[논문]현초 추출물의 항산화 활성 및 항노화에 관한 연구

이근하; 박수남

현초 추출물의 항산화 활성 및 항노화에 관한 연구
Antioxidative Activities and Antiaging Effects of Geranium nepalense Extracts 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.34 no.1, 2008년, pp.25 - 35

이근하 (서울산업대학교 정밀화학과) , 박수남 (서울산업대학교 정밀화학과)

초록
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본 연구에서는 현초 추출물의 항산화, 성분 분석 및 elastase와 tyrosinase 저해효과에 관한 실험을 수행하였다. Free radical(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 50% 에탄올 추출물(15.0 ${\mu}g/mL$)${\mu}g/mL$)<당을 제거시킨 플라보노이드 aglycone 분획(0.9 ${\mu}g/mL$) 순으로 증가하였다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용하여 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 현초 추출물의 총항산화능은 50% 에탄올 추출물($OSC_{50},\;0.23{\mu}g/mL$) ${\mu}g/mL$)${\mu}g/mL$)순으로, aglycone 추출물에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 현초 추출물에 대하여 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였다. 현초 추출물의 경우 농도 의존적($1{\sim}50{\mu}g/mL$)으로 광용혈을 억제하였다. 특히 당을 제거시킨 플라보노이드 aglycone 분획에서 50 ${\mu}g/mL$ 농도에서 ${\tau}_{50}$이 676.7 min으로 매우 큰 세포보호 효과를 나타내었다. Aglycone 분획은 tyrosinase와 elastase 저해활성($IC_{50}$)이 각각 70.0, 19.9 {\mu}g/mL로 매우 큰 활성을 나타내었다. 현초 추출물 중 ethylacetate 분획의 당 제거 반응 후 얻어진 aglycone 분획은 TLC에서 2개의 띠로 분리되었으며 HPLC 실험(370 nm)에서도 2개의 피이크로 분리되었다. 분리된 2가지 성분은 quercetin, kaempferol이었으며, 그들의 성분비는 각각 15.3%, 82.8%로 kaempferol의 함량이 가장 큰 것으로 나타났다. 이상의 결과들은 현초 추출물이 $^1O_2$ 혹은 다른 ROS를 소광시키거나 소거함으로써 그리고 ROS에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 노출된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리키며, 현초 성분에 대한 분석과 ethylactate분획의 당 제거 실험 후 얻어진 aglycone 분획의 큰 elastase 저해활성으로부터 주름개선 기능성 화장품원료로서도 응용 가능성이 있음을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the antioxidative effects and inhibitory effects on elastase and tyrosinase of Geranium nepalense extracts were investigated. The free radical(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activities ($FSC_{50}$) of extract/fractions of Geranium nepalense were in the order: 50% ethanol extract(15.0 ${\mu}g/mL$)${\mu}g/mL$). ${\mu}g/mL$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities($OSC_{50}$) of some Geranium nepalense extracts on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were investigated using the luminol-dependent chemiluminescense assay. The order of ROS scavenging activities were 50% ethanol extract($OSC_{50},\;0.23{\mu}g/mL$)${\mu}g/mL$)${\mu}g/mL$). Deglycosylated flavonoid fraction showed the most prominent scavenging activity. The protective effects of extract/fractions of Geranium nepalense on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The Geranium nepalense extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner, particularly deglycosylated flavonoid fraction exhibited the most prominent celluar protective effect (${\tau}_{50}$, 676.7 min at 50 ${\mu}g/mL$). The inhibitory effect of aglycone fraction on tyrosinase($IC_{50}$, 70.0 ${\mu}g/mL$) and elastase ($IC_{50}$, 19.9 ${\mu}g/mL$) was very high. Aglycone fractions obtained from the deglycosylation reaction of ethyl-acetate fraction among the Geranium nepalense extracts, showed 2 bands in TLC and 2 peaks in HPLC experiments (370 nm). Two components were identified as quercetin(composition ratio, 15.3%), kaempferol(82.8%). These results indicate that extract/fractions of Geranium nepalense can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. And component analysis of Geranium nepalense extract and inhibitory activity on elastase of the aglycone fraction could be applicable to new functional cosmetics for smoothing wrinkles.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한 현초 추출물을 이용한 화장품에서의 항노화 기능성 소재로서 가능성에 관한 연구 역시 되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 화장품 원료로서 사용 가능한 현초 추출물(혹은 분획)을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 ¹O₂으로 유도된 세포 손상에 대한 보호활성, 총 항산화능, 이들 추출물(혹은 분획)의 성분 분석, 그리고 미백 및 피부 주름 생성에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase, elastase 활성 저해 효과를 알아보고자 하였다. 또한 몇 가지 다른 항산화제들을 대조군으로 하여 현초의 항산화능을 비교 평가하고 활성산소에 의한 피부 노화를 방지하는데 효과가 있는 기능성 화장품 소재로서 가능성이 있는지를 검토하였다.
따라서 본 연구에서는 화장품 원료로서 사용 가능한 현초 추출물(혹은 분획)을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 ¹O₂으로 유도된 세포 손상에 대한 보호활성, 총 항산화능, 이들 추출물(혹은 분획)의 성분 분석, 그리고 미백 및 피부 주름 생성에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase, elastase 활성 저해 효과를 알아보고자 하였다. 또한 몇 가지 다른 항산화제들을 대조군으로 하여 현초의 항산화능을 비교 평가하고 활성산소에 의한 피부 노화를 방지하는데 효과가 있는 기능성 화장품 소재로서 가능성이 있는지를 검토하였다.

제안 방법

HPLC 분석은 2 % acetic acid 수용액과 0.5 % acetic acid를 함유한 50 % acetonitrile 수용액을 기울기 용리법으로 분리하였고, 이때 HPLC 분리조건은 Table 1에 나타내었다.
1 mL tyrosinase 용액(1,250 units/mL)을 반응혼합물에 가하고 37 ℃에서 10 min 동안 항온배양한 다음, 반응혼합물을 얼음수조에서 넣어 반응을 종결시키고, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase를 첨가하지 않은 것을 공시험(blank)으로 하여 효소활성 저해를 계산하였다. 활성의 크기는 0.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post- incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
대조군(control)은 시료대신 시료용액으로 사용된 용매를 100 µL 첨가하였다.
대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3⋅6H2O을 첨가하지 않은 것으로 하였다.
TLC 분석에서 전개용매는 benzene : pyridine : formic acid = 72 : 18 : 10 (v/v)를 사용하였다. 성분확인은 이미 보고된 분광학적 자료, 플라보노이드 표준물질의 R_f치와 발색을 이용한 분리된 띠의 색상 등으로 확인하였다.
현초 추출물에 대한 free radical 소거활성 측정은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용하였다. 실험방법은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다, 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군 (experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 소거활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
추출물을 농도별로 각각 50 µL씩 첨가하였다.
현초 추출물 중 ethylacetate 분획으로부터 aglycone 분획을 얻어 100 % 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Millopore 0.45 µm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC분석을 위한 시료로 이용하였다.
현초 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H₂O₂와 FeCl₃⋅6H₂O을 첨가하지 않은 것으로 하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험전에 보정하여 채널간의 차이가 거의 없도록 하였다. 화학 발광 측정 저해율을 다음 식과 같이 나타내었고, 활성산소 소거활성의 크기는 화학발광의 세기가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, OSC₅₀, µg/mL)로서 표기하였다.

대상 데이터

(+)-α-Tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, EDTA, luminol, heparin, 증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.
Ethylacetate 분획으로부터 aglycone 제조 : ethylacetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 만들고 이를 실험에 사용하였다. 실험 방법은 ethylacetate 가용분 일정량에 H₂SO₄ 및 acetone 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류⋅냉각시킨다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, HPLC는 Dionex (Germany)사, pH meter는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
기질로 사용된 L-tyrosine, N-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide, 효소로 사용된 tyrosinase (from Mushroom, Sigma, 50,000 units, 12.7 mg solid, 3,960 units/mg solid), elastase (0.35 mg protein/mL, 7.8 units/mg protein)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. Flavonoid의 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60 F₂₅₄(0.
기타 FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
본 실험에서 사용한 Fe3+-EDTA/H2O2계는 각종 ROS (reactive oxygen species, O2⋅- , ⋅OH 그리고 H2O2)를 생성시킨다.
Ethylactate 분획은 플라보노이드를 많이 함유하고 있으며, aglycone 분획에는 ethylacetate 분획 플라보노이드에서 당을 제거한 플라보노이드가 존재 한다. 본 연구에서는 50 % 에탄올 추출물, ethylacetate 분획, aglycone 분획을 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
2 mm)로 Merck (USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용한 현초 재료는 2006년 9월 국내 약초시장에서 건조시킨 것을 구입하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4⋅12H2O, NaH2PO4⋅2H2O, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Trizma base, HCl 그리고 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트 (EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm에서 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.
Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 min 까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 4회 반복하여 평균하였다.

이론/모형

Free radical은 노화, 특히 피부노화의 원인 물질로 간주되고 있다. 현초 추출물에 대한 free radical 소거활성 측정은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용하였다. 실험방법은 메탄올에 용해시킨 0.

성능/효과

1) 현초 추출물의 수득율의 경우 50 % 에탄올 추출물은 12.50 %, ethylacetate 분획의 경우 1.60 %이였다. Ethylacetate 분획을 산 가수분해시켜서 당을 제거한 aglycone의 수득률은 0.
2) 현초 추출물의 free radical 소거능력(FSC50)은 50% 에탄올 추출물 15.0 µg/mL, ethylacetate 분획 4.5µg/mL, ethylacetate 분획에서 당 제거시킨 aglycone은 0.9 µg/mL로 나타났다.
3) 현초 추출물의 활성산소 소거활성(OSC50)은 50 %에탄올 추출물 0.23 µg/mL, ethylacetate 분획, 0.16 µg/ mL, ethylacetate 분획에서 당 제거한 aglycone 추출물은 0.04 µg/mL로 aglycone 추출물이 가장 큰 활성을 나타냈다.
4) 1O2으로 유도된 적혈구의 광용혈 현상에 있어서, 현초 추출물은 µg/mL의 농도 범위(1 ∼ 100 µg/mL)에서 농도-의존적으로 1O2으로 유도된 용혈을 억제하였다.
5) 현초 추출물 중 aglycone 분획은 tyrosinase와 elastase 저해활성(IC50)이 각각 70.0, 19.9 µg/mL로 매우 큰 활성을 나타내었다.
6) 현초 추출물 중 ethylacetate 분획에 대하여 당제거 실험 후 얻어진 aglycone 분획의 TLC는 2개의 띠(GNA1 ∼ GNA2)를 나타내었고, 이 때 GNA1, GNA2는 각각 kaempferol, quercetin로 확인하였다.
7) Aglycone 분획에 대한 HPLC 크로마토그램은 2개의 피이크를 나타냈고, 그 용리 순서는 quercetin, kaempferol이었으며, 조성비는 quercetin 15.3 %, kaempferol 82.8 %로 kaempferol의 함량이 가장 큰 것으로 나타났다.
50 %였다. Ethylacetate 분획은 50 % 에탄올로 추출한 것을 1차 hexane으로 비극성 물질을 제거한 뒤 ethylacetate 분획을 추출하여 감압ㆍ농축하였고 수득율이 약 1.60 %이었으며, ethylacetate 분획을 산 가수분해시켜서 당을 제거한 aglycone의 수득률은 0.16 %였다. Ethylactate 분획은 플라보노이드를 많이 함유하고 있으며, aglycone 분획에는 ethylacetate 분획 플라보노이드에서 당을 제거한 플라보노이드가 존재 한다.
대조군(control)은 τ50이 32 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
1 µg/mL이었다. 따라서 현초 추출물의 당이 제거된 aglycone 분획은 tyrosinase 저해 활성이 arbutin에 비해 매우 큼을 알 수 있다. 당이 제거된 추출물 분획은 피부 침투도 용이할 것으로 미루어 볼 때 이를 화장품에 응용할 경우 미백효과가 있을 것으로 사료된다(Table 5, Figure 5).
비교물질에서와 같이 주성분들이 플라보노이드 배당체인 현초 ethylacetate 분획의 세포보호 효과는 10 µg/mL에서 40.5 min이고, 당이 제거된 분획(aglycone)은 동일 농도에서 159.3 min으로 플라보노이드 aglycone이 세포막으로의 침투가 용이해 세포보호 효과가 큼을 보여주고 있다.
이 aglycone 분획은 2개의 띠(GNA1 ∼ GNA2)로 분리되었고, 표준물질을 이용하여 확인한 결과 GNA1은 kaempferol, GNA2는 quercetin임을 알 수 있었다.
이 중 50 µg/mL 의 농도에서 가장 큰 세포보호효과(676.7 min)를 보여주었고, 농도가 100 µg/ mL에서 613.3 min으로 약간 감소하는 경향을 나타내었다.
Quercetin이 quercetin 배당체인 rutin보다도 세포보호 활성이 훨씬 큼을 보여주고 있다. 이는 rutin보다도 quercetin이 세포막에의 접근과 세포막내로의 침투가 더 용이함을 나타내며 이는 세포막에서 일어나는 활성산소에 의한 인지질의 산화와 세포막 파괴를 플라보노이드 aglycone인 quercetin이 보다 더 효율적 으로 억제함을 보여주고 있다. Rutin은 2개의 당(rutinose)이 결합한 형태로 rutin 분자 주위에서 큰 물껍질이 형성되어 세포막 내로의 접근에 상당한 어려움이 있어 세포보호 활성도 낮게 나타난 것으로 판단되어 진다.
8 min)으로 세포 파괴를 억제하였다. 한편 ethylacetate 분획의 경우는 세포보호 활성이 미약한 것으로 나타났으나 당을 제거시킨 분획의 세포보호효과는 매우 크게 나타났다. 당을 제거시킨 분획의 경우 1 ∼ 50µg/mL의 농도 범위에서 농도 의존적으로 세포보호 활성을 나타냈다.
현초 추출물(50 % 에탄올 추출물)의 세포보호 효과는 1 ∼ 100 µg/ mL의 농도범위에서 거의 농도 의존적(τ50 이 각각 32.0, 34.2, 49.0, 66.8 min)으로 세포 파괴를 억제하였다.
활성산소 소거활성(OSC50)은 현초 50 % 에탄올 추출물의 활성은 0.23 µg/mL, ethylacetate 분획, 0.16 µg/ mL, ethylacetate 분획의 당 제거한 aglycone 추출물은 0.04 µg/mL로 나타났다.

후속연구

일반적으로 HA의 양은 노화(또는 광 노화)와 함께 감소되며, 피부 탄력저하 및 주름생성과 밀접한 관계가 있는 것으로 보고되고 있다[26,27]. 따라서 이러한 결과를 통하여 현초 추출물을 대상으로 주름개선 작용이 있는 항노화 기능성 소재로서 가능성이 있는지 알아보기 위한 체계적인 연구가 필요하다고 생각된다.
이상의 결과들은 현초 추출물의 항산화 작용과 더불어 현초 성분에 대한 분석과 ethylacetate 분획의 당 제거 실험 후 얻어진 aglycone 분획의 큰 tyrosinase, elastase 저해활성으로부터 미백 및 주름개선 기능성 화장품원료로서 응용가능성이 큼을 시사한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	현초는 무엇인가?	현초(Geranium nepalense)는 쥐손이풀과로 황해 이남에 자생하며, 전초가 약용으로 이용되는 식물이다[21]. 현초는 항균성 식물로서 많은 연구가 이루어져 있으나[22-24], 아직 피부 노화 과정에 깊이 관여하는 활성산소인 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 항산화적 보호 작용이나 생체에서와 같이 각종 활성산소종(H2O2, O2⋅- ,⋅OH 등)이 생성되는 계(Fe3+-EDTA/H2O2계)에서 각종 ROS에 대한 총항산화능에 관한 연구는 아직 되어 있지 않다.
	생체 내 과잉의 활성산소가 생성되면 어떤 문제를 일으키는가?	이들은 고에너지 복사선, 광증감반응 및 몇 가지 효소반응을 포함하는 다양한 과정을 거쳐서 세포 및 조직 중에서 생성될 수 있다. 생체 내에서 과잉의 활성산소가 생성되면 돌연변이, 염증, 세포살상, 발암과 피부노화 등이 나타난다[1-7].
	활성산소종에는 어떤 물질들이 포함되는가?	따라서, ROS로 유도된 피부의 광산화적 손상 위험은 실질적으로 증가하고 있다. ROS 란 1O2, H2O2와 같은 비라디칼종과 O2⋅- , ⋅OH와 같은 산소중심의 라디칼들 그리고 생체 성분과 ROS와의 반응에서 유래된 ROO⋅, RO⋅, ROOH 및 ROCl 등이 포함된다. 이들은 고에너지 복사선, 광증감반응 및 몇 가지 효소반응을 포함하는 다양한 과정을 거쳐서 세포 및 조직 중에서 생성될 수 있다.

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R. Fleischmajor, J. S. Perlish, and R. I. Bashey, Human dermal glucosaminoglycans and aging, Biochem. Biophys. Acta., 279(2), 265 (1972)

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M. O. Longas, C. S. Russell, and X. Y. He, Evidence for structural changes in dermatan sulfate and hyaluronic acid with aging, Carbohydr. Res., 159(1), 127 (1987)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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