선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 연구에서는 전통적으로 사용되어져 온 약용식물 24 종의 메탄올 추출물에 대한 선행 연구로 총페놀 함량과 전자공여 능을 측정하였다. 그 중 총 페놀 함량과 전자공여 능이 높았던 선학초를 선택하여 메탄올 추출물을 극성별 유기 용매로 분획하고 분획별 항산화 및 항암 활성을 알아보았다.
- 항산화 활성으로 총페놀, 전자공여능, 아질산염 소거능을, 효소 저해 활성으로 XOase 저해 활성을 조사하였으며, 암세포인 HT-29, SNU-1, HeLa 세포에 대한 성장 저해 활성을조사하여 기능성 식품으로의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 2ml를 가하여 37, C에서 15분 동안 반웅 시키고 20% TCA 1ml로 반응을 종료시킨 다음 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 흡광도 292 nm에서 즉정하였다. Positive control로 ascorbic acid를 사용하여 저해활성을 비교하였으며, 실험에 사용된 농도는 100ml, 500 gg/ml, 1000 μg/ml이었고 저해율(%)은 다음 식에따라 구하였다.
- 추출물 무 첨가구에는 시료 대신 methanol 1 ml를 첨가하여 동일하게 실험하고 주줄 물 첨가 구에 대한 흡광도의 감소비율로 전자공여능을 나타내었다. Positive control로 합성 항산화제인 BHT를 동일한방법으로 실험하여 각각의 분획 추출물이 가지는 환원력과 비교하였으며, 다음 식으로 전자공여능(%)을 구하였다.
- 전자공여능은 Blois의 방법(2)으로 측정하였다. 각각의 분획을 100 μg/ml, 500 pig/ml, 1000 μg/ml의 농도로 methanol에 녹여 조제하고 1 ml를 test tube에 취하였다. 여기에4 X ICTM의 DPPH 용액 4 ml를 가하여 vortex mixer로 10초간 진탕하고 실온에서 20분 동안 방치한 후에 520 nm 에서 홉광도를 측정하였다.
- 측정하였다. 그 중 총 페놀 함량과 전자공여 능이 높았던 선학초를 선택하여 메탄올 추출물을 극성별 유기 용매로 분획하고 분획별 항산화 및 항암 활성을 알아보았다.
- 용매별 분획은 methanol 추출물에 약 5배수의 증류수를 가하여 현탁 시킨 후 증류수와 같은 양의 hexane을 가하여 진탕하고 방치한 후 용매층을 감압농축하고 동결 건조하여 hexane 분획을 얻었다. 남아있는 수용성층을 동일한 방법으로chloroform, Ethyl acetate 및 Butanol을 첨가하여 순차적으로 분획한 후 농축하여 각각 chloroform, Ethyl acetate 및 Butanol 분획으로 사용 하였고 남은 수용성층은 농축하여 water 분획으로 하였다. 모든 분획들은 데시케이터에서 보관하며 실험에 사용하였다.
- 분양받아 사용하였다. 대장암과 위암 세포에는 RPMI1640(L-glutamine 300 mg)배지를, 자궁경부암 세포에는 DMEM(4.5 입I 이ucose & L-Glutamine) 배지를 사용하였고, 각각에 56℃ water bath에서 30분간inactivation 처리한 FBS 10% (v/v)와 antibiotics(penicillin/streptomycin) 1% (v/v)를 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 계대배양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2-3 회 80%이상의 배지를 교환하여 실시하였다.
- 96-well plate의 12개 컬럼 중 10개의 컬럼에 각각의 농도로 조정한 세포 부유액을 180 μ1씩 분주하고 한 칼럼 에는 세포가 없는 배지만을 200 |11 가해 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다. 분획 추출물은 100% DMSO에 녹인 후 희석하여 DMSO의 배지 내 최종농도가 0.02%가 되도록 하였으며 20씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 5, 10, 50, 100μg/ml로 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1칼럼(6 wells)을 동일한 조건으로 사용하였으며, 나머지 한 칼럼에는 추출물 대신 0.
- 선학초 메탄올 추출물을 유기용매를 이용하여 분획하고 각각의 분획별 항산화 및 항암 활성을 조사하였다. 항산화 활성으로 총페놀, 전자공여능, 아질산염 소거능을, 효소 저해 활성으로 XOase 저해 활성을 조사하였으며, 암세포인 HT-29, SNU-1, HeLa 세포에 대한 성장 저해 활성을조사하여 기능성 식품으로의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.
- 선학초(#)의 건조시료 5배량의 metiianol을가하여 5일간 때때로 흔들어 주며 3회 반복 추출하고 여과지 (Adventec toyo2, Toyo Roshi Kaisha, Japan)를 사용하여 여과하였다. 여액을 45P에서 감압농축하고 농축액을 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다.
- 5 입I 이ucose & L-Glutamine) 배지를 사용하였고, 각각에 56℃ water bath에서 30분간inactivation 처리한 FBS 10% (v/v)와 antibiotics(penicillin/streptomycin) 1% (v/v)를 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 계대배양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2-3 회 80%이상의 배지를 교환하여 실시하였다.
- 4 ml을 가하여 잘 혼합하였다. 실온에서 15분간 방치한 후 520nm에서 흡광도를 측정하고 잔존하는 아질산량을 측정하였다, 이때 주줄물 무 첨가구는 증류수 0.5 ml를 가하여 같은 방법으로 실험하였으며, positive controle ascorbic acid를 사용하여 아질산염 소거능을 비교하였다. 실험에사용된 농도는 100 pg/ml, 500 p.
- 암세포의 성장 저해 활성은 Carmichael 등(3)의 colorimetric MTT assay방법을 응용하여 측정하였다. HT-29와 SNU-1 세포는 RPMI1640 비, 지에서, HeLa 세포는 DMEM 배지에서 72시간 배양하여 실험에 사용하였고, HT-29와 SNU-1 세포는 1 X lecell/well이 되게 농도를 조정하고 HeLa 세포는 1 X Ocell/well로 조정 하여 실험하였다.
- 여액을 45P에서 감압농축하고 농축액을 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다. 용매별 분획은 methanol 추출물에 약 5배수의 증류수를 가하여 현탁 시킨 후 증류수와 같은 양의 hexane을 가하여 진탕하고 방치한 후 용매층을 감압농축하고 동결 건조하여 hexane 분획을 얻었다. 남아있는 수용성층을 동일한 방법으로chloroform, Ethyl acetate 및 Butanol을 첨가하여 순차적으로 분획한 후 농축하여 각각 chloroform, Ethyl acetate 및 Butanol 분획으로 사용 하였고 남은 수용성층은 농축하여 water 분획으로 하였다.
- 여기에 탄산나트륨포화용액 1ml을 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치시키고 760nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량하기 위해 표준물질 tannic acid를 DMS에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여검량선을 작성하고 각 분획의 총 페놀 함량을 측정하였다.
- 02%가 되도록 하였으며 20씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 5, 10, 50, 100μg/ml로 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1칼럼(6 wells)을 동일한 조건으로 사용하였으며, 나머지 한 칼럼에는 추출물 대신 0.2%의 DMSO만을 20μ1씩 첨 가하여 100% 생존군으로 하였다. 암세포와 추출물이 접종된 plate 를 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 배양 후 MTT 시약 25 μ1를 모든 well에 가하고 다시 4시간 배양하였다.
대상 데이터
- assay방법을 응용하여 측정하였다. HT-29와 SNU-1 세포는 RPMI1640 비, 지에서, HeLa 세포는 DMEM 배지에서 72시간 배양하여 실험에 사용하였고, HT-29와 SNU-1 세포는 1 X lecell/well이 되게 농도를 조정하고 HeLa 세포는 1 X Ocell/well로 조정 하여 실험하였다. 96-well plate의 12개 컬럼 중 10개의 컬럼에 각각의 농도로 조정한 세포 부유액을 180 μ1씩 분주하고 한 칼럼 에는 세포가 없는 배지만을 200 |11 가해 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다.
- 사용하였다. 세포배양에 사용된 DulbeccSs modified eagle's medium (DMEM, 4.5 g// glucose & L-Glutamine), fetal bovine serum(FBS)은 Cambrex사(USA), Roswell park memorial institute medium(RPMI, 2.05 mM L-Glutamine), penicilline Hyclone사(USA) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약은 특급 및 일급 시약으로 Folin-ciocalteu's phenol reagent, 2, 2-diphenyl-1 -picryl-hydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, trichloroacetic acid (TCA), ascorbic acid, butylated hydroxy toluene (BHT), potassium phosphate(monobasic, dibasic), sulfanilic acid, naphthylamine, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyterazoliumbromide (MTT)은 Sigma(USA), dimetiiyl sulfoxide (DMSO), sodium nitrite, sodium carbonate, tannic acideMerck사(Germany) 제품을 사용하였고, 시료의 추출 및 분획에 사용된 용매로 methanol, w-hexane, chloroform, ethyl acetate 및 n-butanole Burdick & Jackson사(USA)의 HPLC급시약을 사용하였다. 세포배양에 사용된 DulbeccSs modified eagle's medium (DMEM, 4.
- 실험에 사용한 3종류의 인간유래 세포는 대장암 세포인HT-29(KCLB 30038), 위암 세포인 SNU-1(KCLB 00001),자궁경부암 세포인 HeLa (KCLB 10002)로서 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였다. 대장암과 위암 세포에는 RPMI1640(L-glutamine 300 mg)배지를, 자궁경부암 세포에는 DMEM(4.
- 실험에 사용한 기기로는 rotary vacuum evaporator (N-1000, Eyela, Japan), IV/VIS spectrophotometer (V-550, JASCO, USA), microplate spectrophotometer (SPECTRA max 340PC, Molecular Devices, USA), CO2 incubator (MCO-17AIC, Sanyo, Japan), microplate shaker (SH30, FINEPCR, Korea), high speed centrifuge (Supra22K, Hanil,Korea) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용한 선학초(# pilosa)는 2006년 10월대구약령시에서 건조 상태의 국산재료를 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- XOase 저해활성은 Stripe와 Corte의 방법 (4)에 따라 측정하였다. 효소의 반응에 사용된 기질액은 0.
- 선학초# pilosd)의 용매별 분획에 대한 종 페놀 함량은 Folin-Denis방법 (1)에 따라 분광광도계를 이용하여 760nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 각각의 분획을 DMSO에 일정 농도로 녹인 후 0.
- 아질산염 소거능은 Gray와 Dugan의 방법(3)에 따라 측정하였다. 1 mM NaNQ용액 1 ml에 각각의 분획 추출물을 농도별로 0.
- 전자공여능은 Blois의 방법(2)으로 측정하였다. 각각의 분획을 100 μg/ml, 500 pig/ml, 1000 μg/ml의 농도로 methanol에 녹여 조제하고 1 ml를 test tube에 취하였다.
성능/효과
- 75%. 21.82%의 소거능을 보였고 모든 분획에서 농도에 비례하여 소거능이 증가하였다. 이는 모든 분획들에 아질산염을 소거시키는 물질이 존재하고 있음을 의미한다.
- 86 이 었다. Chloroform 분획에서 각각의 성장 저해율은 HT-29에서 6.35%~74.30%(IC50 = 82.12 jig/ml), SNU-1에서 8.64^89.56% (IC50 =5367 μg/ml)로 hexane 다음으로 높았고, HeLa 세포에서는 BuOH과 water 분획에서 각각 3.98%~25.38%, 1.26%~45.09%로 hexane 분획 다음으로 저해 활성이 높았다. 모든 분획에서 농도에 비례하여 성장이 저해되는 세포는HeLa 세포뿐이었으며 , HT-29세포에서 EtOAc, BuOH, water분획은 성장 저해활성이 없었다.
- 3과 같다. EtOAc 분획에서 75.62% (500 #ml), 93.06%(1000 μg/ml)로 대조구보다 높은 효소저해활성을 보였으며,BuOH 분획에서는 57.66% (500 pig/ml), 91.73% (1000 gg/ml)로 대조구보다 낮거나 유사한 수준의 저해활성을 보였다.
- EtOAc와 BuOH 분획은 총페놀 함량과 DPPH라디칼 소거 능이 다른 분획에 비해 높게 나타난 분획으로 SNU-1 세포에 대한 저해활성은 상반되는 결과를 보여 주었다. 결과적으로 EtOAc 분획에 존재하는 성분들은 전자공여 능은 우수하나 암세포의 성장 억제 물질은 거의 존재하지 않으며, BuOH 분획에 존재하는 성분은 전자공여능 뿐만 아니라 암세포의 성장도 어느 정도 저해할 수 있는 물질들인 것으로 추정되어 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각 된다.
- 대한 수율은 Table 1과 같다. methanol 추출물의 수율은 9.27%였고 물 추출물이 56.88%로 가장 높았으며 EtOAc 분획물이 5.57%로 가장 낮았다.
- 1). 모든 분획물들이 농도에 비례하여 전자공여 능이 증가하였고, 이는 모든 분획에서 DPPH를 환원시킬 수 물질이 존재하고 있음을 보여 주는 것이며 분획별 총 페놀 함량과도 깊은 상관성이 있는 것으로 생각된다. 전자공여 능은 라디칼에 수소를 공여함으로써 지질과산화 저해뿐만 아니라, 체내에서 발생하는 활성 산소종을 효과적으로 제거할 수 있으며, 따라서 EtOAc, BuOH 분획은 천연 항산화제로서 사용이 가능할 것으로 생각된다.
- 선학초(#)의 용매별 분획에 대한 총페놀함량을 측정한 결과 EtOAc, BuOH 분획에서 39.89%, 39.56%로 가장 높았다(Table 2). 지금까지 보고된 대부분의 천연 항산화제는 주로 식물 유래의 polyphenol 물질들이며 4), EtOAc 분획에 여러가지 생리활성 물질이 존재할 것으로 추측된다.
- 선학초의 전자공여능은 EtOAc 분획에서 30.97% (100 μg/ml), 92.90% (500 gg/ml), 94.47% (1000 gg/ml), BuOH 분획에서 34.02% (100 gg/ml), 93.77% (500 |ig/ml), 92.90% (1000 μg/ml)로 높게 나타났으며 , chloroform, water 분획에서도 대조구인 BHT와 비슷한 수준의 전자공여능을 보였다(Fig. 1). 모든 분획물들이 농도에 비례하여 전자공여 능이 증가하였고, 이는 모든 분획에서 DPPH를 환원시킬 수 물질이 존재하고 있음을 보여 주는 것이며 분획별 총 페놀 함량과도 깊은 상관성이 있는 것으로 생각된다.
- 90% (1000 |ig/ml)로 90% 이 상이었다. 아질산염 소거능도 1000#ml의 농도에서 50% 이상이었으며, XOase 저해활성은 93.06% (EtOAC) 와 91.73% (BuOH)로 높은 활성을 보였다. 암세포 성장 저해 활성을 측정한 결과 hexane 분획에서 가장 높았고 HT-29에 대해 11.
- 73% (BuOH)로 높은 활성을 보였다. 암세포 성장 저해 활성을 측정한 결과 hexane 분획에서 가장 높았고 HT-29에 대해 11.63%-90.07%, SNU・1에 대해 16.84%-95.11%, HeLa에 대해 4.44%-96.40%였다.
- 총 페놀 함량은 EtOAC와 BuOH 분획에서 39.89%, 39.56%로 가장 높았고, 전자공여능 또한 EtOAC 분획에서92.90% (500 μg/ml), 94.47% (1000 μg/ml), BuOH 분획 에서 93.77% (500 |ig/ml), 92.90% (1000 |ig/ml)로 90% 이 상이었다. 아질산염 소거능도 1000#ml의 농도에서 50% 이상이었으며, XOase 저해활성은 93.
- 2와 같다. 총페놀 및 전자공여능이 높게 나타난 EtOAc 분획에서6.19% (100 |ig/ml), 34.26% (500 gg/ml), 58.74% (1000 μg/ml), BuOH 분획 에서 5.65% (100 μg/ml), 29.14% (500 Fig/ml), 55.39% (1000pig/ml)로 대조구인 ascorbic acid보다 높은 소거능을 보였다. 나머지 분획들은 1.
- 최원식 등2D은 옻나무 EtOAc 분획어〕서, 안봉전 둥22) 은배과피의 80% 에탄을 추출물에서 각각 활성 성분을 컬럼크로마토그래피로 분획하고 이들에 대한 총페놀 함량과 XOase 저해활성을 측정한 결과 페놀함량이 높을수록 저해 활성 또한 높다고 보고하였으며, 본 연구에서도 EtOAc 와 BuOH 분획은 모두 총페놀 함량이 가장 높은 분획으로써 페놀함량에 비례하여 XOase 활성을 저해함을 알 수 있었다. 즉 이들 분획들은 유해산소 억제 효과뿐만 아니라 통풍예방에도 효과가 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 결과적으로 EtOAc 분획에 존재하는 성분들은 전자공여 능은 우수하나 암세포의 성장 억제 물질은 거의 존재하지 않으며, BuOH 분획에 존재하는 성분은 전자공여능 뿐만 아니라 암세포의 성장도 어느 정도 저해할 수 있는 물질들인 것으로 추정되어 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각 된다.
- 이상의 결과에서 선학초의 EtOAc, BuOH 분획물은 항산화 활성이 있는 기능성 식품으로의 개발이 가능할 것으로 생각되며, hexane, chloroform 분획은 위암, 대장암과자궁경부암 치료보조제로서의 개발을 위한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.