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문제 정의
- 본 연구에서는 짚신나물 물 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 짚신나물물 추출물은 100, 250, 500, 1,000 ppm 농도에서 tyrosinase 단백질 발현을 대조군에 비해 유의성 있게 억제하였으며, 1,000 ppm 농도에서 현저한 감소를 보였다 (Fig.
- 이에 본 연구에서는 짚신나물 물 추출물이 가지고 있는 항산화력을 통한 산화적 스트레스의 감소와 melanin 합성에 주요한 지표로 작용하는 TRPs로 통칭되는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 억제 활성을 측정하여 미백 기능성을 가지는 천연소재로의 사용 가능성을 알아보았다.
제안 방법
- 10,000 × g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 tyrosinase 활성 측정을 위한 효소원과 단백질 측정을 위한 시료로 사용하였다.
- 10,000 × g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 tyrosinase 활성 측정을 위한 효소원과 단백질 측정을 위한 시료로 사용하였다. Bio-Rad protein kit로 단백질을 정량하였으며, tyrosinase 활성 측정은 10 mM L-DOPA 200㎕와 0.1M PBS (pH 6.8) 500㎕, tyrosinase 효소원 (세포로부터 얻은 상층액) 300㎕를 첨가한 후 35℃에서 1시간 동안 배양한 다음 475㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- DPPH 라디칼 소거작용은 대조구에 대한 시료 첨가구의 흡광도를 비교하여 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도) × 100에 의하여 산출하였다 (Braca et al., 2001).
- Melanin 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase의 억제 활성은 mushroom tyrosinase를 효소원으로 하여 기질인 L-DOPA와의 반응으로 생성된 L-dopaquinone의 흡광도를 측정하였다. 시험관에 0.
- Mouse melanoma B16BL6 세포를 96-well plates에 1 × 106 cells/㎖ 농도로 100㎕ 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 짚신나물 물 추출물을 각 농도별로 제조한 후 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 1% diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 75 : 25로 섞어 만든 75% ethanol를 각 튜브에 1㎖ 씩 분주하여 12,000 × g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. Nuclease free water를 40㎕ 씩 분주하여 녹인 후 RNA 5㎕에 0.1% DEPC를 955㎕ 첨가하여 260㎚에서 흡광도를 측정하였고 total RNA 양을 정량하였다.
- Oligo (dT)15 primer (500㎍/㎖) 1㎕, dNTP mix (10 mM) 1㎕, 추출한 RNA 2㎍와 RNase free water로 11㎕을 맞추고 65℃에서 5분간 반응시킨 후 5배 first-stand 완충 용액 4㎕, nuclease free water 1㎕, DTT (100 mM) 2㎕, SuperScript III reverse transcriptase 1㎕를 섞어 9㎕ 씩 각 PCR tube에 더한 후 42℃에서 50분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실험에 사용한 primer sequence는 Table 1과 같다.
- PCR tube에 Go Tag Green Master 10㎕, forward primer (15 μM)와 reverse primer (15 μM)를 각각 0.5㎕, nuclease free water 8㎕, 합성한 first-stand cDNA 1㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR를 실행하였다.
- Tyrosinase PCR 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 62℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 (21 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle)이었고, GAPDH PCR 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 (21 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle) 이었다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1.2% agarose gel에 100 V에서 30분간 전기영동한 후 자외선 광으로 유전자 발현정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel (Jandel Scientific) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- Tyrosinase의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 RTPCR을 실시하였다. PCR tube에 Go Tag Green Master 10㎕, forward primer (15 μM)와 reverse primer (15 μM)를 각각 0.
- 2% agarose gel에 100 V에서 30분간 전기영동한 후 자외선 광으로 유전자 발현정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel (Jandel Scientific) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- 3% 세포 생존율로 낮게 나타내었다. 그러므로 짚신나물 물 추출물의 tyrosinase 활성 및 TRP-1, TRP-2 mRNA 발현에 대한 실험에서는 100, 250, 500, 1000 ppm 농도 범위에서 진행하였다.
- 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase의 활성 억제 작용은 버섯 tyrosinase를 효소원으로 하여 기질인 LDOPA와의 반응으로 생성된 L-dopaquinone의 흡광도를 측정하였다. In vitro 버섯 tyrosinase 억제 효능의 측정 결과, Fig.
- 시료를 처리한 배지를 제거한 뒤 phosphate-buffer saline (PBS, pH 6.8)로 세척하였고, 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 wells에 첨가한 뒤 cell scraper로 wells에 부착되어 있는 세포를 부유시켜 1.5 튜브에 모아 −70℃에서 급속 냉동시킨 후 해동시켰으며, 이와 같은 방법을 3번 반복하여 세포막을 파괴하였다.
- 7배의 증류수를 가하여 60℃에서 24시간 동안 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 이를 실온에서 방냉한 뒤 감압 농축기 (EYELA SB-1000, Japan)로 농축하였고, 동결건조기 (IlShin FD 8508, Korea)를 이용하여 건조 하였다. 건조 시료의 수득율은 17.
- 짚신나물 물 추출물과 에탄올에 1.5 × 10−4M DPPH를 녹여 여과한 용액을 1 : 3 비율로 혼합한 뒤 37℃에서 30분간 방치한 후 532㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 짚신나물 물 추출물에 대하여 B-16 melanoma를 이용하여 미백효과를 측정하였다. 세포를 24-well plates에 1 × 105 cells/㎖로 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였고, FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 짚신나물 물 추출물을 각 농도별로 처리하여 24시간 동안 더 배양하였다.
- 짚신나물 물 추출물을 농도별로 희석한 후 각 추출물 100㎕, 100 mM sodium phosphate (pH 7.4) 250㎕, 1 mM EDTA 100㎕, 36 mM deoxyribose 100㎕, 1 mM FeCl3·6H2O 100㎕, 1 mM L-ascorbic acid 100㎕, 10 mM H2O2 100㎕, 증류수 150㎕를 첨가하여 38℃ water bath에서 1시간 방치한 후 1% thiobarbituric acid 1㎖, 10% trichloroacetic acid 1㎖를 첨가하여 100℃에서 10분간 끓인 후 532㎚에서 흡광도를 측정하였으며, (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도) × 100에 의하여 산출하였다.
- 짚신나물 물 추출물이 mouse melanoma B16BL6 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시료를 다양한 농도로 처리하고 배양한 후에 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. Fig.
대상 데이터
- Mouse B16BL6 melanoma 세포주는 한국 세포주은행에서 분양받아 사용하였다. B16BL6 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% 항생제가 첨가된 minimum essential medium (MEM) 배지에서 37℃로 유지되는 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 짚신나물은 경상북도 영천시에서 재배한 전초를 2010년 9월 춘천시 소재의 약재상에서 건시료로 구입하여 냉장보관 하면서 사용하였다. 시료의 추출은 조 등 (2008)의 방법에 따라 수세한 후 10.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 GraphPad InStat (GraphPad InStat Version 3.00, 2003) 통계 package를 이용하여 평균 ±표준편차로 표시하였고, 대조군과 처리군 간의 평균차의 통계적 유의성을 Tukey-Kramer multiple comparisons test에 의해 검정하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거작용은 Blois (1958)의 방법에 따라 각 시료의 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 환원력을 측정하였다. 짚신나물 물 추출물과 에탄올에 1.
- Hydroxy 라디칼 소거활성은 정 등 (2008)의 방법을 이용하여 측정하였다. 짚신나물 물 추출물을 농도별로 희석한 후 각 추출물 100㎕, 100 mM sodium phosphate (pH 7.
- 배양이 끝난 세포의 생존율은 정 등 (2005)이 사용한 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. Mouse melanoma B16BL6 세포를 96-well plates에 1 × 106 cells/㎖ 농도로 100㎕ 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 짚신나물 물 추출물을 각 농도별로 제조한 후 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 실험에 사용한 짚신나물은 경상북도 영천시에서 재배한 전초를 2010년 9월 춘천시 소재의 약재상에서 건시료로 구입하여 냉장보관 하면서 사용하였다. 시료의 추출은 조 등 (2008)의 방법에 따라 수세한 후 10.7배의 증류수를 가하여 60℃에서 24시간 동안 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 이를 실온에서 방냉한 뒤 감압 농축기 (EYELA SB-1000, Japan)로 농축하였고, 동결건조기 (IlShin FD 8508, Korea)를 이용하여 건조 하였다.
성능/효과
- 이온의 존재 하에서 생성되며 가장 독성이 강한 free radical이다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 짚신나물 물 추출물의 hydroxy 라디칼 소거 활성은 50, 100, 250, 500, 1000 ppm의 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 34% 이상의 소거능을 보였고 특히 1000 ppm의 농도에서 42.5%로 가장 높은 소거 활성을 보였다.
- 짚신나물 물 추출물이 mouse melanoma B16BL6 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시료를 다양한 농도로 처리하고 배양한 후에 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. Fig. 3과 같이 B16BL6 세포에 대하여 짚신나물 물 추출물을 100, 250, 500, 1000, 3000 ppm의 농도로 처리하였을 때 100 ppm 부터 1,000 ppm 농도까지 87% 이상의 B16BL6 세포의 생존율을 유지하였으며, 250 ppm 이하의 농도에서 100%의 이상의 생존율을 나타내었다. 한편 짚신나물물 추출물의 3,000 ppm 농도에서는 66.
- 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase의 활성 억제 작용은 버섯 tyrosinase를 효소원으로 하여 기질인 LDOPA와의 반응으로 생성된 L-dopaquinone의 흡광도를 측정하였다. In vitro 버섯 tyrosinase 억제 효능의 측정 결과, Fig. 4와 같이 짚신나물 물 추출물을 100, 250, 500 ppm 농도에서 각각 93.4%, 93.4%, 93.0%,로 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 1,000 ppm에서는 80.
- 5㎕, nuclease free water 8㎕, 합성한 first-stand cDNA 1㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR를 실행하였다. Tyrosinase PCR 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 62℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 (21 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle)이었고, GAPDH PCR 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 (21 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle) 이었다. PCR 산물은 0.
- 본 연구 결과 짚신나물 물 추출물은 멜라닌 형성에 관여하는 tyrosinase의 효소활성을 cell free system에서는 크게 감소시키지 못하였으나 세포내 효소활성은 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰고 또한 tyrosinase의 유전자 발현을 억제함으로써 미백 작용을 하는 것으로 나타났다. 그러므로 앞으로 상기에 타 논문에서 사용되었던 미백 효과에 작용하는 microphthalmia transcription factor (MITF), protein kinase A, α-MSH과 같은 유전자 발현에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 1과 같다. 짚신나물 물 추출물을 50, 100, 250, 500, 1000 ppm의 농도로 처리했을 때 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 유의적으로 증가되었으며, 500 ppm과 1000 ppm 농도에서 각각 85.6, 85.4%로 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다.
- 5와 같다. 짚신나물 물 추출물을 각 농도별로 (100, 250, 500, 1000 ppm) 처리했을 때 각각 99.72%, 91.73%, 84.57%, 78.51%로 농도 의존적으로 유의하게 세포내 tyrosinase 활성 억제효과를 나타내었다.
- 본 연구에서는 짚신나물 물 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 짚신나물물 추출물은 100, 250, 500, 1,000 ppm 농도에서 tyrosinase 단백질 발현을 대조군에 비해 유의성 있게 억제하였으며, 1,000 ppm 농도에서 현저한 감소를 보였다 (Fig. 6). 그러나 짚신나물 물 추출물은 TRP-1과 TRP-2 mRNA 발현은 대조군에 비하여 유의적인 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 그러므로 앞으로 상기에 타 논문에서 사용되었던 미백 효과에 작용하는 microphthalmia transcription factor (MITF), protein kinase A, α-MSH과 같은 유전자 발현에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 이 과정에서 중요하게 작용하는 효소가 tyrosinase 이며, tyrosinase 효소의 억제는 멜라닌 생합성을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 짚신나물 물 추출물은 tyrosinase 활성을 억제시킴으로서 피부 색소 침착 등을 방어할 수 있는 미백 기능성 화장품의 소재로 이용 가능할 것이라 사료된다.
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