[국내논문]근적외선 분광분석법을 이용한 벼 유전자원의 아밀로스 함량과 단백질 함량 정량분석 Quantitative Analysis of Amylose and Protein Content of Rice Germplasm in RDA-Genebank by Near Infrared Reflectance Spectroscopy원문보기
본 시험은 종자은행이 보유하고 있는 다양한 벼 유전자원의 활용을 촉진하기 위하여 비파괴적인 분석방법의 하나인 근적외선 분광분석법을 이용한 유용유전자원의 대량 선발체계 구축을 위해 실시하였다. 1. NIR스펙트럼은 700 nm 이하의 가시광선 범위에서 다양한 범위의 spectrum을 보였으며, 700 nm에서 2500 nm의 근적외선 파장에서도 spectrum의 차이가 크게 나타났고, 1400 nm에서 전체 spectrum의 정점을 나타냈으며 그 이상의 spectrum에서는 포화현상을 나타내었다. 2. NIR 검량식 작성에 이용된 144점의 선발자원이 가지는 단백질함량의 범위는 $6.5{\sim}9.5%$였으며, 134점의 선발자원이 가지는 아밀로스함량의 범위는 $18.1{\sim}21.7%$이었다. 3. 단백질함량과 아밀로스함량의 실험치(Lab data)와 NIR 데이터의 모집단 분포의 해석과 상관관계에 관한 통계분석 결과, 단백질함량과 아밀로스함량의 $R^2$(RSQ) 값은 각각 0.786과 0.865로 높게 보였으며, 검량식 표준오차(SEC)는 각각 0.442와 2.078로 유의한 값을 보였고, 또한 검량식 검정 표준오차(SECV)도 각각 0.541과 3.106으로 유의한 값을 보였지만 검증시 상관정도(1-VR)는 0.68과 0.70로 검량식 작성시보다 낮은 유의성을 보였다.
본 시험은 종자은행이 보유하고 있는 다양한 벼 유전자원의 활용을 촉진하기 위하여 비파괴적인 분석방법의 하나인 근적외선 분광분석법을 이용한 유용유전자원의 대량 선발체계 구축을 위해 실시하였다. 1. NIR스펙트럼은 700 nm 이하의 가시광선 범위에서 다양한 범위의 spectrum을 보였으며, 700 nm에서 2500 nm의 근적외선 파장에서도 spectrum의 차이가 크게 나타났고, 1400 nm에서 전체 spectrum의 정점을 나타냈으며 그 이상의 spectrum에서는 포화현상을 나타내었다. 2. NIR 검량식 작성에 이용된 144점의 선발자원이 가지는 단백질함량의 범위는 $6.5{\sim}9.5%$였으며, 134점의 선발자원이 가지는 아밀로스함량의 범위는 $18.1{\sim}21.7%$이었다. 3. 단백질함량과 아밀로스함량의 실험치(Lab data)와 NIR 데이터의 모집단 분포의 해석과 상관관계에 관한 통계분석 결과, 단백질함량과 아밀로스함량의 $R^2$(RSQ) 값은 각각 0.786과 0.865로 높게 보였으며, 검량식 표준오차(SEC)는 각각 0.442와 2.078로 유의한 값을 보였고, 또한 검량식 검정 표준오차(SECV)도 각각 0.541과 3.106으로 유의한 값을 보였지만 검증시 상관정도(1-VR)는 0.68과 0.70로 검량식 작성시보다 낮은 유의성을 보였다.
Amylose and protein contents are important traits determining the edible quality of rice, especially in East Asian countries. Near-Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) has become a powerful tool for rapid and nondestructive quantification of natural compounds in agricultural products. To test th...
Amylose and protein contents are important traits determining the edible quality of rice, especially in East Asian countries. Near-Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) has become a powerful tool for rapid and nondestructive quantification of natural compounds in agricultural products. To test the practically of using NIRS for estimation of brown rice amylose and protein contents, the spectral reflectances ($400{\sim}2500\;nm$) of total 9,483 accessions of rice germplasm in Rural development Administration (RDA) Genebank ere obtained and compared to chemically determined amylose and protein content. The protein content of tested 119 accessions ranged from 6.5 to 8.0% and 25 accessions exhibited protein contents between 8.5 to 9.5%. In case of amylose content, all tested accessions ranged from 18.1 to 21.7% and the grade from 18.1 to 19.9% includes most number of accessions as 152 and 4 accessions exhibited amylose content between 20.5 to 21.7%. The optimal performance calibration model could be obtained from original spectra of brown rice using MPLS (Modified Partial Least Squares) with the correlation coefficients ($r_2$) for amylose and protein content were 0.865 and 0.786, respectively. The standard errors of calibration (SEC) exhibited good statistic values: 2.078 and 0.442 for amylose and protein contents, respectively. All these results suggest that NIR spectroscopy may serve as reputable and rapid method for quantification of brown rice protein and amylose contents in large numbers of rice germplasm.
Amylose and protein contents are important traits determining the edible quality of rice, especially in East Asian countries. Near-Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) has become a powerful tool for rapid and nondestructive quantification of natural compounds in agricultural products. To test the practically of using NIRS for estimation of brown rice amylose and protein contents, the spectral reflectances ($400{\sim}2500\;nm$) of total 9,483 accessions of rice germplasm in Rural development Administration (RDA) Genebank ere obtained and compared to chemically determined amylose and protein content. The protein content of tested 119 accessions ranged from 6.5 to 8.0% and 25 accessions exhibited protein contents between 8.5 to 9.5%. In case of amylose content, all tested accessions ranged from 18.1 to 21.7% and the grade from 18.1 to 19.9% includes most number of accessions as 152 and 4 accessions exhibited amylose content between 20.5 to 21.7%. The optimal performance calibration model could be obtained from original spectra of brown rice using MPLS (Modified Partial Least Squares) with the correlation coefficients ($r_2$) for amylose and protein content were 0.865 and 0.786, respectively. The standard errors of calibration (SEC) exhibited good statistic values: 2.078 and 0.442 for amylose and protein contents, respectively. All these results suggest that NIR spectroscopy may serve as reputable and rapid method for quantification of brown rice protein and amylose contents in large numbers of rice germplasm.
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문제 정의
따라서 본 시험은 농촌진흥청 국립농업유전자은행에 보존되고 있는 다양한 벼 유전자원의 활용을 촉진하기 위하여 유전자원에 대한 신속한 평가 및 선발체계를 구축하고자 근적외선 분광분석법을 이용하여 현미로부터 spectrum을 획득 후, 아밀로스 함량과 단백질함량의 측정을 위한 검령식 작성을 실시하였다.
본 시험은 종자은행이 보유하고 있는 다양한 벼 유전자원의 활용을 촉진하기 위하여 비파괴적인 분석방법의 하나인근적외선 분광분석법을 이용한 유용유전자원의 대량 선발 체계 구죽을 위해 실시하였다.
제안 방법
156 자원에 대한 이화학적 특성분석을 통한 검량식 작성을 위해 10g씩 실험실용 현미기(쌍용, SY88-TH)로 탈영시 켜서 사미, 피해립 등을 제거한 후, 현미상태로 NIR 스펙트 럼을 작성 후, 동일한 샘플을 이화학 분석에 이용하였다. 이 화학적 특성 분석용 샘플은 현미를 분쇄기로 90초간 분쇄 하여 100 Mesh의 채로 처서 균일한 현미가루를 이용하였으며, 아밀로스함량 및 단백질함량은 농촌진흥청 쌀 품질 및 식미평가서에 의거하여 조사하였다.
근적외선 분광분석기는 Foss NIRsystems사의 NIRsystem 6500(USA)을 사용하였으며 측정 조건은 Table 1과 같다.
다음은 spectruiml을 4가지 수처리방가컵(Wth treatment method; 1, 4, 4, 1(1 st derivative, 4 nm gap, 4 point smooth, and 1 point second smooth))으로 수처리된 spectrume 회귀분석을 통해 검량식을 작성하였다. 회귀분석은 Step-up, Step-wise, 그리고 검량식 작성과 동시에 교차검증(cross validation)을 통하여 미지의 샘플에 대한 검증결과를 얻을 수 있는 Modified parti이 least squares(MPLS)법을 사용하여 검량식을 산출하였다.
분양받은 9,483 자원의 현미에 대한 NIR을 이용한 근적외선 스펙트럼을 측정하기 위해 하프컵에 현미를 채운 후 실온에서 400-2500 nm의 파장영역에서 4 nm간격으로 scanning 한 후 얻은 원시 spectrum을 standard normal variance와 detrend로 입도 차이에서 오는 산란을 보정 하였다.
시료 500 mg을 500 ml Kjeldahl 분해병 에 넣고 진한 황산(H2SO4) 20 ml을 가한 후 분해촉매제(Kjeltabs) 1 g을 넣고 400C에서 2시간 동안 분해하였다. 실온에서 냉각 후 가스를 방출시키고 증류수를 300 ml 가하면서 분해병의 내벽을 세척하고 45% NaOH 50 ml을 가하여 용액을 알칼리화 하여 Kjeldahl 증류장치로 75 ml까지 증류한 후, 2% 붕산용액(H3BO4) 10 ml을 가하여 0.1 N H2SO4 표준용액으로 자동분석장치(FOSS, Kjeltec 2400)를 이용하여 질소함량(N)을 분석 후, 질소보정계수를 Nx5.95(%)로 하여 단백질함량으로 환산하였다.
원시 spectrum을 파일로 작성한 후 각 spectrum을 영역별 중첩에서 생기는 noise와 bias를 최소화하기 위해 1차미분(1st derivative)으로 spectrum을 가공하여 데이터 분석 및 아밀 로스와 단백질에 대한 검량식을 작성하고 이를 9,483 자원 의 현미에 적용하여 시료의 가상적인 아밀로스와 단백질 함량을 얻었다.
156 자원에 대한 이화학적 특성분석을 통한 검량식 작성을 위해 10g씩 실험실용 현미기(쌍용, SY88-TH)로 탈영시 켜서 사미, 피해립 등을 제거한 후, 현미상태로 NIR 스펙트 럼을 작성 후, 동일한 샘플을 이화학 분석에 이용하였다. 이 화학적 특성 분석용 샘플은 현미를 분쇄기로 90초간 분쇄 하여 100 Mesh의 채로 처서 균일한 현미가루를 이용하였으며, 아밀로스함량 및 단백질함량은 농촌진흥청 쌀 품질 및 식미평가서에 의거하여 조사하였다.
대상 데이터
1차미분한 spectrum을 대상으로 WINISI II software(Ver 1.50)의 Score center-select 기능을 이용하여 주성분분석(Prin· cipal component analysis)을 수행한 후 center sample로부 터의 각 시료간 거리(mehalanobis distance)를 구해 중복되는 샘플들을 순차적으로 제거하여 검량식에 사용한 156 자 원의 sample spectrum으로부터 공간적 분포가 비교적 고르게 분포하도록 단백질 함량의 경우 144자원(Fig. 3, A)으로 아밀로스 함량의 경우 134자원(Fig. 3, B)으로 선발하여 검량식 작성에 사용하였다.
본 실험에 사용한 벼 유전자원은 원산지를 바탕으로 선발 한 156 자원이다.
본 연구는 농촌진흥청 농업생명공학연구원의 2007년도 일몰형과제로 수행하였다.
데이터처리
단백질함량(Fig. 4, B)과 아밀로스함량(Fig. 4, D)의 실험 치(Lab data)와 N1R 데이터의 통계적인 모집단 분포의해 석과 그 상관관계에 관한 통계분석은 WINISI II software (Ver 1.50)를 사용하여, Step-up, Step-wise, 그리고 검량식작성과 동시에 교차검증(cross validation)을 통하여 미지의 샘플에 대한 검증결과를 얻을 수 있는 Modified partial least squares(MPLS)법에 의한 회귀분석 결과는 Table 2와 같았다.
실험치(Lab data)와NIR 데이터의 통계적인 모집단 분포의 해석과 그 상관관계에 관한 통계분석은 WINISI II software (Ver 1.50)를 사용하여 RSQ(R2; squared coefficient of multiple detemehation in calibration), SEC(standard error of calibration), 그리고 SEP(standard error of prediction) 값을 분석하였다.
다음은 spectruiml을 4가지 수처리방가컵(Wth treatment method; 1, 4, 4, 1(1 st derivative, 4 nm gap, 4 point smooth, and 1 point second smooth))으로 수처리된 spectrume 회귀분석을 통해 검량식을 작성하였다. 회귀분석은 Step-up, Step-wise, 그리고 검량식 작성과 동시에 교차검증(cross validation)을 통하여 미지의 샘플에 대한 검증결과를 얻을 수 있는 Modified parti이 least squares(MPLS)법을 사용하여 검량식을 산출하였다.
이론/모형
단백질함량은 micro Kjeldahl 질소정량법(Juliano, 1985)을 이용하여 다음과 같이 구하였다. 시료 500 mg을 500 ml Kjeldahl 분해병 에 넣고 진한 황산(H2SO4) 20 ml을 가한 후 분해촉매제(Kjeltabs) 1 g을 넣고 400C에서 2시간 동안 분해하였다.
아밀로스함량 분석은 Juliano(1971)의 비색 정량법에 따라 100 mg의 현미가루에 95% ethanol 1 ml와 1 N NaOH 9 ml 를 가해 진탕항온수조에 10분간 호화시킨 후 20℃ 증류수로 100 ml을 채운 다음, 그 중 5 ml를 취해 1 N CH3COOH (acetic acid) 1 ml와 2% I2-KI (Iodine solution) 2 ml를 가 해 증류수로 100 ml까지 채우고 30℃ 에서 20분간 발색 반 응시켜 620 nm의 파장에서 UV/Vis분광광도계(Shimadzu, UV-2450)로 측정하였다.
성능/효과
1. NIR스펙트럼은 700 nm 이하의 가시광선 범위에서 다양한 범위의 spectnim을 보였으며, 700 nm에서 2500 nm의 근적외선 파장에서도 spectrum의 차이가 크게 나타났고, 1400 nm에서 전체 spectrum의 정점을 나타냈으며 그 이상의 spectrum에서는 포화현상을 나타내었다
2. NIR 검량식 작성에 이용된 144점의 선발자원이 가지는 단백질함량의 범위는 6.5~9.5%였으며, 134점의 선발자 원이 가지는 아밀로스함량의 범위는 18.1 ~21.7%이었다.
3. 단백질함량과 아밀로스함량의 실험치(Lab data)와 NIR 데이터의 모집단 분포의 해석과 상관관계에 관한 통계분석 결과, 단백질함량과 아밀로스함량의 R2(RSQ) 값은 각각 0.786 과 0.865로 높게 보였으며, 검량식 표준오차(SEC)는 각각 0.442와 2.078로 유의한 값을 보였고, 또한 검량식 검정 표 준오차(SECV)도 각각 0.541과 3.106으로 유의한 값을 보였지만 검증시 상관정도(1·VR)는 0.68과 0.70로 검량식 작성시보다 낮은 유의성을 보였다
865로 양호한 검량식을 나타내었다. 검량식으로부터 얻은 단백질함량과 아밀로스함량은 각각 8.39(%)와 22.5(%)였으며 검량식을 구할 때 발생한 단백질 함량과 아밀로스함량의 검량식 표준오차(SEC)는 각각 0.442 과 2.078로 매우 유의한 값을 나타내었다. 또한 작성된 검 량식의 정확도를 검증(validation)하기 위하여 cross validation 한 결과 검량식 검정 표준오차(SECV)는 단백질 함량이 0.
078로 매우 유의한 값을 나타내었다. 또한 작성된 검 량식의 정확도를 검증(validation)하기 위하여 cross validation 한 결과 검량식 검정 표준오차(SECV)는 단백질 함량이 0.541 이며 아밀로스 함량은 3.106으로 매우 유의한 값을 나타내 었고 검증시 상관정도(LVR)는 단백질 함량이 0.68이며 아 밀로스 함량이 0.70으로 검량식 작성시보다 다소 낮은 경향을 보였으나 현미의 단백질함량과 아밀로스함량을 근적외 선분광분석기로 손쉽게 분석할 수 있는 가능성을 제시할 수 있었다. 이러한 결과는 Song et al.
700 nm에서 2500 nm 사이의 근적외선 범위에서는 특정 파장대별로 큰 흡광도 차이를 나타내었다. 특정 파장 중, 1400 nm를 정점으로 가시광선범위 쪽으로 갈수록 흡광도 의 중첩 현상이 보였고, 1450 nm이상의 범위에서는 spectrum이 포화되는 현상이 나타났다. 이는 근적외선 범위가 일반 화학성분의 변위보다도 입도 및 물성의 변위에 기인하는 기준선의 변동이 심하고 흡광도가 커질수록 다중산란현 상에 의해 흡광도가 증가하기 때문인 것으로 벼(Moon et al, 1994; Song et al.
후속연구
다만 검량식 검증시 상관계수가 다소 낮아 범용적인 검량식으로 사용하기엔 다소 보안이 필요하지만 이러한 원인으로 현미 자체를 이용하여 근적외선스펙트럼을 획득하였기 때문에 벼 품종별 입도 및 샘플 충진 밀도 등의 차이로부터 기인된 근적외선 흡광장치의 차이에서 오는 영향과 검량식 작성에 사용된 샘플이 가지는 변이인자 등에 의한 영향이므로 향후 상호 상관성을 높일 수 있도록 실험 보완하면 근적 외선스펙트럼을 이용하여 벼와 같은 대량의 유전자원을 화학적 특성을 평가하는데 충분히 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
, 2006)의 분석 결과에서도 이와 유사한 결과를 보고한 바 있다. 따라서 근적외선 분관분석기를 이용한 현미의 아밀로스함량 및 단백질 함량에 대한 검량식 작성에 사용될 샘플집단으로 무리가 없을 것으로 사료된다.
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