 유도와 함께 실크피브로인 0.001 mg/mL 및 0.01 mg/mL 처리 시 그 발현은 각각 191%, 127% 증가한 반면, 0.1 mg/mL 처리 시 양성대조군(+C)의 1.8% 수준으로 그 발현을 현저히 억제하였다. 실크피브로인 0.
8% 수준으로 그 발현을 현저히 억제 하였다. 조골세포조건배양액을 처리한 RAW264.7 세포의 파골세포로의 분화정도는 농도 의존적으로 현저히 감소하였다. 특히, 0.
1 mg/mL) 실크피브로인을 처리한 조골세포 조건배양액(CM) 처리 시 파골세포 분화는 농도 의존적으로 현저히 억제되었다. 즉, 0.001 mg/mL 실크피브로인을 처리한 CM처리 시 +RANKL(양성대조군) 수준의 TRAP 염색된 세포가 관찰되었으나(Fig. 1C), 0.1 mg/mL 실크피브로인 처리한 CM처리 시에는 파골세포의 특징인 주름막 형성 및 TRAP에 의해 보라색으로 염색되는 세포가 음성대조군(-RANKL) 수준이었다(Fig. 1E). 그러나, 0.
후속연구
이는 본 연구에서 실크피브로인 처리에 의해 야기된 IL-1β의 발현 변화가 iNOS 및 NO 생성에 의해 파골세포 분화 억제에 관여하였는지는 알 수 없으나, 그 가능성을 제시하고 추후 연구에서 관련 기전연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
특히, 0.1 mg/mL의 실크피브로인을 처리한 조골세포 조건배양액 처리 시 파골세포로 분화하지 않은 음성대조군(-RANKL) 수준으로 파골세포 분화를 현저히 억제한 것은 OPG의 발현 증가가 아닌 IL-1β의 발현 억제에 의한 것으로 사료되며, 추후 연구를 통해 관련 기전의 연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
RANKL 및 실크피브로인을 처리한 CM에 파골세포 분화에 미치는 효과를 알아보기 위해 TRAP 염색을 사용하였는데, TRAP 염색은 파골세포의 어떤 상태일 때 염색되는 특징을 갖는가?
1에 나타내었다. TRAP 효소의 활성은 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가되는 것으로 보고(29)되었는데, 파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로서 RANKL에 의한 분화초기에는 단핵의 전구세포를 형성하지만 세포가 유합되어 다핵의 성숙 파골세포로 분화되면 골 표면에 부착하여 주름 막을 형성하여 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되는 특징을 가진다(30). 본 연구에서 30 ng/mL 농도의 RANKL 처리에 의해 파골세포로 분화된 RAW264.
파골세포의 분화 및 성숙을 조절하는 주요 인자는 무엇인가?
최근 여러 사전연구에서 조골세포가 파골세포의 분화 및 성숙을 조절할 수 있다고 보고하였다(2). 조골세포에서 발현되는 tumor necrosis factor(TNF) superfamily member인 receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)는 파골세포로의 분화 및 성숙을 조절하는 주요인자이다(3,4). 조골세포에서 파골세포로의 분화는 RANKL과 파골전구세포에서 발현되는 RANKL의 수용체인 receptor activator of nuclear factor κB(RANK)와 결합 후 일어난다.
실크단백질의 구성과 어떤 특성이 있는가?
골 형성촉진 및 골 흡수 억제를 위한 여러 기능성 소재중 누에고치에서 만들어지는 다양한 형태의 실크 단백질이 일부 이용되고 있다(16). 이 실크단백질은 성질이 전혀 다른 단백질인 세리신과 피브로인이 각각 25%와 75%로 구성되어 있으며 물을 포함한 대부분의 용매에 쉽게 녹는 특성이 있고, 인체 친화적 소재로 알려져 있다. 이런 실크단백질을 이용하여 콜라겐을 생성 촉진(17), 상처치유(18), 유해 활성산소를 억제효과(19)와 더불어 최근에는 인지 및 기억력 향상에 관여(20)한다는 연구가 보고되었다.
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