[논문]글루타메이트로 유도된 쥐 해마 HT22 세포의 산화적 손상에 대한 서양민들레 지상부의 뇌신경세포 보호활성

리빈; 이동성; 최현규; 김경수; 지혜영; 노정미; 김기모; 김윤철

[국내논문] 글루타메이트로 유도된 쥐 해마 HT22 세포의 산화적 손상에 대한 서양민들레 지상부의 뇌신경세포 보호활성
Neuroprotective Effect of the Aerial Parts of Taraxacum officinale on Glutamate-induced Oxidative Injury in Mouse Hippocampal HT22 Cells 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.55 no.4, 2011년, pp.314 - 318

리빈 (원광대학교 약학대학) , 이동성 (원광대학교 약학대학) , 최현규 (원광대학교 약학대학) , 김경수 (원광대학교 약학대학) , 지혜영 (원광대학교 약학대학) , 노정미 (원광대학교 약학대학) , 김기모 (원광대학교 약학대학) , 김윤철 (원광대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Glutamate-induced oxidative injury contributes to neuronal degeneration in many central nervous system (CNS) diseases, such as epilepsy and ischemia. Inducible heme oxygenase (HO)-1 acts against oxidants that are thought to play a role in the pathogenesis of these diseases. In the present study, we investigated the neuroprotective effects of the standard extracts of Taraxacum officinale Weber, one of the original plants of Taraxaci Herba, on glutamate-induced oxidative injury in mouse hippocampal HT22 cells. The standard EtOH extract of the aerial parts of T. officinale (NNMBS270) showed significant cytoprotective effects on glutamate-induced neurotoxicity and induced the expression of heme oxygenase (HO)-1 in the mouse hippocampal HT22 cells, while the roots' extract (NNMBS271) did not show neuroprotective effect. These results suggest that the extract of the aerial parts of T. officinale could be an effective candidate for the treatment of ROS-related neurological diseases.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

officinale의 지상부와 뿌리의 EtOH 추출물을 이용한 in vitro 뇌 보호 활성을 검색하였다. 그 결과 T. officinale의 지상부 EtOH 추출물(NNMBS270)이 Heme oxygenase-1의 발현을 통하여 뇌 세포 보호 효과를 가지는 것을 확인하였고, 그 결과를 보고하고자 한다.
본 연구에서는 뇌 세포 보호 활성을 나타내는 새로운 물질을 찾기 위하여 포공영 기원 식물인 T. officinale의 지상부와 뿌리의 EtOH 추출물을 이용한 in vitro 뇌 보호 활성을 검색하였다. 그 결과 T.
본 연구에서는 포공영 기원식물인 T. officinale의 뇌세포 보호효과와 항산화 효과를 측정하고자 생쥐의 해마 유래 HT22 세포에서 글루타메이트 세포독성으로부터의 뇌 세포 보호 효과를 검색하였다. 각 시료를 농도별로 12 시간 처리한 결과 T.

제안 방법

^14,15) 글루타메이트가 유발하는 신경세포 손상은 크게 두 가지 요인으로 구분할 수 있는데, 글루타메이트 수용체의 과다흥분에 의한 독성과 글루타메이트 수용체의 매개 없이 산화적 스트레스를 유발하여 세포에 손상을 미치는 것이다.^16,17) 본 실험에서는 글루타메이트의 수용체가 결여되어있는 쥐의 해마유래인 HT22 세포주를 사용하여 글루타메이트 처리시 수용체 과다 흥분에 의한 독성이 아닌 산화적 스트레스로 인한 세포의 손상을 확인 할 수 있도록 하였다.¹⁸⁾
HT22 세포(2×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G(100 IU/ml)와 streptomycin(100 µg/ml)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 각각의 시료 용액(50, 100, 200, 400 µg/ml)과 5 mM 글루타메이트를 처리한 후 12시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였으며, 양성대조약물로는 Trolox 50 µM를 사용하였다.
HT22 세포를 60 mm dish에 3×105 cells/well 밀도로 24시간 배양한 후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다.
T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)의 뇌세포 보호 효과가 HO-1의 발현유도와 직접적인 관련이 있는지를 확인하기 위하여, HO-1 활성 억제제인 SnPP를 사용하여 세포생존율 측정 실험을 진행하였다. 세포생존율 측정 실험에서 가장 훌륭한 세포보호 효과를 보여준 농도 400 µg/ml로 T.
T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)의 세포보호효과가 산화적 스트레스로부터의 뇌세포 보호 기전에 관여하는 중요한 단백질인 HO-1의 발현에 기인하는 것이 아닌지 알아보기 위하여 T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)을 농도별(50~400 µg/ml)로 12시간 동안 HT22 세포에 처리하여 그 발현 양상을 Western Blot 분석법으로 확인하였다.
HT22 세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 14,000×g에서 25분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 nitrocellulose membrane(NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer(0.
또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포 보호율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
세포생존율 측정 실험에서 가장 훌륭한 세포보호 효과를 보여준 농도 400 µg/ml로 T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)을 처리하고 SnPP를 함께 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 실험을 진행하였다.
96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.

대상 데이터

L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
DMEM 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였으며, fetal bovine serum(FBS)는 Hyclone Laboratories사에서 구입하였다. L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
T. officinale 뿌리의 EtOH 추출물(NNMBS271)은 아무런 작용이 없는 반면, T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)은 200 µg/ml에서 발현을 보이기 시작하면서 농도가 증가함에 따라 HO-1의 발현이 농도 의존적으로 현저하게 증가하였다(Fig. 2), HO-1의 발현 측정 실험에서 양성 대조약물로 HO-1 발현 유도 물질인 CoPP 20 µM을 사용하였다.
T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)의 처리 농도가 증가함에 비례하여 세포 생존율이 농도 의존적으로 점차 증가하였으며, 세포 생존율 실험의 유의성 확인을 위한 양성 대조약물로는 항산화 물질로 알려진 trolox 50 µM을 사용하였다.
본 실험에 사용한 Taraxacum officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)과 뿌리의 EtOH 추출물(NNMBS271)은 천연물 신약 표준화 소재은행에서 분양 받아 사용하였다.
생쥐 해마유래 HT22 세포주는 묵인희 교수(서울대학교)로부터 분양하여 사용하였으며, 글루타메이트로 독성을 유발한 세포주에 대한 보호활성 측정은 정²³⁾ 등의 방법에 따라 실시하였다. HT22 세포(2×10⁵ cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G(100 IU/ml)와 streptomycin(100 µg/ml)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 각각의 시료 용액(50, 100, 200, 400 µg/ml)과 5 mM 글루타메이트를 처리한 후 12시간 동안 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였으며, 양성대조약물로는 Trolox 50 µM를 사용하였다.

데이터처리

, San Diego, CA)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.
본 실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다.

성능/효과

officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)을 처리하고 SnPP를 함께 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 실험을 진행하였다. SnPP를 처리하지 않은 군은 T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)에 의하여 세포생존율이 증가하였으나, SnPP를 함께 처리한 군에서는 세포생존율이 현저하게 감소하였다(Fig. 3). 함께 처리한 SnPP 50 µM 자체는 세포생존에 큰 영향을 미치지 않았다.
함께 처리한 SnPP 50 µM 자체는 세포생존에 큰 영향을 미치지 않았다. T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)에 의해 증가 했던 세포 보호활성이 HO-1의 억제제인 SnPP로 인해 감소되는 것을 통하여 T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)은 HO-1을 발현함으로서 뇌세포 보호활성을 나타내는 것을 확인 하였다. 한편, T.
각 시료를 농도별로 12 시간 처리한 결과 T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)이 세포 독성이 나타나지 않은 농도(100~400 µg/ml)에서 글루타메이트로 인한 독성으로부터 유의한 뇌 세포보호 활성을 보였다(Fig. 1).
본 연구는 포공영 기원 식물의 뇌 세포 보호활성과 그 메커니즘을 탐색하였으며 그 결과 T. officinale 지상부의 EtOH 추출물(NNMBS270)이 글루타메이트로 유발한 HT22 세포주에 대해 훌륭한 보호 활성을 나타냈으며, 항산화 및 세포보호 효소인 HO1 단백질을 발현함으로써 뇌 세포보호활성을 나타내는 메커니즘을 규명하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	HO 유도체인 HO-1과 일산화탄소, 철, billiverdin의 약리적 효과는 무엇인가?	Heme oxygenase(HO)는 세포의 항산화 시스템에서 중요한 역할을 담당하는 단백질로서, HO 유도체 중 유도 가능한 형태인 HO-1은 세포내의 heme을 분해하여 일산화탄소, 철, billiverdin 을 만든다.19) 이렇게 분해된 세 가지 형태의 생성물들과 HO-1 그 자체는 세포손상 및 사멸의 억제, 항염증 및 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 최근에는 뇌 보호 기전 중, Heme oxygenase-1과 그 부산물들의 항산화작용을 비롯한 다양한 생리활성으로 인하여 뇌 세포 보호에 관여하게 되는 것으로 현재 많은 연구가 진행되고 있다.
	포공영이란 무엇인가?	포공영(Taraxaci Herba)은 국화과(Compositase)에 속하는 민들레의 생약명이며 한방에서는 예로부터 해열, 발한, 건위, 강장해독, 임파선염, 급성 기관지염, 위염, 간염, 담낭염, 부인병 등의 치료에 사용 되어 왔다.1-3) 포공영은 taraxasterol, taraxerol, arnidiol, lutein, flavoxanthine, lutein, violaxanthin, plastoquinone 등 성분을 함유하고 있으며 특히 guainolide sesquiterpene인 desacetylmatricarin(austricin)은 항 알레르기 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
	포공영은 한방에서 어떠한 병의 치료에 사용되어져 왔나?	포공영(Taraxaci Herba)은 국화과(Compositase)에 속하는 민들레의 생약명이며 한방에서는 예로부터 해열, 발한, 건위, 강장해독, 임파선염, 급성 기관지염, 위염, 간염, 담낭염, 부인병 등의 치료에 사용 되어 왔다.1-3) 포공영은 taraxasterol, taraxerol, arnidiol, lutein, flavoxanthine, lutein, violaxanthin, plastoquinone 등 성분을 함유하고 있으며 특히 guainolide sesquiterpene인 desacetylmatricarin(austricin)은 항 알레르기 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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