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문제 정의
- 하였다. 또한 축산물의 위생관리 및 안전성을 보다 더 향상시키고 소비자에게 안전한 식육을 공급함으로서 시민보건 향상에 이바지 하고자 한다.
- 본 연구에서는 우리시 관내 도축되는 소와 돼지의 도체표면에서 Y enterocoliticae 분리하고 분리균에 대하여 혈*, 청형검사 생화학검사를 통한 biotyping 및 병원성 검사를 위한 polymerase chain reaction(PCR), pulsed- field gel electrophoresis (PFGE) 를 이용한 molecular typing 등의 실험을 실시하여 본 균에 대한 분포 및 분리균의 특성을 연구하고자 하였다. 또한 축산물의 위생관리 및 안전성을 보다 더 향상시키고 소비자에게 안전한 식육을 공급함으로서 시민보건 향상에 이바지 하고자 한다.
제안 방법
- PCR에 사용된 primer는 Ail gene에 특이적인 primer로서 Ail 1의 sequence는 5 CGTCTGTTAATGTGTAC—3’이고, Ail 2 는 5' -GGTGCCAACTTTTATGCTATCG -31 이다. PCR mixture 는 1XPCR buffer (Takara, Japan), 0.2mM dNTP, luM의 각각의 primer와 2.5U Taq DNA polymerase(Takara, Japan)# 사용하였으며 template로 1 ul를 넣어 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 94 ℃ 1분간 denaturation, 56℃ 1분간 annealing, 72℃ 1분 30초간 extension과정을 35 cycle 실시하였으며, 최종 cycle의 extensione 10분으로 하였다.
- PCR 반응조건은 94 ℃ 1분간 denaturation, 56℃ 1분간 annealing, 72℃ 1분 30초간 extension과정을 35 cycle 실시하였으며, 최종 cycle의 extensione 10분으로 하였다. PCR 반응산물 2ul을 1.5% agarose gel에 전기 영동하여 특이밴드를 확인하였다.
- PFGE는 Gautom 등8)과 Matushek 등9) 의방법을 변형하여 사용하였다. 순수 분리한 25개의 분리주와 표준균주를 TSA agar에 37℃, 24시간 배양시킨 후 면봉을 이용하여 cell suspension TE(Tris-EDTA) buffer (lOmM Tris, pH 8.
- Tryptic soy agar에 계대배양한 후, API 20E (Biomerieux, Lyon, France) 에 접종하여 37℃ 에서 18 ~ 24시간 배양하여 -galactosidase 외 19종에 대한 효소 활성과 당 분해, 기질생산 등의 생화학적 성상검사와 biotyping 을 위해 lipase, esctilin, indole, xylose, trehalose, B -D-glucosidase, pyra- zinamidase, proline peptidase test를 실시하였다.
- Y enterocoliticae 분리 동정된 23주에 대하여 0 항혈청을 이용한 응집반응은 rapid slide agglutination test로 수행하였으며 Y enterocolitica antisera (Denka Seiken, Japan)는 type 1-2, type 3, type 5, type 8, type 9를 사용하여 실시하였다.
- Y enterocoliticae\ 선택배양 및 순수분리 소와 돼지의 도체표면을 easy swab 으로 swabing 한 액체 1ml를 의 Yersinia enrichment broth와 peptone sorbitol bile broth(PSSB)에 접종하여 10℃에서 10일간 배양하였다. 증균배양액 0.
- 5% NaCl에 넣어 잘 섞은 후 Cefsulodin irgasan novobiocin agar (Merck, France) 에 도말하여 30℃ 에서 48 시간 배양하였다. 배지 상에서 집락 중앙이 짙은 붉은 색을 띠고 주위가 투명한 모양을 띠는 전형적인 집락을 선별하여 Tryptic soy agar (Merck, France) 에 계대배양한 후 API 20E (Biomerieux, France) 에 접 종하고 37 ℃ 에서 24시간 배양한 후 결과를 판독하였다.
- 본 연구에서는 Ail gene 에 특이적인 primer 를 이용하여 PCR 을 실시 하였으며, 458bp의 DNA product의 유무를 확인하여 병원성 유무를 판단하였다. 전체 23건의 K enterocolitica 분리균주의 PCR 결과 특이 밴드가 확인되지 않아 모두 병원성이 없는 것으로 판명되었다.
- Bushrieser 등은 K enterocoliticae PFGE를 실시하였을 때 restriction fragment 가 다수 형성되어 분석하기 어려운 문제가 발생하며 판독범위를 75'100kb 이상에서 제한하거나 1 2~15개의 커다란 밴드만을 판독한다고 하였다. 본 연구에서도 잘라진 fragment가 다수형성되어 Dedrogram 제작시 오차범위를 10%로 설정하여 분석하였다. S9부터 S12 균주, S16과 S17 그리고 S21 부터 S23 분리 주는 각각 같은 시기에 분리되었으며, 같은 시기에 분리된 균주 사이에 상동성이 97% 이상 보여 도축장 환경이나 작업라인에 균이 오염되어 도축과정 중 도체에 교차오염 되는 것으로 추정할 수 있었다.
- 분리주의 병원성여부를 확인하기 위하여 병원성과 관련 있는 Ail gene에 대한 PCR을 실시하였다. template DNA는 BHI broth에증균된 배양액을 사용하였으며, 배양액을 3, 000rpm에서 5분간 원심분리 후 pellet을 멸균증류수 50ul에 균일하게 푼 다음, 100℃ 에서 20분간 끓였다.
- 변형하여 사용하였다. 순수 분리한 25개의 분리주와 표준균주를 TSA agar에 37℃, 24시간 배양시킨 후 면봉을 이용하여 cell suspension TE(Tris-EDTA) buffer (lOmM Tris, pH 8.0 and ImM EDTA, pH 8.0) 에 colorimeter 15%의 투명도로 조정하여 현탁하였다. 만들어진 균 현택액 200 ul에 동량의 1.
대상 데이터
- 2006년 1월부터 2007년 12월까지 총 1, 680건 중 23주(1.36%)의 Yersinia entero- colitica 를 분리하였다 (Table 1). 소에서는 총 840건 중 5건(0.
- Y enterocolitica 분리를 위한 재료는 2006년 1월부터 2007년 12월까지 서울시 소재 도축장에 출하되는 소 840두와 돼지 840두의 도체표면을 Easy swab (Komed, Korea)으로 채취하여 사용하였다.
- 측면에서 중요시 되고 있다. 본 연구에서는 서울시 관내 도축장에서 도축되는 소와 돼지의 도체표면에서 2006년 1월부터 2007 년 12월까지 총 1, 680건 중 23주(1.36%)의 Y enterocoliticae: 분리하였다. 소에서는 총 840건 중 5건(0.
- 5가 되 도록 조정 한 다음 Mueller Hinton agar (Difco, USA) 에 도말하고 3분간 건조시킨 후 Disk dispenser (Becton dickinson, USA)를 이용하여 디스크를 심고 37C, 24시간 배양 후 결과 판독하였다. 항생제는 amikacin (AN30), amoxicillin/ clavulanic acid(AMC30), ampicillin (AMI 0), carbenicillin(CB100), cefazolin(CZSO), cefotaxime (CTX30), chloramphenicol(C30), ciprofloxacin (CIP5), colistin (CLIO), gentamicin (GM10), kanamycin (K30), neomycin (N30), streptomycin (S10), sulfisoxazole (G25), tetracycline(TE30), trimethoprim/ sulfime- thoxazole(STX)을 사용하였다.
데이터처리
- 5mg/mg) 에 gel을 넣어 30분간 염색 후 증류수에서 24시간 탈색하였다. PFGE 결과는 Tenover 등의 방법 a 에 따라 각 균주의 DNA 위치가 다른 절편 수에 따라서 group 을 결정하였고, BioNumerics software (Core-Bio, Korea) 를 이용하여 Dice법으로 dendrogram을 작성하여 균주간의 유연관계를 비교분석 하였다.
이론/모형
- National committee for clinical laboratory standards (NCCLS) 의 기준에 따라 디스크 확산법 (disk diffusion method) 을 이용하여 분리 된 Y enterocolitica에' 대하여 항생제 내성시험을 실시하였다仁 TSA에서 자란 집락을 Mueller Hinton broth (Difco, USA) 에 McFarland 0.5가 되 도록 조정 한 다음 Mueller Hinton agar (Difco, USA) 에 도말하고 3분간 건조시킨 후 Disk dispenser (Becton dickinson, USA)를 이용하여 디스크를 심고 37C, 24시간 배양 후 결과 판독하였다. 항생제는 amikacin (AN30), amoxicillin/ clavulanic acid(AMC30), ampicillin (AMI 0), carbenicillin(CB100), cefazolin(CZSO), cefotaxime (CTX30), chloramphenicol(C30), ciprofloxacin (CIP5), colistin (CLIO), gentamicin (GM10), kanamycin (K30), neomycin (N30), streptomycin (S10), sulfisoxazole (G25), tetracycline(TE30), trimethoprim/ sulfime- thoxazole(STX)을 사용하였다.
성능/효과
- 5%)로 나타났다(Table 2). 3가지 이상의 다제내성 양상을 보인 분리주는 12주(52.2%) 였으며, 이 중 1주는 colistin, ampicillin, amoxicillin/ clavulanic acid, cefazolin에, 6주는 ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, cefazolin, carbe— nicillin 에, 4 주는 ampicillin, amoxicillin/ clavulanic acid, carbenicillin에, 그리고 1 주는 ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, cefazolin에 다재내성을 각각 보였다(Table 3). 임 등(1)은 분리주의 대부분이 carbe- nicillin과 ampicillin에 높은 내성을 보인다고 보고하였으며, 조 등(2)은 사iloramphenicol, tetracycline, kanamycin, gentamicin에 높은 감수성을 보인다고 보고하여 본 연구 결과와 비슷한 양상을 보였다.
- 0:3와。:9형은 분리되지 않았으며, 전체 분리주 중 혈청에 응집반응을 보이지 않은 것이 21주(91.3%)나 차지하였다. 그 이유는 Y enterocolitica7\ 다양한 혈청 형이 보이는데 비해 현재 상업적으로 이용 가능한 혈청이 5가지 뿐이기 때문이며 보다 정확한 혈청학적 시험을 위해서는 보다 많은 항혈청의 상업적인 보급이 필요하겠다.
- Amikacin외 15종의 항생제에 대한 내성 시험을 실시한 결과, amikacin, cefotaxim, chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin, sulfisoxazole, tetracycline, trimethoprim/ sulfamethoxazole에 23주 모두 감수성을 보였으며, 내성이 많이 관찰되는 항생제는 amoxicillin/clavulanic acid 11주 (47.9%), ampicillin 18주(78.3%), carbenicillin 21주 (91.3%), cefazolin 10주(43.5%)로 나타났다(Table 2). 3가지 이상의 다제내성 양상을 보인 분리주는 12주(52.
- 본 연구에서도 잘라진 fragment가 다수형성되어 Dedrogram 제작시 오차범위를 10%로 설정하여 분석하였다. S9부터 S12 균주, S16과 S17 그리고 S21 부터 S23 분리 주는 각각 같은 시기에 분리되었으며, 같은 시기에 분리된 균주 사이에 상동성이 97% 이상 보여 도축장 환경이나 작업라인에 균이 오염되어 도축과정 중 도체에 교차오염 되는 것으로 추정할 수 있었다. 예전에는 식품과 환자에서 같은 bioserotype이 나왔을 경우 유사성이 있다고 판단하였으나, Hristo 등은 같은 serobiotype사"이에도 구별할 수 있는 molecular typing도 필요하다고 하였다.
- Xba I restriction enzyme으로 처리 후 PFGE를 실시한 결과 85%의 상동성 기준으로 12개의 PFGE type(A~L)으로 나뉘었다.
- 혈청학적 검사 결과는 0:5가 1주, 。:8가 1주 그리고 나머지 21주는 UT(untypable)로 나타났다. 병원성 검사를 위한 Ail gene 의 PCR 결과는 23주 모두 병원성이 없는 것으로 확인되었다. 항생제 검사를 실시한 결과, amikacin, cefotaxim, chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin, sulfisoxazole, tetracycline, trimethoprim/sulfametho- xazole에 23주 모두 감수성을 보였으며, 내성이 많이 관찰되는 항생제는 amoxicillin/ clavulanic acid 11주 (47.
- 5%, 돼지고기에서 17%를 분리하였다. 본 연구와 전체적인 분리율을 비교할 때 도축장의 소와 돼지의 도체표면에서 분리했을 때보다 훨씬 높게 나타났으나, 쇠고기보다 돼지고기에서 월등히 높은 분리율을 보인 것은 본 결과와 일치하였다. 조 등은 각종 동물의 분변에서 Y enterocoliticae 분리하였는데 돼지에서 23.
- 분류된다 분리된 23주에 대하여 생화학적 검사결과 모두 API 20E에서 전형적인 생화학적 성상을 보였으며, 생화학적 성상을 이용한 biotyping 결과에서는 1 주 만이 biotype 6을 나타냈으며 나머지 22주는 모두 1A type을 나타내었다. 혈청학적 검사 결과는 0:5 1주, 0:8 1주 그리고 나머지 21주는 UT (untypable) 나타났匸土
- 유무를 판단하였다. 전체 23건의 K enterocolitica 분리균주의 PCR 결과 특이 밴드가 확인되지 않아 모두 병원성이 없는 것으로 판명되었다. 이는 분리주의 혈청형이 병원성을 나타내는 0:3나。:9의 혈청형이 보이지 않았던 것과 일치하는 양상을 보였다.
- 병원성 검사를 위한 Ail gene 의 PCR 결과는 23주 모두 병원성이 없는 것으로 확인되었다. 항생제 검사를 실시한 결과, amikacin, cefotaxim, chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin, sulfisoxazole, tetracycline, trimethoprim/sulfametho- xazole에 23주 모두 감수성을 보였으며, 내성이 많이 관찰되는 항생제는 amoxicillin/ clavulanic acid 11주 (47.9%), ampicillin 18주 (78.3%), carbenicillin 21주 (9L3%), cefazolin 10주(43.5%)로 나타났다. 3가지 이상의 다제내성 양상을 보인 분리주는 12주 (52.
- O 항원에 대한 특이。항혈청을 이용한 균체응집반응에 의하여 약 57개의 혈청형으로 분류된다 분리된 23주에 대하여 생화학적 검사결과 모두 API 20E에서 전형적인 생화학적 성상을 보였으며, 생화학적 성상을 이용한 biotyping 결과에서는 1 주 만이 biotype 6을 나타냈으며 나머지 22주는 모두 1A type을 나타내었다. 혈청학적 검사 결과는 0:5 1주, 0:8 1주 그리고 나머지 21주는 UT (untypable) 나타났匸土
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