본 연구는 MC3T3-E1 조골 전구세포에 대두추출물을 처리 후 그 조건배양액에서 파골세포분화 관련 국소인자 중파골세포분화 촉진인자(IL-$\beta$, IL-6, RANKL, TNF-$\alpha$, M-CSF) 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제정도를 TRAP 염색 및 관련 분화 지표의 발현을 통해 알아보았다. 대두추출물 처리한 조골세포 조건배양액에서 OPG의 발현이 농도 의존적으로 현저히 증가하였다. 그러나 강력한 파골세포 분화촉진인자로 알려진 IL-1$\beta$의 발현 역시 고농도의 대두추출물 처리 시 현저히 증가하여 고농도의 대두추출물을 처리한 CM 처리 시 TRAP 염색된 일부 파골세포를 확인하였고, 파골세포분화 관련지표인 MMP-9의 발현 또한 저농도 대두 추출물을 처리한 CM 처리에 비해 증가하였다. 이는 저농도의 대두추출물이 고농도의 대두추출물에 비해 파골세포분화억제에 효과적임을 의미하나, 추후 파골세포수준에서 분화억제 관련 기전연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
본 연구는 MC3T3-E1 조골 전구세포에 대두추출물을 처리 후 그 조건배양액에서 파골세포분화 관련 국소인자 중파골세포분화 촉진인자(IL-$\beta$, IL-6, RANKL, TNF-$\alpha$, M-CSF) 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제정도를 TRAP 염색 및 관련 분화 지표의 발현을 통해 알아보았다. 대두추출물 처리한 조골세포 조건배양액에서 OPG의 발현이 농도 의존적으로 현저히 증가하였다. 그러나 강력한 파골세포 분화촉진인자로 알려진 IL-1$\beta$의 발현 역시 고농도의 대두추출물 처리 시 현저히 증가하여 고농도의 대두추출물을 처리한 CM 처리 시 TRAP 염색된 일부 파골세포를 확인하였고, 파골세포분화 관련지표인 MMP-9의 발현 또한 저농도 대두 추출물을 처리한 CM 처리에 비해 증가하였다. 이는 저농도의 대두추출물이 고농도의 대두추출물에 비해 파골세포분화억제에 효과적임을 의미하나, 추후 파골세포수준에서 분화억제 관련 기전연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
Soybean is of particular interest as a food supplement of isoflavones for inhibiting bone resorption in postmenopausal woman. These beneficial effects of isoflavones are caused by functioning as partial agonists or antagonists of estrogen, of which anti-resorptive effect is mediated indirectly throu...
Soybean is of particular interest as a food supplement of isoflavones for inhibiting bone resorption in postmenopausal woman. These beneficial effects of isoflavones are caused by functioning as partial agonists or antagonists of estrogen, of which anti-resorptive effect is mediated indirectly through paracrine factors produced by osteoblasts that act on osteoclasts. In this study, the indirect effect of soybean on osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells were investigated. The conditioned medium was collected from MC3T3-E1 osbeoblasts treated with 0.001 mg/mL~0.1 mg/mL soybean extracts for 6 days, mixed in 1:1 ratio with osteoclast medium, and then added into RAW264.7 cells with receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL), a differentiation inducer for 3 days. Of paracrine factors in the conditioned medium, the protein expression of osteoprotegerin (OPG) with soybean extract was specifically higher in a dose dependent manner than with $10^{-9}$ M~$10^{-6}$ M of estrogen, genistein or daidzein standards. In RAW264.7 cells, the conditioned medium with soybean inhibited RANKL induced osteoclastic differentiation as total number of multinucleated tartrateresistant alkaline phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts and protein expression of MMP-9 were significantly decreased. Coupled with the low expression of estrogen receptor $\alpha$ and $\beta$ proteins in RANKL treated RAW264.7 cells, we demonstrate that the conditioned medium of soybean treated osteoblasts inhibits RANKL induced differentiation of osteoclasts with the selective expression of OPG in osteoblasts.
Soybean is of particular interest as a food supplement of isoflavones for inhibiting bone resorption in postmenopausal woman. These beneficial effects of isoflavones are caused by functioning as partial agonists or antagonists of estrogen, of which anti-resorptive effect is mediated indirectly through paracrine factors produced by osteoblasts that act on osteoclasts. In this study, the indirect effect of soybean on osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells were investigated. The conditioned medium was collected from MC3T3-E1 osbeoblasts treated with 0.001 mg/mL~0.1 mg/mL soybean extracts for 6 days, mixed in 1:1 ratio with osteoclast medium, and then added into RAW264.7 cells with receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL), a differentiation inducer for 3 days. Of paracrine factors in the conditioned medium, the protein expression of osteoprotegerin (OPG) with soybean extract was specifically higher in a dose dependent manner than with $10^{-9}$ M~$10^{-6}$ M of estrogen, genistein or daidzein standards. In RAW264.7 cells, the conditioned medium with soybean inhibited RANKL induced osteoclastic differentiation as total number of multinucleated tartrateresistant alkaline phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts and protein expression of MMP-9 were significantly decreased. Coupled with the low expression of estrogen receptor $\alpha$ and $\beta$ proteins in RANKL treated RAW264.7 cells, we demonstrate that the conditioned medium of soybean treated osteoblasts inhibits RANKL induced differentiation of osteoclasts with the selective expression of OPG in osteoblasts.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 대두추출물을 처리한 MC3T3-E1 조골세포 조건배양액에서 다양한 파골세포 분화관련인자의 발현변화를 확인하고, 그 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포 분화를 억제하는 지를 알아보고자 하였다.
가설 설정
B: The signal intensities from multiple experiments of A were quantified and the integrated areas were first normalized to the corresponding value of β-actin and then to the signal observed in positive control cells (+C).
제안 방법
MC3T3-E1 세포의 조골세포로의 분화는 이들 세포가 단층을 형성한 후 50 μg/mL 비타민 C(ascorbic acid)와 10 mM β-glycerophosphate처리에 의해 유도하였으며(14), RAW264.7 세포의 파골세포로의 분화는 30 ng/mL recombinant murine RANKL 처리에 의해 유도하였다(15).
RAW264.7 파골전구세포에 기존의 분화유도인자(25)인 RANKL 및 대두추출물을 처리한 조골세포조건배양액(conditioned medium: CM)이 파골세포 분화에 미치는 효과를 TRAP 염색을 통해 확인하였다 (Fig. 3). TRAP 효소의 활성은 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가하는 것으로 보고(26)되었는데, 파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로서 RANKL에 의한 분화초기 단계에는 단핵의 파골전구세포를 형성하지만 이후 세포가 유합되어 다핵의 성숙 파골세포로 분화되면 골 표면에 부착되어 주름 막을 형성하여 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되는 특징을 가진다(27).
각 1×105개의 RAW264.7 파골전구세포를 6well plate에 분주하고 30 ng/mL 농도의 RANKL 및 대두 추출물을 비롯한 표준물질을 처리한 조골세포의 조건 배양액을 처리하여 3일간 배양하였다.
각 표준물질의 농도는 하루에 50 mg의 isoflavone을 식품으로 섭취하고 있는 성인 혈중 isflavone 농도인 50～800 ng/mL(0.2～3×10-6 M)과 성인 여성혈중 에스트로겐 농도인 40～80 pg/mL(0.15～0.3×10-9 M)을 기준으로 하였다.
대두추출물의 파골세포분화 억제정도를 RANKL처리한 RAW264.7세포에서 파골세포분화 관련지표로 알려진 matrix metalloproteinase(MMP)-9, cathepsin(Cat)-K 및 calcitonin receptor(CTR)의 발현을 통해 확인하였다(22)(Fig. 4). Cat-K와 CTR의 발현은 처리 군 간의 차이를 보이지 않아 본 연구에 적절한 분화 maker로서 사용되지 못하였다.
또한 조골세포 조건배양액에서 파골세포관련 국소인자의 발현을 위해 centrifugal filter column(Millipore’s Amicon®, Houston, USA)을 사용하여 조건배양액을 농축하였다.
PBST로 5분씩 3차례 세척한 후 PBST에 1:10000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST를 사용하여 다시 5분씩 3차례 세척하였다. 발색은 ECL heperfilm으로 확인하였고(17) imaging densitometer(Bioimaging systems ver. 4.6, UVP Inc., Upland, USA)를 사용하여 정량하였다.
본 연구는 MC3T3-E1 조골 전구세포에 대두추출물을 처리 후 그 조건배양액에서 파골세포분화 관련 국소인자 중 파골세포분화 촉진인자(IL-β, IL-6, RANKL, TNF-α, M-CSF) 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제정도를 TRAP 염색 및 관련 분화 지표의 발현을 통해 알아보았다.
0 and 50 mM tartrate solution)을 100 μL/well 분주하여 37℃에서 15～30분간 빛이 차단된 상태에서 반응시켰다. 이후 TRAP 염색된 거대 다핵의 파골세포는 현미경으로 관찰하였다.
조골세포로의 분화유도와 함께 10-9～10-6 M 농도의 E2, genistein, daidzein 등의 표준단일물질 처리 시 ～163.8%까지 IL-1β의 발현을 증가시켰다.
The numerical values below each lane represent relative signal intensities of MMP-9 (pro-form and active-form, respectively), which were quantified and the integrated areas were first normalized to the corresponding value of β-actin and then to the signal observed in positive control cells (+R: 100, 100). The experiments were performed in triplicat.
그리고 1차 항체(anti-rabbit ER-α, ER-β, IL-1β, IL-6, TNF-α, RANKL, β-actin anti-goat M-CSF, OPG)는 Abcam(MA, USA)에서 구입하였다. 그 외 다른 시약은 (주)KDR(Seoul, Korea)에서 구입하여 별다른 정제과정 없이 그대로 사용하였다.
그리고 1차 항체(anti-rabbit ER-α, ER-β, IL-1β, IL-6, TNF-α, RANKL, β-actin anti-goat M-CSF, OPG)는 Abcam(MA, USA)에서 구입하였다.
대두는 경기도 양주산을 구입하여 약 1 kg을 5배가량의 70% 메탄올로 추출하여 여과하고, 여액을 감압 농축한 후 72시간 동결 건조한 것을 대두 메탄올 추출물(0.69% isoflavone 함유)로 하였다. 대두 메탄올 추출물은 dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma, 최종 농도<0.
본 연구에 사용한 RAW264.7 세포와 MC3T3-E1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, USA)에서 분양 받아 본 연구실에서 계대 배양하여 사용하였다. α-Minimal essential medium(α-MEM), penicillinstreptomycin(5000 U/mL penicillin; 5000 μg/mL streptomycin) 및 fetal bovine serum(FBS)은 Gibco®사(CA, USA)에서 구입하였다.
양성대조군으로 10-9～10-6 M 농도의 17-β estradiol(E2), genistein, daidzein 단일 표준물질을 DMSO에 녹여 사용하였다.
데이터처리
결과는 각 군별 평균과 표준오차로 나타내었고 각 실험군 간의 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 general linear model(GLM) test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.
실험 결과의 자료는 SPSS(Ver 12.0 program, Statistical package for social science)을 이용하여 통계처리 하였다. 결과는 각 군별 평균과 표준오차로 나타내었고 각 실험군 간의 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 general linear model(GLM) test로 p<0.
이론/모형
조골세포에서 합성된 후 분비되어 파골세포분화 조절에 관여하는 여러 국소 인자들(IL-1β, IL-6, TNF-α, M-CSF, RANKL, OPG) 및 Estrogen Receptor(ER)-α, ER-β의 단백질 수준의 발현을 western blotting에 의해 확인하였다.
파골세포의 분화 정도를 Hotokezaka 등(16)의 방법에 따라 TRAP 염색으로 확인하였다. 각 1×105개의 RAW264.
성능/효과
8%까지 IL-1β의 발현을 증가시켰다. 0.001 mg/mL(～273.8%)～0.1 mg/mL(～475.5%)의 대두추출물 처리 시 농도 의존적으로 그 발현이 증가하였으며, 증가 수준은 E2를 비롯한 다른 표준단일물질에 비해 현저하였다(Fig. 2). 조골세포에서 생성, 분비되는 다양한 파골세포 분화관련인자는 파골세포의 분화를 촉진하는 paracrine 효과뿐 아니라 조골세포의 분화를 촉진하는 autocrine 효과를 동시에 지니고 있다(22).
A. Protein extract(25 μg/lane) from control (-C: negative control, +C: positive control), E2 (E9: 10-9 M, E6: 10-6 M), daidzein (D9: 10-9 M, D6: 10-6 M), genistein (G9: 10-9 M, G6: 10-6 M), or soybean (S0.001: 0.001 mg/mL, S0.1: 0.1 mg/mL) treated MC3T3-E1 cells were subjected to 10～12% SDS-PAGE and immunoblotting with ERα, ER β or β-actin.
IL-1β의 발현양상과 유사하게 조골세포로 분화하지 않은 음성 대조군(-C)에서 OPG 발현은 조골세포로 분화 유도된 양성대조군(+C)의 17.2% 수준으로 현저히 낮았다.
이는 여러 사전연구(25-27)와 일치하는 결과로서 RANKL은 파골세포 분화에 필수물질임을 재확인하였다. RANKL처리에 의한 파골세포 분화와 함께 10-9～10-6 M 농도의 E2, genistein, daidzein 등의 표준단일물질 및 저 농도의 대두추출물(0.001 mg/mL)을 처리한 CM처리 시 일부 단핵의 파골전구세포는 확인되었으나, 다핵의 파골세포와 주름 막은 형성되지 않았다. 그러나 0.
그러나 강력한 파골세포 분화촉진인자로 알려진 IL-1β의 발현 역시 고농도의 대두추출물 처리 시 현저히 증가하여 고농도의 대두추출물을 처리한CM 처리 시 TRAP 염색된 일부 파골세포를 확인하였고, 파골세포분화 관련지표인 MMP-9의 발현 또한 저농도 대두추출물을 처리한 CM 처리에 비해 증가하였다.
7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제정도를 TRAP 염색 및 관련 분화 지표의 발현을 통해 알아보았다. 대두추출물 처리한 조골세포 조건배양액에서 OPG의 발현이 농도 의존적으로 현저히 증가하였다. 그러나 강력한 파골세포 분화촉진인자로 알려진 IL-1β의 발현 역시 고농도의 대두추출물 처리 시 현저히 증가하여 고농도의 대두추출물을 처리한CM 처리 시 TRAP 염색된 일부 파골세포를 확인하였고, 파골세포분화 관련지표인 MMP-9의 발현 또한 저농도 대두추출물을 처리한 CM 처리에 비해 증가하였다.
이중 genistein과 daidzein은 에스트로겐과 유사한 화학적 구조에 기인하여 세포내에서 ER과 결합하여 에스트로겐 효과뿐 아니라 항 에스트로겐 효과를 동시에 가지는 선택적 에스트로겐 길항제의 기능하는 것으로 알려져 있다(11). 본 연구의 선행연구에서 대두 추출물에 함유된 isoflavone인 genistein 및 daidzein의 함유량을 분석하였으며 MG-63 조골세포에 대두추출물처리 시세포증식 및 관련인자의 발현이 증가됨을 확인하였다(13). 본 선행연구를 비롯하여 isoflavone과 이를 다량 함유한 대두에 대한 연구가 식이 첨가를 통한 임상영양 연구뿐 아니라 난소 절제 동물 모델을 이용하여 활발히 진행되고 있으나 (10,12,13), 폐경 후 골량 감소 및 골다공증의 발병은 조골세포보다는 파골세포의 상대적인 작용 증가에 기인됨에도 불구하고 골세포 수준에서의 이소플라본 및 대두 추출물의 연구는 주로 조골세포에서 이루어져, 파골세포를 이용한 이들의 골다공증 예방의 효과 및 관련연구는 미흡한 실정이다.
TRAP 효소의 활성은 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가하는 것으로 보고(26)되었는데, 파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로서 RANKL에 의한 분화초기 단계에는 단핵의 파골전구세포를 형성하지만 이후 세포가 유합되어 다핵의 성숙 파골세포로 분화되면 골 표면에 부착되어 주름 막을 형성하여 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되는 특징을 가진다(27). 예비실험을 통해 결정된 농도인 30 ng/mL의 RANKL 처리에 의해 파골세포로 분화된 RAW264.7세포(양성대조군: +R, Fig. 3)에서 파골세포의 특징인 다핵이 관찰되었으며, 주름 막을 형성하여 파골세포의 화학적 표지효소인 TRAP 염색 시 보라색으로 염색되었다. 그러나 RANKL을 처리하지 않은 일반 RAW264.
이 결과는 표준단일물질 및 저농도의 대두추출물을 처리한 CM처리 시 TRAP염색된 파골세포형성이 고농도의 대두추출물에 비해 현저히 감소한 것(Fig. 3)과 상응하는 결과로서, 고농도의 대두추출물(S0.1)을 조골세포에 처리 시파골세포 분화억제에 관여하는 OPG의 발현(S0.1: 643.4%)을 유의적으로 증가시켰으나 동시에 파골세포 분화를 강력히 촉진하는 IL-1β의 발현 증가수준(S0.1: 475.5%)이 저 농도(S0.001: 273.8%)의 약 1.7배로 OPG(저농도의 1.3배) 발현 증가수준 이상으로 그 발현이 높았기 때문으로 사료된다.
2% 수준으로 현저히 낮았다. 조골세포로의 분화 유도와 함께 E2를 비롯한 다른 표준단일물질 처리 시 그 발현을 ～382.3%까지 증가하였고, 0.001 mg/mL 및 0.1 mg/mL의 대두출물처리시 그 발현은 각 ～479.0%, ～643.4%로 농도 의존적으로 현저히 증가하였다(Fig. 2). 이는 대두에 다량 함유되어 있는 genistein, daidzein 등을 비롯한 여러 isoflavone 혼합체 간의 시너지효과에 의한 것으로 생각되어진다.
후속연구
4). Cat-K와 CTR의 발현은 처리 군 간의 차이를 보이지 않아 본 연구에 적절한 분화 maker로서 사용되지 못하였다. 반면, E2, genistein, daidzein 등의 표준단일물질 및 대두추출물을 처리한 CM처리 시 MMP-9(upper band: pro-form, bottom band: active-form)의 발현은 양성대조군에 비해 현저히 감소하였다.
다만 저 농도의 식물성에스트로겐에 함유되어 있는 isoflavone은 에스트로겐 효과를 나타내지만 고농도의 식물성에스트로겐에 함유되어 있는 isoflavone은 항 에스트로겐 효과를 나타내는 등의 biphasic한 효과를 보고한 여러 사전 연구(13,28)와 유사하게 본 연구에서도 저 농도의 대두추출물을 처리한 조골세포 조건배양액이 파골세포분화억제에 고농도의 대두추출물에 비해 효과적임을 제시한다. 또한 본 연구결과를 기초로 대두추출물의 간접적인 처리에 의한 파골세포분화억제 관련기전을 세포수준에서의 확인이 추후연구를 통해 심도 있게 이루어져야 할 것으로 사료된다.
본 연구의 조골세포조건배양액에서 IL-1β 및 OPG의 발현결과는 양성대조군(+C)에 대비한 상대적인 발현양상을 확인한 것으로서 추후 각 인자의 절대적인 수치를 확인 및 어느 수준 이상의 IL-1β 및 OPG가 파골세포분화를 각각 촉진, 억제할 수 있는지를 검증할 필요가 있다고 여겨진다.
그러나 강력한 파골세포 분화촉진인자로 알려진 IL-1β의 발현 역시 고농도의 대두추출물 처리 시 현저히 증가하여 고농도의 대두추출물을 처리한CM 처리 시 TRAP 염색된 일부 파골세포를 확인하였고, 파골세포분화 관련지표인 MMP-9의 발현 또한 저농도 대두추출물을 처리한 CM 처리에 비해 증가하였다. 이는 저농도의 대두추출물이 고농도의 대두추출물에 비해 파골세포분화억제에 효과적임을 의미하나, 추후 파골세포수준에서 분화억제 관련 기전연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
골 항상성은 무엇에 의해 유지되는가?
골 항상성은 골 흡수에 관여하는 파골세포와 골 형성에 관여하는 조골세포의 긴밀한 상호작용에 의해 유지된다. 파골전구세포로부터 파골세포로의 분화과정에 조골세포가 관여함은 여러 보고를 통해 잘 알려져 있다(1).
파골세포분화는 무엇에 의해 시작되는가?
파골전구세포로부터 파골세포로의 분화과정에 조골세포가 관여함은 여러 보고를 통해 잘 알려져 있다(1). 파골세포분화는 조골세포에서 발현되는 파골세포 분화유도인자인 receptor activator of nuclear factor-κB lignad(RANKL)와 파골전구세포에서 발현되는 그 수용체 RANK의 결합에 의해 시작되며, 체내 여러 종류의 전신성 호르몬 및 조골세포에서 생성·분비되는 다양한 국소인자에 의해 조절된다(2,3). 특히, 여성의 골 대사 균형 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 여성호르몬인 에스트로겐은 세포막 혹은 핵막에 존재하는 그 수용체(Estrogen Receptor: ER)와 결합 후 파골세포의 분화를 조절할 수 있는 것으로 보고되어 있다(4).
세포막 혹은 핵막에 존재하는 그 수용체(Estrogen Receptor: ER)와 결합 후 파골세포분화를 조절할 수 있는 것으로 보고되는 것은 무엇인가?
파골세포분화는 조골세포에서 발현되는 파골세포 분화유도인자인 receptor activator of nuclear factor-κB lignad(RANKL)와 파골전구세포에서 발현되는 그 수용체 RANK의 결합에 의해 시작되며, 체내 여러 종류의 전신성 호르몬 및 조골세포에서 생성·분비되는 다양한 국소인자에 의해 조절된다(2,3). 특히, 여성의 골 대사 균형 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 여성호르몬인 에스트로겐은 세포막 혹은 핵막에 존재하는 그 수용체(Estrogen Receptor: ER)와 결합 후 파골세포의 분화를 조절할 수 있는 것으로 보고되어 있다(4). 또한, 조골세포에서 분비되는 국소인자 중 monocyte-macrophage colony-stimuating factor(M-CSF), tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-1 그리고 IL-6 등이 파골세포의 분화 조절에 관여하는데, 에스트로겐은 이들 인자의 발현감소를 유도하여 파골세포분화를 억제할 수 있다(5,6).
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