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문제 정의
- 본 연구에서는 현초에서 분리한 quercetin, quercitrin, afzelin를 이용하여, 염증억제 효과에 관한 연구 결과를 얻었기에 보고합니다.
제안 방법
- 0, 110 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, PMSF 100 µg/mL)로 용혈시킨 다음, 원심분리 하여 단백질 용액을 얻었다. Bradford 분석 방법을 이용하여 단백질을 정량한 다음, 동량의 sample buffer (125 mM Tris pH 6.8, 4 % SDS, 20 % glycerol, 10 % mercaptoethanol)를 혼합한 다음 95℃에서 5분 동안 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 12% acrylamide gel에서 전기영동을 수행한 다음, nitrocellulose membrane(Amersharm Pharmacia)으로 전위시키고, 5 % skim milk/ TBS-T (20 mL)로 상온에서 1시간동안 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다.
- 0 µg/mL이 되도록, MTT를 첨가하여 2 - 4시간 동안 반응시켰다. MTT와 생존세포로부터 생성된 보라색 불용성 formazan을 DMSO로 용해하여, 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율 (%)로 표시하였다.
- 대식세포가 interferon-γ (INF-γ)또는 LPS의 자극에 의해서 larginine으로부터 NOS에 의한 대사과정을 통해 NO가 다량 생산되면, 염증반응으로 유발되는 조직손상, 돌연변이 및 신경조직의 손상 등을 일으켜 생체에 유해한 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. NO가 생성되는 대사과정에 관여하는 사이토카인으로 알려진 iNOS와 NOS의 생성에 관여하는 조효소로 COX-2의 발현을 관측하였다. 또한, 모든 세포가 일정하게 가지고 단백질로 알려진 β-actin 을 측정함으로써, 각 농도별 단백질의 양이 일정함을 확인하였다.
- Quercetin, quercitrin 및 afzelin을 DMSO에 녹여 저장용액을 만들었으며, sarcoma 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 griess 시약(1 % sulfanilamide, 0.1 % N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride in 2.5 % phosphoric acid solution)을 이용하여 측정하였다. 이것을 희석하여 적정용액을 만든 후 LPS를 1.
- Quercetin, quercitrin 및 afzelin을 농도별로 RAW 264.7 세포에 1시간 전처리한 다음, LPS로 자극하고 24시간 후에 배양액을 회수하여 방치한 다음, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay, R&D System)를 이용하여 분석하였다.
- Quercetin, quercitrin 및 afzelin이 RAW 264.7 세포주에서 LPS의 유도에 의한 NO 생성에 미치는 영향에 대해 알아보기 위하여, RAW 264.7 세포주 (1 x 105 cells/mL)를 5시간 후에 5.0 – 50.0 M 생리활성물질의 농도로 2시간 동안 전처리한 다음, 1.0 mg/mL LPS를 처리하여 18시간 배양하였다.
- COX-2와 iNOS 및 ß-actin에 대한 1차 항체(primary antibody) 를 3 % skim milk/1 x TBS-T에서 1 : 1,000 으로 희석하여, membrane과 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고 세척한 다음, anti-mouse, rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차 항체 (secondary antibody)를 1% skim milk/ TBS-T에서 1 : 5,000으로 희석하여, membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 세척한 다음, ECL reagent kit (ECL, Amersham, Buckinghamshire, England)로 발색시킨 다음, X-ray film에 감광하는 방법으로 분석하였다.
- 1). 그 중 생리활성이 있는 분획 1 을Sephadex LH-20을 이용하여, 메탄올 : 물 (4 : 6)와 메탄올의 용매조건으로 분리하여 노란색 고체 quercetin (Fig. 8)(13.7 mg)을 얻었다. 분획 4를 역상 HPLC 을 이용하여, 10 - 55 % acetonitrile/H2O의 용매조건으로 60분 동안 분리하여, quercitrin(Fig.
- 8, 4 % SDS, 20 % glycerol, 10 % mercaptoethanol)를 혼합한 다음 95℃에서 5분 동안 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 12% acrylamide gel에서 전기영동을 수행한 다음, nitrocellulose membrane(Amersharm Pharmacia)으로 전위시키고, 5 % skim milk/ TBS-T (20 mL)로 상온에서 1시간동안 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. COX-2와 iNOS 및 ß-actin에 대한 1차 항체(primary antibody) 를 3 % skim milk/1 x TBS-T에서 1 : 1,000 으로 희석하여, membrane과 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고 세척한 다음, anti-mouse, rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차 항체 (secondary antibody)를 1% skim milk/ TBS-T에서 1 : 5,000으로 희석하여, membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시킨다.
- 생쥐의 대식세포주 (Murine macrophage Raw 264.7 cell line)를 10% FBS (56 ℃ heat inactivated), 1 % L-glutamine, nonessential amino acids 및 1 % antibiotic/antimycotic solution (100 U/mL of penicillin, 25 g /mL of amphotericin D, and 100 g/mL of streptomycin), 2 % sodium bicarbonate 등이 포함된 RPMI 1640 배지에 넣고 37℃, 5 % CO2incubator에서 24시간 배양하였다.
- 또한, 모든 세포가 일정하게 가지고 단백질로 알려진 β-actin 을 측정함으로써, 각 농도별 단백질의 양이 일정함을 확인하였다. 자극원만 처리한 대조군의 사이토카인 발현 정도를 기준으로 하여, 생리활성 물질이 사이토카인을 억제하는 정도를 확인하였다. 현초에서 분리한 생리활성물질을 5.
대상 데이터
- 생리활성에 대한 측정을 위해, MTT (2-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)와 DMSO (dimethyl sulfoxide), LPS (lipopolysacchride)는 Sigma사에서 구입하였으며, Antibiotic antimyotic solution 과 FBS (fetal bovine serum), RPMI 1640 은Gibco/Invitrogen에서 구입하였다. Anti-iNOS, anti-COX-2, anti-tumor necrosis factor -alpha (TNF-) antibody는 Santa Cruz Biotechnology INC. (California, USA)로부터 구입하였으며, nitrocellulose membrane (NC membrane)은 Amersharm Pharmacia사로부터 구입하여 사용하였다. 용매로는 methanol (MeOH), ethanol (EtOH), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EA), n-butanol (n-BuOH), n-hexane, 정제하지 않고 사용하였다.
- 순수한 물질의 확인은 ESI-MS를 얻기위해, Micromass Quatro LC를 사용하였다. NMR spectrum은 JEOL Eclipse 500 FT-NMR Spectrometer (500 MHz)를 사용하였으며, NMR 용매는 methanol-d4, dimethyl-sulfoxide-d6,, chloroform-d, 내부 표준물질은 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 현초는 원광대학교 한의학대학 부속한방병원에서 구입하여, 외부형태를 비교 조사하고 확인 후 사용하였다. 실험에 사용된 현초는 원광대학교 자연과학대학 천연물실험실에 보관되어있다.
- 생리활성에 대한 측정을 위해, MTT (2-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)와 DMSO (dimethyl sulfoxide), LPS (lipopolysacchride)는 Sigma사에서 구입하였으며, Antibiotic antimyotic solution 과 FBS (fetal bovine serum), RPMI 1640 은Gibco/Invitrogen에서 구입하였다. Anti-iNOS, anti-COX-2, anti-tumor necrosis factor -alpha (TNF-) antibody는 Santa Cruz Biotechnology INC.
- S-5 m, 12 mm) HPLC column, EYEL4 rotary vacuum evaporator, vision workstation perseptive bio-systems HPLC 등을 사용하였다. 순수한 물질의 확인은 ESI-MS를 얻기위해, Micromass Quatro LC를 사용하였다. NMR spectrum은 JEOL Eclipse 500 FT-NMR Spectrometer (500 MHz)를 사용하였으며, NMR 용매는 methanol-d4, dimethyl-sulfoxide-d6,, chloroform-d, 내부 표준물질은 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였다.
- (California, USA)로부터 구입하였으며, nitrocellulose membrane (NC membrane)은 Amersharm Pharmacia사로부터 구입하여 사용하였다. 용매로는 methanol (MeOH), ethanol (EtOH), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EA), n-butanol (n-BuOH), n-hexane, 정제하지 않고 사용하였다. 추출물들의 농축에는 원심분리기 (Hanil Industrial Company, Hm 150 Ⅳ)와 진공 회전식 농축기를 사용하였으며, 흡광도 측정에는 UV-Visible Spectrophotometer (Molecular Devices Spectra Max 190)와UV-Visible S-2100 (Scinco Co.
- 현초의 추출 및 open columm 분리에서 사용된 용매는 제 1급 시약을 사용하였으며, 물질의 분리에는 25 TLC plastic sheets (20 × 20 cm) silica gel 60 F254 (MERCK), 25 TLC plates 5 × 10 cm RP-18 F254S(MERCK), silica gel 60 (0.015~0.140 mm, MERCK), silica gel 60 (0.040~0.063 mm MERCK), octadecyl-functioalized silica gel (Aldrich) lipophilic sephadex LH-20 (SIGMA) 등 충진제와 Phenomenex 사의 Luna 5u C18 (2) (250 x 21.20 mm5 micron) HPLC column 과 YMC 사의 Hydrosphere C18 (250 x 20 mm I. D. S-5 m, 12 mm) HPLC column, EYEL4 rotary vacuum evaporator, vision workstation perseptive bio-systems HPLC 등을 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과는 mean ± S.D. 값으로 표시하였으며, 각 실험 결과 로부터 ANOVA (analysis of variance)를 구한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 군의 평균간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- PGE2 생성에 직접적으로 영향을 미치는 COX-2 의 발현을 western immunoblot analysis 방법과 ELISA 방법으로 조사하였다. COX-2 단백질 발현이 농도 의존적으로 억제되는 사실을 증명하였으며, LPS로 자극된 대조군을 기준으로 했을 때, 50 M 생리활성물질을 처리하였을 때, 50%의 감소율이 관찰되었다.
- Quercetin, quercitrin 및 afzelin에 대한 RAW 264.7 세포주의 세포 생존율을 MTT 방법을 이용하여 분석하였다. RAW 264.
- Cells were incubated with or without 1 g/mL LPS for 24 hrs in the presence or absence of quercetin at indicated concentrations. The cell viability was determined by the MTT method. One of three blots is shown and each bar represents the mean ± S.
- 모든 분석과정은 R&D System에서 제공된 방법에 준하여 측정하였다.
성능/효과
- PGE2 생성에 직접적으로 영향을 미치는 COX-2 의 발현을 western immunoblot analysis 방법과 ELISA 방법으로 조사하였다. COX-2 단백질 발현이 농도 의존적으로 억제되는 사실을 증명하였으며, LPS로 자극된 대조군을 기준으로 했을 때, 50 M 생리활성물질을 처리하였을 때, 50%의 감소율이 관찰되었다. 이러한 연구결과는 정공피 메탄올 추출물에서 분리된 prunetin, sakuranetin, 및 dihydroquercetin은 30 M에서 발생하는 NO의 50%이상 감소하는 것으로 관찰되었다.
- Quercetin, quercitrin 및 afzelin과 1.0 g/mL LPS가 처리된 RAW 264.7 세포를 용해시킨 후, Bradford법으로 분석한 결과에 의하면, 농도 의존적으로 감소되는 현상을 관찰할 수가 있었으며, 이들 생리활성물질은 대조군과 비교할 때에 50.0 M에서 발생하는 NO의 30% 이상 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 정공피 메탄올 추출물에서 분리된 prunetin, sakuranetin, 및 dihydroquercetin은 30 M에서 발생하는 NO의 50%이상 감소하는 것으로 관찰되었다.
- Quercetin, quercitrin 및 afzelin을540 nm파장에서 흡광도를 측정한 결과, 대조군을 100%로 하였을 경우, LPS로 자극한 대조군은 75%의 세포 생존율을 나타냈으며, 생리활성물질과 LPS를 처리한 군은 생리활성물질들이 가장 높은 농도인 50.0 μM을 처리한 군에서 80% 이상의 세포 생존율이 측정되었다.
- 0 mg/mL LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 그 결과 생리활성물질이 처리되지않고 LPS로 자극한 대조군은 23.6 M의 아질산염을 생성시킨 반면, 5.0 - 50.0 M 생리활성물질을 처리한 실험군은 약 3.0 - 15.0 M의 아질산염을 생성시켰다. 이러한 연구결과에 의하면, quercetin, quercitrin 및 afzelin는 LPS로 활성화된 RAW 264.
- 메탄올 추출물은 3차 증류수에 포화시킨 후, 용매의 극성에 따라 계통 분획하였다. 노르말 헥산으로 3회 추출하여, 노르말 헥산추출물 (108.00 g, 16.85%)을 얻었으며, 같은 방법으로 에틸 아세테이트 추출물 (80.76 g, 12.60%), 노르말 부탄올 추출물 (109.15 g, 17.03%) 그리고 물 추출물 (332.00 g, 51.79%)을 얻었다. 에틸 아세테이트 추출물 (5.
- 또한, 모든 세포가 일정하게 가지고 단백질로 알려진 β-actin 을 측정함으로써, 각 농도별 단백질의 양이 일정함을 확인하였다.
- COX-2 단백질 발현이 농도 의존적으로 억제되는 사실을 증명하였으며, LPS로 자극된 대조군을 기준으로 했을 때, 50 M 생리활성물질을 처리하였을 때, 50%의 감소율이 관찰되었다. 이러한 연구결과는 정공피 메탄올 추출물에서 분리된 prunetin, sakuranetin, 및 dihydroquercetin은 30 M에서 발생하는 NO의 50%이상 감소하는 것으로 관찰되었다. 플라보노이드 화합물인 quercetin, quercitrin 및 afzelin이 항염증제로서 활용할 가치가 있는 것으로 생각된다(Fig.
- 0 M의 아질산염을 생성시켰다. 이러한 연구결과에 의하면, quercetin, quercitrin 및 afzelin는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 NO생성을 억제하는 효과가 정공피 메탄올 추출물에서 분리된 prunetin, sakuranetin, 및 dihydroquercetin보다 효능이 좋은 것으로 관찰되었다(Fig. 4, 5와 6)15,16).
- 현초에서 분리한 생리활성물질을 5.0 - 50.0 μM의 농도로 세포주에 처리하고, 이로부터 단백질을 추출하여 전기영동장치를 이용한 단백질 분리과정을 통해 얻은 띠의 두께를 분석한 결과, 생리활성물질이 β-actin의 발현에 영향을 미치지 않고, 농도 의존적으로 iNOS 와 COX-2 의 생성을 억제함을 확인하였다(Fig. 4, 5와 6)15,16).
- 현초의 메탄올 추출물로부터 분리한 quercetin와 quercitrin 그리고, afzelin 화합물이 면역반응에 미치는 영향에 대한 연구 결과에 의하면, 면역반응에 의한 염증 대사 과정에 관여하는 것으로 알려진 대식세포 중 쥐의 대식세포 RAW 264.7 세포주를 사용하여 활성화된 대식세포로부터 생성되는 사이토카인 및 NO의 생성, iNOS의 발현, COX-2 의 발현와 PGE2 생성이 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 이러한 연구결과에 의하면, quercetin와 quercitrin 그리고, afzelin 화합물이 항균 치료제나 염증 억제제로서 관련 질환을 예방하거나 치료할 가능성을 시사하고 있다.
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