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문제 정의
- 그런데 山藥을 항암제인 NCS 및 ROS 인 H2O2와 각각 동시 투여하였을 때에는 고농도에서는 항암효과를 증가시키는 결과를 나타냈지만 낮은 농도에서는 NCS나 H2O2로 인한 HeLa cell의 apoptosis를 완화하였다. 또한 이러한 山藥의 항암제가 apoptosis 를 일으키는 것에 대한 완화작용의 기전을 확인하고자 Caspase-3, Bcl-2, PARP, p53 등의 발현의 변화를 확인함으로써 항산화 과정이 이러한 효과를 일으키는 데 중요한 역할을 하는 것을 보고하였다.
- 본 연구에서는 이러한 결과를 바탕으로 山藥이 HeLa cell에 항산화작용을 통하여 산화적 스트레스로 인한 apoptosis를 억제해주는 기전을 보다 자세히 알아보고 추가적으로 항암제와의 병용투여 시의 항암효과의 변화를 확인하고자 하였다. 세포주기 분석법을 통하여 山藥이 HeLa cell의 세포주기에 미치는 영향을 확인하였고, NCS와 H2O2를 병용 투여한 기존연구 결과를 보충하기 위하여 다른 항암제인 cisplatin 과 항암효과가 밝혀진 한약재인 半枝蓮을 山藥과 병용투여하여 HeLa cell의 생장에 미치는 영향을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 HeLa cell에 여러가지 산화적 스트레스와 함께 山藥을 동시 처리하였을 때의 HeLa cell의 cell cycle의 변화와 cisplatin 및 半枝蓮과 山藥을 동시 처리하였을 때의 HeLa cell의 생존율의 변화를 확인하였다. 이와 같은 일련의 실험을 통하여 얻어진 결과를 이 논문을 통해 발표하고자 한다.
제안 방법
- 50 g의 한약재를 각각 2시간동안 열수 추출과 메탄올추출로 각각 추출하여 AVANTEC TOYO #2 filter로 여과하여 불용성 성분은 제거하고 분말로 냉동건조 하였다. 추출물을 PBS에 녹여 희석한 후에 pH 7로 조정하고 0.
- 96-well plate (SPL, Korea)에 배양한 세포들을 2.0 x 105 개씩 분주하여 24시간 배양한 후에 대조군에는 cell culture water를 처리하고 실험군에는 각각의 농도로 배지와 山藥추출물, cisplatin 과 半枝蓮추출물을 희석하여 처리하였다. 그리고 PBS(Welgene)로 2회 세정하여 MTT (5 mg/ml) 10 μl을 37℃에서 3시간동안 처리하였다.
- Distribution of cell population in G0/G1, S and G2/M phases of HeLa cells. HeLa cells treated with D. batatas extracts, H2O2 and D. batatas + H2O2 for 24 h, and stained with propidium iodide followed by cytometry analysis. Cells were untreated, treated with 10-fold diluted extracts of D.
- HeLa cell에 H2O2, cisplatin, 半枝蓮과같은 산화적 스트레스와 함께 山藥을 동시 처리하여 cell cycle의 변화, HeLa cell 의 생존율의 변화를 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- HeLa cell을 아무것도 처리하지 않은 대조군과 80배의 山藥추출물을 처리한 군, 2 mM의 H2O2를 처리한 군, 2 mM 의 H2O2 와 80배의 山藥추출물을 함께 처리한 군으로 나누어 24시간 배양한 후에 PBS로 세정하여 차가운 100% 에탄올에서 4E에서 하룻밤동안 고정하였다. 다시 PBS 로 세정하여 PI buffer(0.
- 山藥과 현재 사용되고 있는 대표적인 항암제의 하나인 cisplatin 을 병용 투여하여 山藥이 HeLa cell에서 cisplatin으로 유도되는 apoptosis 에 미치는 영향을 확인하였다.
- 1 mM EDTA, 50 ug/ml RNase A, 50 ug/ml propidium iodide)와 함께 배양하였다. 각각의 실험군과 대조군의 세포주기는 FACscan laser flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)로 측정한 후에 Becton Dickinson software (Lysis II Cellfit)을 이용하여 분석하였다.
- 5). 또 58 mg/mL의 물중탕으로 추출한 半枝蓮과 각 농도의 山藥을 24시간동안 처리한 HeLa cell의 viability를 측정하였다(Fig. 6). 半枝蓮 물 중탕과 메탄올 중탕을 각각의 농도로 HeLa cell에 처리했을 때 최종적으로 60%의 cytotoxicity 를 나타내는 것을 알 수 있었다.
- 배 양된 HeLa cell에 cisplatin의 농도를 0, 5, 10, 25, 50 uM로 증가시키며 24시간 동안 처리한 후 cell viability에 미치는 영향을 확인하였고, 30 uM cisplatin과 山藥을 24시간동안 동시처리하여 HeLa cell의 viability를 확인하였다. 항암제로 쓰이는 cisplatin 을 각각의 농도로 처리하였을 경우 농도의존적으로 cell viability 가 감소하여 50 uM에서 90%의 cell이 죽는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 배양된 HeLa cell에 80배 희석된 山藥 추출물과 2 mM H2O2를 각각 또는 함께 처리하여 24시간 후에 cell cycle의 변화를 G0/G1, G2/M, S기로 나누어 각 단계별로 정량분석하였다 (Fig. 1).
- 배양된 HeLa cell에 물중탕으로 추출한 半枝蓮과 메탄올 중탕으로 추출한 半枝蓮을 0, 10, 20, 40, 80배로 희석하여 24시간 처리하여 HeLa cell의 viability를 확인하였다(Fig. 5). 또 58 mg/mL의 물중탕으로 추출한 半枝蓮과 각 농도의 山藥을 24시간동안 처리한 HeLa cell의 viability를 측정하였다(Fig.
- 세포주기 분석법을 통하여 山藥이 HeLa cell의 세포주기에 미치는 영향을 확인하였고, NCS와 H2O2를 병용 투여한 기존연구 결과를 보충하기 위하여 다른 항암제인 cisplatin 과 항암효과가 밝혀진 한약재인 半枝蓮을 山藥과 병용투여하여 HeLa cell의 생장에 미치는 영향을 확인하였다.
- 항암작용이 밝혀진 한약재인 半枝蓮과 山藥을 병용투여하여 山藥이 HeLa cell 에서 半枝蓮으로 유도되는 apoptosis에 미치는 영향을 확인하였다.
대상 데이터
- Cisplaine 동국대학교 병원 (Ilsan, Korea)을 통하여 구입하였다. Fluorescent mounting medium (DakoCytomation, CA)를 제외한 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 diphenyltetrazolium bromide] (MTT), dimethylsulfoxide (DMSO) 등의 모든 약품은 Sigma/Aldrich (St Louis, USA)를 통하여 구입하였다.
- Fluorescent mounting medium (DakoCytomation, CA)를 제외한 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 diphenyltetrazolium bromide] (MTT), dimethylsulfoxide (DMSO) 등의 모든 약품은 Sigma/Aldrich (St Louis, USA)를 통하여 구입하였다.
- HeLa cell 은 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, nonessential amino acids, 1.0 mM sodium pyruvate, 10% FBS가 포함된 minimal essential medium (MEM) (Welgene, Korea) 배지로 37E, 95% air/ 5% CO2가 유지되는 incubator 에서 배양하였다.
- HeLa celle American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) 에서 구입하였다. HeLa cell 은 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, nonessential amino acids, 1.
- 규격 한약품인 山藥(Dioscorea batatas Thunberg)과 半枝蓮(Scutellaria barbata Don) 은 동국대학교 한방병원 (Ilsan, Korea)을 통해 구입한 후 정선하여 사용하였다. 50 g의 한약재를 각각 2시간동안 열수 추출과 메탄올추출로 각각 추출하여 AVANTEC TOYO #2 filter로 여과하여 불용성 성분은 제거하고 분말로 냉동건조 하였다.
이론/모형
- Cell viability는 MTT assay를 통해 알아보았다. 96-well plate (SPL, Korea)에 배양한 세포들을 2.
성능/효과
- HeLa cell에 H2O2와 山藥을 각각 그리고 함께 투여한 결과 H2O2를 단독으로 처리하였을 때 G2/M 기에 해당하는 세포의 비율이 높아지는 현상이 나타나며 H2O2의 산화적 스트레스가 G2/M arrest를 일으켰음을 확인할 수 있었다. 이는 H2O2를 human diploid fibroblast에 처 리한 연구에서 나타난 결과와 일치하였다 37).
- . HeLa cell에 cisplatin 을 단독으로 처리하였을 때에는 농도 의존적으로 세포활성이 감소하는 것이 확인되 었지만 HeLa cell에 H2O2와 cisplatin 을 함께 처리하였을 때 山藥의 농도가 증가함에 따라 HeLa cell의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 山藥이 cisplatin 으로 인하여 발생하는 HeLa cell의 apoptosis를 억제하는 작용을 하는 것을 알 수 있었다.
- 6). 半枝蓮 물 중탕과 메탄올 중탕을 각각의 농도로 HeLa cell에 처리했을 때 최종적으로 60%의 cytotoxicity 를 나타내는 것을 알 수 있었다. 半枝蓮과 山藥을 병용 투여하면 특정 농도에서 HeLa cell의 생존율을 증가시키다가 山藥의 농도가 진해짐에 따라 HeLa cell의 생존율을 다시 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- 半枝蓮 물 중탕과 메탄올 중탕을 각각의 농도로 HeLa cell에 처리했을 때 최종적으로 60%의 cytotoxicity 를 나타내는 것을 알 수 있었다. 半枝蓮과 山藥을 병용 투여하면 특정 농도에서 HeLa cell의 생존율을 증가시키다가 山藥의 농도가 진해짐에 따라 HeLa cell의 생존율을 다시 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- 山藥과 H2O2가 처리된 HeLa cell의 Cell cycle을 알아본 실험으로 山藥을 처리했을 때 contr이군과 크게 차이가 없으나 H2O2를 처리했을 때 G0/G1 기가 감소하고 G2/M기가 증가하는 것으로 보아 G2/M arrest가 발생한 것을 확인 할 수 있었다. 山藥과 H2O2 를 동시에 처리했을 때는 H2O2 만을 처리했을 때보다 G0/G1 기가 증가하고 G2/M기가 감소하
- 3). 그러나 30 uM cisplatin과 山藥을 동시 처리하였을 때 山藥이 cisplatin 에 의한 세포의 죽음을 완화시키고 오히려 세포의 생존율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 그러나 HeLa cell과 半枝蓮을 동시에 처리하였을 때 저농도에서 半枝蓮의 세포 활성이 증가하였고 점차 山藥의 농도가 증가함에 따라 세포활성이 감소하는 결과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 山藥이 半枝蓮과 병용투여되었을 때 농도에 따라 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하기도 하지만 세포의 죽음을 유도하는 항암작용을 모두 나타내는 것으로 NCS 나 H2O2와 山藥을 함께 투여하였을 때 양측성 작용을 보인 기존의 연구와 부합하는 결과이다22).
- HeLa cell에 cisplatin 을 단독으로 처리하였을 때에는 농도 의존적으로 세포활성이 감소하는 것이 확인되 었지만 HeLa cell에 H2O2와 cisplatin 을 함께 처리하였을 때 山藥의 농도가 증가함에 따라 HeLa cell의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 山藥이 cisplatin 으로 인하여 발생하는 HeLa cell의 apoptosis를 억제하는 작용을 하는 것을 알 수 있었다.
- 이 실험을 통하여 山藥이 농도에 따라 독성물질로부터 세포를 보호하여 세포의 apoptosis 를 억제하는 작용과 세포의 apoptosis 를 유도하는 작용을 모두 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 일련의 실험결과로 볼 때 山藥은 H2O2 로 인하여 발생하는 HeLa cell의 cell cycle arrest를 완화시키는 작용을 하였으며, 산화적 스트레스를 통하여 항암작용을 나타내는 cisplatin 과 半枝蓮으로 인한 HeLa cell의 apoptosis의 진행을 완화하는 결과를 확인할 수 있었다.
- 항암제로 쓰이는 cisplatin 을 각각의 농도로 처리하였을 경우 농도의존적으로 cell viability 가 감소하여 50 uM에서 90%의 cell이 죽는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 그러나 30 uM cisplatin과 山藥을 동시 처리하였을 때 山藥이 cisplatin 에 의한 세포의 죽음을 완화시키고 오히려 세포의 생존율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 이러한 결과를 한의학적으로 고찰해보면 補益하는 것이 山藥 의 주요 효능이므로 半枝蓮과 같은 祛邪 의 개념을 가진 약물과 배합하여 종양의 치료에 응용하는 扶正去邪 즉 攻補兼施 의 치료법으로 생각할 수 있다53). 山藥 의 농도에 따라 다른 반응을 보이기 때문에 환자의 正氣의 손상여부 및 약재의 배합에 따라 효능의 변화가 생길 수 있으므로 계속적인 연구가 필요할 것이다.
- 예를 들어 김 등 9)은 노화유발 흰쥐에서 山楂가 항산화 작용을 일으킴으로써 노화를 억제함을 보고하였고, 최 등10)은 合歡皮가 혈관내피세포에서 높은 항산화 활성을 보임을 보고하여 심혈관질환에 대한 치료 가능성을 보고하였으며, 박 등11)은 鬼箭羽의 유방암세포에 대한 성장억제 효과 및 항산화 효과를 보고하였다. 그러므로 항산화 작용을 통한 건강증진과 노화억제 및 조직재생 혹은 산화작용의 조절을 통한 종양 치료 효과가 있는 한약의 연구는 지속가능한 천연물 연구의 중요한 분야라 할 것이다.
- 또한 半枝蓮과 山藥의 병용투여 결과와 선행연구성과22)를 종합하여 볼 때 山藥의 농도에 따라 apoptosis 가 유발되기도 하고, 완화되기도 하는 쌍향성의 작용을 보임을 알 수 있었다. 이는 山藥이 단일성분이 아닌 여러가지 성분들로 이루어진 복합물이기 때문인 것으로 여겨지나 이에 대한 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 추후 다른 세포주를 이용한 山藥의 세포보호 효과에 대한 연구를 통하여 山藥의 항산화 작용에 대한 더 많은 정보를 확인할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 半枝蓮과 山藥의 병용투여 결과와 선행연구성과22)를 종합하여 볼 때 山藥의 농도에 따라 apoptosis 가 유발되기도 하고, 완화되기도 하는 쌍향성의 작용을 보임을 알 수 있었다.
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