[국내논문]글루타메이트로 유발한 HT22세포 독성에 대한 백두산 식물 추출물의 보호 효과 Neuroprotective Effects of Plant Extracts from Baekdu Mountain on Glutamate-induced Cytotoxicity in HT22 cells원문보기
Oxidative stress is considered to play an important role in a variety of neurodegenerative disorders of central nervous system. The immortalized mouse hippocampal cell line, HT22, phenotypically resembles neuronal precursor cells but lacks functional ionotropic glutamate receptors, thus excluding ex...
Oxidative stress is considered to play an important role in a variety of neurodegenerative disorders of central nervous system. The immortalized mouse hippocampal cell line, HT22, phenotypically resembles neuronal precursor cells but lacks functional ionotropic glutamate receptors, thus excluding excitotoxicity as a cause for glutamate triggered cell death. Therefore, HT22 cells are a useful model for studying oxidative glutamate toxicity. In this study, we examined whether the methanol extracts of some native plants at Mt. Baekdu could protect HT22-immortalized hippocampal cells against glutamate-induced oxidative stress. Seventy-eight plants sources were collected at Mt. Baekdu, and extracted with methanol. These extracts had been screened the protective effects against glutamate-induced oxidative damage in HT22 cells at the 100 and 300 ${\mu}g/ml$. Of these, thirteen methanolic extracts, Acer mono (leaf), Artemisia stolonifera (aerial part), Carduus crispus (aerial part), Carex mongolica (whole plant), Clematis hexapetala (whole plant), Galeopsis bifida (aerial part), Galium verum (whole plant), Ganoderma lucidum (whole plant), Ixeris chinensis (whole plant), Malva verticillata (aerial part), Polygonum senticosum (whole plant), Rebes mandshricum (branch), and Taraxacum mongolicum (aerial part), showed significant protective effects against glutamate-induced oxidative damage in HT22 cells.
Oxidative stress is considered to play an important role in a variety of neurodegenerative disorders of central nervous system. The immortalized mouse hippocampal cell line, HT22, phenotypically resembles neuronal precursor cells but lacks functional ionotropic glutamate receptors, thus excluding excitotoxicity as a cause for glutamate triggered cell death. Therefore, HT22 cells are a useful model for studying oxidative glutamate toxicity. In this study, we examined whether the methanol extracts of some native plants at Mt. Baekdu could protect HT22-immortalized hippocampal cells against glutamate-induced oxidative stress. Seventy-eight plants sources were collected at Mt. Baekdu, and extracted with methanol. These extracts had been screened the protective effects against glutamate-induced oxidative damage in HT22 cells at the 100 and 300 ${\mu}g/ml$. Of these, thirteen methanolic extracts, Acer mono (leaf), Artemisia stolonifera (aerial part), Carduus crispus (aerial part), Carex mongolica (whole plant), Clematis hexapetala (whole plant), Galeopsis bifida (aerial part), Galium verum (whole plant), Ganoderma lucidum (whole plant), Ixeris chinensis (whole plant), Malva verticillata (aerial part), Polygonum senticosum (whole plant), Rebes mandshricum (branch), and Taraxacum mongolicum (aerial part), showed significant protective effects against glutamate-induced oxidative damage in HT22 cells.
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문제 정의
식물들이 분포하고 있다.6) 따라서, 본 연구는 위와같은 다양한 백두산 식물 자원의 MeOH 추출물로부터 글루타메 이트를 산화적 스트레스 유발 물질로 사용하여 , 이에 대한 뇌 세포 보호 활성을 탐색하였으며, 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
4) 생쥐의 해마유래 세포주인 HT22 세포주는 글루타메이트 수용체가 없는 세포주로서 글루타메이트와 함께 처리할 때 신경흥분독성 이 아닌 산화적 스트레스로 인하여 세포가 손상을 받으며, 산화적 스트레스로 인한 퇴행성 뇌질환 연구에 있어서 유용한 실험 모델 중의 하나로 알려져 있다.$ 본 연구에서는 글루타메이트로 독성을 유발한 생쥐의 해마유래 세포주인 HT22 세포주를 대상으로 백두산 자생식물 추출물이 세포 생존율에 대한 증가 여부를 관찰하여 뇌 세포 보호 활성을 평가하였다.
생쥐 흐!]마 세포 유래의 HT22 세포주에 처리한 후 세포 생존율을 증가시키는 주줄물을 검색하였다. 종 78종의 백두산 식물 MeOH 추출물을 각각 100, 300 μg/ml의 농도에서 뇌 세포 보호효과를 검색한 결과를 Table I 에 나타내었다.
대한 보호활성 측정은 정 등의 방법"에 따라 실시하였다. 간략하게 설명하면, HT22 세포 Qx10’cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (lOOIU/ml)와 streptomycin (100 ng/ml)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO, 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 백두산 식물 MeOH추출물의 시료 용액 (100, 300 μg/ml)과 5 mM 글루타메이트를 처리한 후 12시간 동안 5% CO, 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였고, 양성대조약물로는 Trolox (100 pM)를 사용하였다. 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포보호율을 평균치로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
간략하게 설명하면, HT22 세포 Qx10’cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (lOOIU/ml)와 streptomycin (100 ng/ml)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO, 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 백두산 식물 MeOH추출물의 시료 용액 (100, 300 μg/ml)과 5 mM 글루타메이트를 처리한 후 12시간 동안 5% CO, 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였고, 양성대조약물로는 Trolox (100 pM)를 사용하였다. 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포보호율을 평균치로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
대상 데이터
- 생쥐 해마유래 HT22 세포주는 묵인희 교수 (서울대학교)로부터 분양하여 사용하였으며, 글루타메이트로 독성을 유발한 세포주에 대한 보호활성 측정은 정 등의 방법"에 따라 실시하였다. 간략하게 설명하면, HT22 세포 Qx10’cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (lOOIU/ml)와 streptomycin (100 ng/ml)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO, 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 백두산 식물 MeOH추출물의 시료 용액 (100, 300 μg/ml)과 5 mM 글루타메이트를 처리한 후 12시간 동안 5% CO, 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였고, 양성대조약물로는 Trolox (100 pM)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 백두산 식물의 MeOH 추출물은 2007년 5월에 중국 연변대학교 약학대학에 제공 받았으며, 각각의 식물 MeOH 추출물은 DMSO에 녹여 50 mg/ ml의 농도로 stock solutione 제조하였으며 이를 DMEM 배지로 희석하여 사용하였다.
구입 하였다. L-glutamate, TfoIox와 3!-(4, 5-dimetfiyl- thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma 사에서 구입하였다. 96-WM tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다.
L-glutamate, TfoIox와 3!-(4, 5-dimetfiyl- thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma 사에서 구입하였다. 96-WM tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate R* eade 이용하여 측정하였다.
,a verticillata (aerial part), Rebes mandshricum (branch), Taraxacummongolicum (aerial part)의 9종 이었다. 한편, 대표적인 항산화 물질로 알려진 Trolox를 양성 대조약물로 사용하였으며 , 이 물질은 100 nM에서 76.4% 의 보호율을 나타내었다.
성능/효과
6%의 세포 보호율을 나타내어 가장 좋은 효과를 보였으며, 이를 포함한 32종의 추출물이 50% 이상의 세포 보호율을 나타내었다. 100 μg/ml의 농도에서는 Ribes mandshuricunet 가지 부분의 MeOH 추출물이 78.4%의 세포 보호율을 나타내어 가장 좋은 효과를 보였으며, 이를 포함한 22종의 추출물이 50% 이상의 세포 보호율을 나타내었다. 또한, 100, 300 μg/ml의 농도 모두에서 50% 이상의 세포 보호율을 나타낸 추출물은 13종 이었으며, 이 중 농도 의존적으로 세포보호율이 증가된 추출물은 Acer mono (leaf),Carduus crispus (aerial part), Galeopsis bifida (aerial part), Galium verum (whole plant), Ganoderma lucidum (whole plant), Ixeris chinensis (whole plant), Mal.
300 |ig/ml의 농도에서 Galeopsis bifldaS\ 지상부 MeOH추출물이 84.6%의 세포 보호율을 나타내어 가장 좋은 효과를 보였으며, 이를 포함한 32종의 추출물이 50% 이상의 세포 보호율을 나타내었다. 100 μg/ml의 농도에서는 Ribes mandshuricunet 가지 부분의 MeOH 추출물이 78.
후속연구
글루타메이트는 체내에서 cystine/glutamate transport system #을 통하여 cystine 섭취를 억제함으로서 glutathione level을 저하시키고 최종적으로 세포는 산화적 스트레스로 인한 손상을 받게 되며, 글루타메이트에 의한 산화적 스트레스가 뇌 세포손상을 일으키는 기전은 퇴행성 뇌 질환의 주요한 요인이기도 하다.8,9) 그러므로, 본 연구의 뇌 세포 보호 활성 검색을 통하여 그 효과가 인정된 9종의 백두산 식물 MeOH 추출물에 대해서는 활성 물질 분리 , 정제 연구와 각각의 뇌 보호 기전에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
참고문헌 (9)
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Lim, C. S., Jin, D. Q., Sung, J. Y., Lee, J. H., Choi, H. G., Ha, I. H. and Han, J. S. (2006) Antioxidant and anti-inflammatory activities of the methanolic extract of Neorhodomela aculeate in hippocampal and microglial cells. Biol. Pharm. Bull. 29: 1212-1216
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