보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
연구책임자 |
박용하
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참여연구자 |
김원용
,
유한상
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2001-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400017682 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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키워드 |
Yersinia속 균.다상분류학.신속동정법.감별진단법.Yersinia strains.polyphasic taxonomy.rapid identification.differential diagnosis.
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초록
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Yersina 속 균은 Enterobacteriaceae 과에 속하는 호기성, 그람음성간균으로 Y. pestis, Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei 및 Y. ruckeri의 11개 종으로 구성된다 . Yersina 속 중 사람에서 병원성을 나타내는 종은 Y. pestis, Y. pseudotuberculosis
Yersina 속 균은 Enterobacteriaceae 과에 속하는 호기성, 그람음성간균으로 Y. pestis, Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei 및 Y. ruckeri의 11개 종으로 구성된다 . Yersina 속 중 사람에서 병원성을 나타내는 종은 Y. pestis, Y. pseudotuberculosis 및 Y. enterocolitica 이 알려져 있다 . Y. pseudotuberculosis와 Y. enterocolitica는 경구로 감염되어 위장염, 장간막염 및 패혈증을 유발하며, Y. pestis는 쥐벼룩에 의하여 전파되어 높은 치사율을 보이는 흑사병을 유발한다. Yersina 속균은 균의 형태, 생화학적 특성 및 혈청학적 방법에 의하여 동정 가능하나 장내 세균인 E. coli 및 Salmonella와 표면항원을 공유하기 때문에 흔히 동정에 오류를 일으킬 수 있다. 따라서 이러한 고전적인 방법은 Yersina 속 균의 동정에는 충분치 못하다. 본 연구에서는 국내의 다양한 환경으로부터 다양한 혈청형 및 생물형을 가진 Yersinia 속 세균들의 분포를 조사하고 이들의 오염원의 추적기법을 확립해 나가는 한편 polyphasic taxonomy (다상분류)의 연구를 수행하여 Yersinia 속 세균들의 고속 분류동정법 및 진단법의 개발을 목표로 하였다.
Yersinia 속균의 신속, 정확한 감별동정을 위한 다상분류학적 연구 중 화학분류학적 방법으로 는 균체 지방산 (fatty acid)의 분석, quinone분석, Pyrolysis Mass Spectrometry (PyMS) 분석을 행하였으며 얻어진 데이터로부터 각 균주간의 상관성을 분석하였다. 본 연구에서 fatty acid 분석을 수행한 결과 Yersinia 균주들은 주요 fatty acid 로서 saturated fatty acid, C17:0 cyclopropane 및 summed feature 3 를 포함하고 있음을 확인 할 수 있으며 fatty acid C16:0 이 모든 균주에 가장 많은 양으로 존재하는 주요 fatty acid 성분인 것으로 확인되었다. 23 균주에 대한 fatty acid 분석과 PyMS 분석을 비교한 결과 clustering에 대한 유의성이 나타남을 확인할 수 있었다. Fatty acid 분석으로부터 얻어진 결과들을 각각의 Yersinia 속 균주에 대한 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석 결과와 비교한 결과 fatty acid 분석 결과 얻어진 각각의 cluster 와 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석에서 얻어진 cluster 에 속하는 균주 사이에 일관성은 발견되지 않았다. 하지만 16S rDNA partial 염기서열에 기초해서 작성된 계통수에서 Yersinia enterocolitica ATCC 9610을 포함하는 cluster에 포함되는 균주들 대부분은 fatty acid 데이터에 근거해서 작성된 dendrogram에서 43 균주를 포함하는 major cluster에 포함되었다. 또한 strain 67(10-1)은 16S rDNA partial 염기서열에 기초해서 작성된 계통수와 fatty acid 데이터에 근거해서 작성된 dendrogram에서 동일하게 어떤 cluster에 포함되지 않고 single lineage를 형성하는 일치성을 보여 주었다. 몇몇 선별된 Yersinia 속 균주에 대해서 quinone 분석을 수행한 결과 모든 Yersinia 균주는 공통적으로 그람음성 세균에 특정적으로 발견되는 quinone 의 종류인 ubiquinone을 가지고 있었으며 그 중에서도 모두 동일하게 ubiquinone-8을 주요 quinone으로서 함유함을 확인할 수 있었다. 따라서 결정된 화학분류학적 데이터를 기초로 Yersinia 속 균주에 관련된 데이터베이스 구축 및 고속 동정 및 진단법을 개발할 수 있다.
최근에는 DNA 에 기초한 방법들이 개발되어 세균의 분류 및 동정에 널리 이용되고 있다. 이 연구에서는 Yersinia 속균의 16S rDNA 염기서열 분석, rep-PCR 및 AFLP를 수행하여 각 속 균간의 유전적 상관성을 탐색하고 이를 신속한 분류 및 동정에 활용하고자 하였다. 16S rDNA 염기서열 분석 결과 Yersinia 속균의 상동성의 범위는 97.4에서 99.9% 이었다. 16S rDNA로부터 수상도를 작성한 결과 대부분의 Yersinia 속균은 서로 독립 그룹을 형성하였으나 Y. psudotuberculosis와 Y. pestis는 동일 그룹에 속하였다. rep-PCR genomic fingerprinting 결과 모든 Yersinia 속균은 REP-PCR 및 ERIC-PCR은 상동성 수준 62%와 58%에서 분류가 가능하였으나 BOX-PCR에서는 74% 상동성 수준에서 Y. pestis와 Y. psudotuberculosis는 같은 그룹에 속하였다. AFLP 실험 결과 장내세균에서 사용되는 primer set EcoRl/Msel-00, EcoRl/MseI0A 및 EcoRl/Msel-A0는 Yersinia 속균은 서로 혼합된 결과를 보였다. 따라서 이와 같은 결과를 종합할 때 rep-PCR genomic fingerprinting은 16S rDNA 염기서열 분석 및 AFLP 보다 Yersinia 속 균의 분류 및 동정에 신속하며 매우 높은 분별력을 가진 방법이며 아울러 Yersiniosis 의 역학적인 연구에도 매우 유용하게 이용될 수 있으리라 생각된다.
국내 주요 환경에 Yersinia 속 균의 분포를 조사하고 이들의 오염원을 추적할 수 있는 추적 기법을 개발하기 위하여 약수 및 돼지 분변으로 부터 Yersinia 속 균을 분리 동정하여 이들 속 균의 분포 양상, 생화학적 특성, 항생제 감수성 양상, 병원성 관련 특성, biotype, serotype, ribotype 및 이들 생물형 및 혈청형에 따른 OMP의 발현 양상 및 이들 OMP의 분리, 정제 및 항체를 생산하여 Y. eneterocolitca 에 대한 가축 등의 혈중 항체가를 측정 할 수 있는 ELISA 기법을 개발하여 이 기법으로 국내 사육 돼지의 항체가를 조사하였다. 돼지 분변 및 약수로부터 분리한 Yersinia 속 균 97주는 각각 Y. enterocolitica 51주 (52.6%), Y. frederiksenii 37주 (38.1%), Y. kritensenii 7주 (7.2%), Y. intermedia 2주 (2.1%)로써 동정되었고 동정된 Y. enterocolitica는 표준주와 동일한 생화학적 성상을 나타내었으며 이 균주들의 항생제 감수성 검사 결과 bacitracin 100%), vancomycin 100%), ampicillin (98%), carbenicillin (80.4%) 에 대하여 는 높은 저항성을, chloramphenicol (100%), tetracycline (98%), norfloxacin (98%), enrofloxacin (98%), amikacin (94.1%), nalidixic acid (92.2%) 에 대하여는 높은 감수성을 나타내었다. 시험관 내 병원성관련 시험에서 CRMOX 양성 27주 (52.9%), CV 양성10주 (19.6%), CD 양성 30주 (58.8%), esculin 양성 20주 (39.2%) 및 salicin 양성 20주 (39.2%)이었고 병원성관련 70kb plasmid 보유 균주가 31주 (61%)이었다. Biotype은 3B, 3A 및 4 순이었고 serotype는 O:3가 가장 높았으며,O:13, O:16 순서이었다. PCR기법을 이용한 ribotype에서 10 가지 형으로 구분되었으며 type I 형이 가장 많이 분포하였다. OMP분석결과 38kDa의 공통항원을 나타내었다. 이들 중 공통항원인 38kDa 크기의 OMP을 순수, 분리 정제하여 mouse에서 monospecific polyclonal antibody를 생성하였고, 순부, 분리 정제된 38kDa OMP를 이용하여 혈중의 Y. enterocolitca의 항체가를 측정할 수 있는 ELISA 기법을 확립하였고 국내 사육 돼지중 Y. enterocolitca 에 대한 확립된 ELISA 기법을 이용하여 항체가를 분석한 결과 모돈과 30일령 이상의 자돈에서 높은 항체가 분포를 나타내었고, 계절적으로 3-5월, 10-12월 사이에 높은 항체가 분포를 나타내는 개체들이 많이 분포하였다.
Abstract
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The members of the genus Yersinia are aerobic, Gram-negative and belonging to the family Enterobacteriaceae. The genus consists of 11 validly described species including Y. pestis, Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pseud
The members of the genus Yersinia are aerobic, Gram-negative and belonging to the family Enterobacteriaceae. The genus consists of 11 validly described species including Y. pestis, Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei and Y. ruckeri. The species Y. pestis, Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis have been known as the pathogenic members of the genus. Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica causes acute gastroenteritis through oral infection. Whereas, Y. pestis is transmitted by fleas and causes plague with a high mortality. The other species are of environmental origin and may act as opportunistics. Yersinia species have been identified on the basis of morphology, biochemical tests and serological methods. However, the classical methods are not always sufficient for the identification of the genus Yersinia The genus Yersinia shares surface antigens with other enteric bacteria such as Salmonella and E. coli; this often leads to false identification due to cross-reactions. The aim of this study was to investigate the distribution of Yersinia strains with various types of serotypes and biotypes from domestic natural environments and to develop rapid classification, identification and differential diagnosis systems for Yersinia strains based on polyphasic taxonomic approach.
To characterize the chemotaxonomic properties for the development of rapid identification and differential diagnosis methods of Yersinia strains, cellular fatty acid, isoprenoid quinone and pyrolysis mass spectrometry (PyMS) were analyzed, and the relationships between Yersinia strains based on these data was investigated. The result of fatty acid analysis showed that Yersinia strains contain major amounts of saturated fatty acd, C17:0 cyclopropane and fatty acids of summed feature 3 and have C16:0 as the major fatty acid. Twenty-three strains used in this study exhibit a correlation between the results of fatty acid analysis and PyMS analysis. However, there was no correlation between the cluster obtained from the result of fatty acid analysis and clusters from the phylogenetic inference based on 16S rDNA sequences. Nevertheless, in the phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences, most strains falling within the cluster containing Yersinia enterocolitica ATCC 9610 were included within the major cluster containing forty-three strains in the dendrogram based on fatty acid data. Strain 67(10-1) formed a single lineage in both the phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences and the dendrogram based on fatty acid data.
The result of isoprenoid quinone analysis for some Yersinia strains showed that all strains have ubiquinones characteristic of Gram-negative bacteria and unsaturated ubiquinone with eight isoprene units (Q-8) as the predominant quinone. Accordingly, on the basis of the chemotaxonomic data determined, it can be possible to construct the database system and to develop the rapid identification and diagnosis systems for Yersinia strains.
Recently, DNA-based approaches have increasingly been applied to bacterial identification and classification. In this study, the 16S rDNA sequence analysis, rep-PCR genomic fingerprinting and AFLP procedure were evaluated to investigate genetic relatedness and it's application of the genus Yersinia. The 16S rDNA sequence similarity of all validly recognized species of the genus Yersinia ranged from 97.4 to 99.9%. A Phylogenetic tree constructed from 16S rDNA similarity showed that the genus Yersinia formed distinct radiation of clusters exception with Y. psudotuberculosis and Y. pestis. As a result of rep-PCR genomic fingerprinting, REP-PCR and ERIC-PCR revealed that the genus Yersinia was separated each other at 62% and 5S% of similarity level, respectively. On the contrary, BOX-PCR results demonstrated that Y. pestis and Y. psudotuberculosis clustered together at 74% of similarity. AFLP results indicated that the primers set of EcoRI/MseI-00, EcoRI/MseI-OA and EcoRI/MseI-AO could not show discriminatory power for the genus Yersinia. Therefore, it was concluded that the rep-PCR genomic fingerprinting than the 16S rDNA sequence analysis and rep-PCR genomic fingerprinting could be used as rapid, highly discriminatory technique to identify the genus Yersinia and would be useful for epidemiological studies of Yersiniosis.
We investigated the biochemical, pathogenic and genetical characteristics of Y. enterocolitica isolated from feces of pigs and moutainspring water. Fifty-one strains of Y. enterocolitica were isolated from the samples and identified by biochemical tests and Vitek system.
Biochemical properties of the isolates were very similar to those of reference strains. They were susceptible to chloramphenicol, tetracycline, norfloxacin, but resistant to bactericin, ampicillin in antimicrobial susceptibility test by disk diffusion method. In vitro virulence-associated tests, the positive strains were CRMOX+ 27 isolates(52.9%), CV+ 10 isolates(19.6%), CD+ 30 isolates(58.8%), esculin+ 20 isolates(39.2%) and salicin+ 20 isolates(39.2%). Thirty-one strains of 51 isolates(61%) harbored about 70kb plasmid presumably related to virulence of the bacteria. Biotypes and serotypes of the strains were 3B, 3A, 4 and 0:3, 0:13, 0:16 in order, respectively. By PCR-ribotyping, the strains were classified into 10 groups based on the patterns of major bands, Type I was the most common types. Of the domestic animals, swine has been known as one of the most important carrier in the human infection. Therefore, antibody titer against Y. enterocolitica was investigated in swine sera. To establish a method to test prevalence of antibody against Y. enterocolitica, outer membrane protein (OMP) profiles of the representative strains of Y. enterocolitica isolated from the feces of pigs and moutainspring water in Korea were analyzed. Thirty-eight kDa OMP was identified as the common OMP regardless of origin, serotype, or biotype of Y. enterocolitica isolates. Presence of antibody specific for 38kDa OMP of Y. enterocolitica in 1,076 swine sera collected from November 1999 to October 2000 was analyzed with ELISA established through this project. Antibody titer in sows was significantly higher than that in piglets, growing pigs and finishing pigs (p<0.05). Also, there was seasonal difference in the prevalence of antibody against Y. enterocolitica. These results would provide the basic knowledge for controlling the Y. enterocolitica infection in human as well as swine.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
- Project Summery ... 8
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 14
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 48
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 51
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 54
- 6. 첨부서류 ... 55
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 56
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 57
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 59
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 63
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 78
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 80
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 81
- 7. 참고문헌 ... 82
- 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 84
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 85
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 87
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 96
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 136
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 139
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 140
- 7. 참고문헌 ... 141
- 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 144
- 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 144
- 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 146
- 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 152
- 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 164
- 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 168
- 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 169
- 7. 참고문헌 ... 169
- 끝페이지 ... 171
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