HT22 해마세포의 oxidative toxicity에 대한 천문동 유래 에탄올추출물의 보호 효과 Ethanol Extract from Asparagus Cochinchinensis Attenuates Glutamate-Induced Oxidative Toxicity in HT22 Hippocampal Cells원문보기
본 연구는 oxidative stress에 의한 세포죽음 분석의 이상적인 모델로 사용되는 HT22세포를 이용하여 천문동 에탄올추출물의 glutamate에 의한 oxidative toxicity에 대한 신경보호 효과를 살펴보았다. 이를 위해 cell viability, lactate dehydrogenase (LDH), 그리고 세포죽음형태, reactive oxygen species (ROS), mitochondria membrane potential (MMP) 등에 대한 flow cytometry 및 Western blot분석을 이용하였다. 천문동 추출물의 처리는 cell viability 및 LDH분석에서 glutamate에 의한 cell toxicity를 저하시키며, 특히 apoptotic cell death를 현저히 감소시켰다. ROS 및 MMP분석 결과, 천문동 추출물은 ROS의 형성을 저하시키며 glutamate에 의해 저하된 MMP를 현저히 회복시켜 주었다. 이와 관련된 단백질 발현을 보면, 천문동 추출물은 PARP 및 HO-1의 발현을 억제하였다. 이상의 결과는 천문동 추출물이 HT22해마세포에서 ROS형성저해 및 MMP회복에 의해 세포죽음을 완화시켜 보호작용을 하는 것으로 사료되며 oxidative toxicity관련 질환에 적용 가능할 것으로 보여 진다.
본 연구는 oxidative stress에 의한 세포죽음 분석의 이상적인 모델로 사용되는 HT22세포를 이용하여 천문동 에탄올추출물의 glutamate에 의한 oxidative toxicity에 대한 신경보호 효과를 살펴보았다. 이를 위해 cell viability, lactate dehydrogenase (LDH), 그리고 세포죽음형태, reactive oxygen species (ROS), mitochondria membrane potential (MMP) 등에 대한 flow cytometry 및 Western blot분석을 이용하였다. 천문동 추출물의 처리는 cell viability 및 LDH분석에서 glutamate에 의한 cell toxicity를 저하시키며, 특히 apoptotic cell death를 현저히 감소시켰다. ROS 및 MMP분석 결과, 천문동 추출물은 ROS의 형성을 저하시키며 glutamate에 의해 저하된 MMP를 현저히 회복시켜 주었다. 이와 관련된 단백질 발현을 보면, 천문동 추출물은 PARP 및 HO-1의 발현을 억제하였다. 이상의 결과는 천문동 추출물이 HT22해마세포에서 ROS형성저해 및 MMP회복에 의해 세포죽음을 완화시켜 보호작용을 하는 것으로 사료되며 oxidative toxicity관련 질환에 적용 가능할 것으로 보여 진다.
We investigated the neuroprotective effect of an ethanol extract from Asparagus cochinchinensis (AC) against glutamate-induced toxicity in the HT22 hippocampal cell, which is an ideal in vitro model for oxidative stress. The neuroprotective effects of AC in HT22 cells were evaluated by analyzing cel...
We investigated the neuroprotective effect of an ethanol extract from Asparagus cochinchinensis (AC) against glutamate-induced toxicity in the HT22 hippocampal cell, which is an ideal in vitro model for oxidative stress. The neuroprotective effects of AC in HT22 cells were evaluated by analyzing cell viability, lactate dehydrogenase (LDH), flow cytometry for cell death types, reactive oxygen species (ROS), mitochondria membrane potential (MMP), and Western blot assays. In the cell death analysis, AC treatment resulted in significantly attenuated glutamate-induced loss of cell viability with a decrease in LDH release. AC treatment also reduced glutamate-induced apoptotic cell death. In the ROS and MMP analysis, AC treatment inhibited the elevation of intracellular ROS induced by glutamate exposure and the disruption of MMP. In oxidative stress-related proteins analysis, AC treatment inhibited the expression of poly ADP ribose polymerase and heme oxygenase-1 by glutamate. These results indicate that AC exerts a significant neuroprotective effect against glutamate-induced hippocampal damage by decreasing ROS production and stabilizing MMP. Thus, AC potentially provides a new strategy for the treatment of oxidative stress-related diseases.
We investigated the neuroprotective effect of an ethanol extract from Asparagus cochinchinensis (AC) against glutamate-induced toxicity in the HT22 hippocampal cell, which is an ideal in vitro model for oxidative stress. The neuroprotective effects of AC in HT22 cells were evaluated by analyzing cell viability, lactate dehydrogenase (LDH), flow cytometry for cell death types, reactive oxygen species (ROS), mitochondria membrane potential (MMP), and Western blot assays. In the cell death analysis, AC treatment resulted in significantly attenuated glutamate-induced loss of cell viability with a decrease in LDH release. AC treatment also reduced glutamate-induced apoptotic cell death. In the ROS and MMP analysis, AC treatment inhibited the elevation of intracellular ROS induced by glutamate exposure and the disruption of MMP. In oxidative stress-related proteins analysis, AC treatment inhibited the expression of poly ADP ribose polymerase and heme oxygenase-1 by glutamate. These results indicate that AC exerts a significant neuroprotective effect against glutamate-induced hippocampal damage by decreasing ROS production and stabilizing MMP. Thus, AC potentially provides a new strategy for the treatment of oxidative stress-related diseases.
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문제 정의
천문동 추출물의 신경보호 가능성에 대한 연구와 더불어[22, 28], 본 연구팀은 동의보감의 textmining기법을 통한 선험 연구에서 천문동을 인지기능 향상에 관여하는 한약재로서 선별하였으며 기본적인 기능검색에서 해마신경세포 보호의 가능성을 탐지하였다. 따라서 본 연구는 천문동 추출물이 산화적 스트레스에 대한 해마신경세포 보호기능을 나타냄으로서 이와 관련된 질환에 적용가능한지를 알아보기 위하여 HT22 해마세포를 이용하여 세포죽음, ROS형성 및 mitochondria membrane potential (MMP) 및 Western blot 분석을 통해 신경보호효과를 연구하였다.
제안 방법
MTT분석을 통해 천문동 추출물의 전처리가 glutamate에 의한 세포독성에 대한 영향을 알아보았다. Fig.
그런 다음, 37℃인 어두운 곳에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 씻은 후, 세포 내 fluorescence는 flow cytometer를 사용하여 측정하였으며 각 sample당 1,000개의 cell들을 얻어 분석하였다.
Cells were pretreated with two concerntrations (10 and 100 μg/ml) of AC for 24 hr, followed by exposure to 5 mM glutmate for 24 hr. The MMP was examined using TMRE staining by flow cytometry (A). Quantitative analysis of the histograms expressed as the percentage of mitochondrial inner membrane potential in HT22 cells (B).
그 다음, 400 μl의 binding buffer을 더 넣어 각 sample들을 flow cytometer (FACS CantoTMⅡ; Becton-Dickinsom, San Jose, CA, USA)을 사용하여 분석하였다.
그 후 0.8-μm Whatman 여과지(No.2)로 두번 여과하고 40℃ water bath에서 rotary evaporator을 사용하여 농축하였고 마지막으로 동결건조 하였다.
MMP측정하기 위해 TMRE를 100 nM의 농도로 희석한 PBS 600 μl를 섞은 뒤 30분동안 37℃조건의 어두운 장소에서 배양하였다. 그런 다음, 세포들을 PBS로 2번 씻고 flow cytometer를 사용하여 각 sample들을 분석하였으며 sample에서 10,000개의 cell을 얻어 분석하였다.
이 후, horseradish peroxidase로 이루어진 이차항체를 1시간 동안 배양시켰다. 모든 특정단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence system (Pierce Biotech, Rockford, IL, USA)를 사용하여 볼 수 있게 하였고 Image Quant LAS-4000 imaging system (GE healthcare Life Science, Uppsala, Sweden)을 사용하여 사진을 찍었다.
가 유지되는 incubator에서 배양하였다. 세포는 실험적인 처리 전 24시간 동안 배양하였으며 그 후, 여러 농도의 천문동 추출물을 24시간 동안 전처리하였다. 이후 5 mM glutamate를 천문동 추출물과 함께 24시간 동안 처리하였다.
세포손상으로 인해 분비되는 LDH는 LDH kit (CytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity assay, Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였다.
세포죽음의 유형을 분석하기 위해 Annexin Ⅴ/PI staining을 사용하여 flow cytometer분석을 실시하였다. 세포생존율에서 유의성을 보이는 10 μg/ml 및 100 μg/ml의 농도를 사용하였다.
세포는 실험적인 처리 전 24시간 동안 배양하였으며 그 후, 여러 농도의 천문동 추출물을 24시간 동안 전처리하였다. 이후 5 mM glutamate를 천문동 추출물과 함께 24시간 동안 처리하였다.
천문동 추출물의 관련 단백질발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, glutamate를 처리한 후 4, 8, 12, 24시간별로 세포죽음의 caspase-3 및 PARP, 산화적 스트레스의 HO-1, 그리고 미토콘드리아융합과 세포죽음의 Opa-1 등 관련 단백질의 발현을 연구하였다. Fig.
천문동 추출물이 glutamate에 의한 ROS생성에 미치는 영향을 detection reagents를 사용하여 측정하였다. Fig.
대상 데이터
(Gyeongsan, Korea)에서 구입하였고 나머지 세포주 배양을 위한 시약들은 Gibco/Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. Caspase-3, poly ADP ribose polymerase (PARP)에 대한 항체들은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Heme oxygenase-1 (HO-1) 항체는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였으며 optic atrophy 1 (Opa-1) 항체는 BD Bioscience (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS)은 Welgene Inc. (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였고 나머지 세포주 배양을 위한 시약들은 Gibco/Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
천문동(Asparagus cochinchinensis)의 말린 덩이줄기는 화림제약(Pusan, Korea)에서 구입하였다. 에탄올 추출물은 마른 천문동 100 g을 70% 에탄올 300 ml에 3시간 간격으로 유리막대로 저어서 하루 동안 실온에 침전하였다.
데이터처리
각 실험 데이터는 백분율과 mean ± SEM으로 나타내었고 모든 측정값은 One-way ANOVA를 실시하여 F값을 구하고 Turkey’s test를 이용하여 유의성을 검증하였다.
실험 자료 분석은 SigmaPlot statistical program version 11.2 프로그램(Systat Software, San Jose, CA, USA)을 사용하였다. 각 실험 데이터는 백분율과 mean ± SEM으로 나타내었고 모든 측정값은 One-way ANOVA를 실시하여 F값을 구하고 Turkey’s test를 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
HT22세포에 대한 생존율은 MTT분석을 이용하여 측정하였다. 마지막 추출물처리가 끝난 후, 배지를 제거하고 DMEM에 희석한 0.
성능/효과
세포생존율에서 유의성을 보이는 10 μg/ml 및 100 μg/ml의 농도를 사용하였다. Apoptotic cell death와 necrotic cell death는 대조군의 0.87%와 1.83%에 비해 glutamate처리군에서 29.3%와 16.4%로 유의성 있게 증가하였으며 apoptotic cell death가 더욱 현저하였다. 그러나 천문동 추출물의 처리는 Fig.
본 실험의 산화적 세포죽음과 관련된 대표적인 단백질의 발현을 살펴 본 결과, 천문동 추출물의 처리는 전체 caspase-3의 발현 증가와 더불어 PARP발현의 감소를 보였다. Caspase3의 cleavged된 활성은 관찰할 수 없었으나, 전체 caspase-3의 양 및 PARP를 보아 간접적인 활성저하를 유추할 수 있었다. 또한 glutamate에 의해 증가된 HO-1은 천문동 추출물에 의해 감소하였으며, 이와 반대로 Opa-1은 glutamate처리 후반부에 증가하였다.
천문동 추출물의 관련 단백질발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, glutamate를 처리한 후 4, 8, 12, 24시간별로 세포죽음의 caspase-3 및 PARP, 산화적 스트레스의 HO-1, 그리고 미토콘드리아융합과 세포죽음의 Opa-1 등 관련 단백질의 발현을 연구하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 glutamate처리 후 24시간에 total caspase-3의 발현이 23%로 감소하나 천문동 추출물에 의해 45%로 회복되며, 12 및 24시간에 천문동 추출물에 의해 PARP발현의 감소를 볼 수 있었으며 HO-1도 유사한 양상을 보였다. Opa-1은 glutamate처리에 의해 감소하고 12시간 후 140%로 일시적 증가를 보였으나, 천문동 추출물은 24시간째에 143%로 증가시키는 것을 확인하였다.
5에서 보는 바와 같이 glutamate처리 후 24시간에 total caspase-3의 발현이 23%로 감소하나 천문동 추출물에 의해 45%로 회복되며, 12 및 24시간에 천문동 추출물에 의해 PARP발현의 감소를 볼 수 있었으며 HO-1도 유사한 양상을 보였다. Opa-1은 glutamate처리에 의해 감소하고 12시간 후 140%로 일시적 증가를 보였으나, 천문동 추출물은 24시간째에 143%로 증가시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 보아 천문동 추출물은 관련 단백질 발현을 조절함으로서 신경세포 보호작용을 나타냄을 알 수 있었다.
본 연구의 MTT 및 LDH분석결과, 천문동 추출물은 glutamate에 의한 신경독성으로부터 보호하는 효과가 있음을 확인할 수 있으며 oxidative toxicity으로부터 보호 기능을 알 수 있었다. 나아가 세포죽음에 대한 유형 분석을 위한 Annexin Ⅴ와 PI 염색에 의한 flow cytometer분석 결과, 천문동 추출물은 apoptotic cell death를 현저히 감소시킴을 확인 할 수 있었다.
높은 ROS농도는 미토콘드리아에서 MMP에 영향을 미쳐 proton기울기와 membrane depolarization의 소실을 형성한다[23]. 따라서 미토콘드리아 membrane potential을 측정하기 위해 TMRE staining 분석을 사용한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 glutamate처리군에서 1.42%로 현저한 TMRE fluorescence의 감소를 볼 수 있었다. 그러나 천문동 추출물을 처리하였을 때 특히 100 μg/ml 농도에서 82.
8%로 유의성 있게 감소하였다. 또한, necrotic cell death도 천문동 추출물의 두 가지 농도 모두에서 5.27%와 5.53%로 유의성 있게 감소하였다. 이상의 결과는 천문동 추출물이 glutamate에 의한 apoptotic cell death와 necrotic cell death를 억제함으로서 신경세포 보호효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
본 실험의 산화적 세포죽음과 관련된 대표적인 단백질의 발현을 살펴 본 결과, 천문동 추출물의 처리는 전체 caspase-3의 발현 증가와 더불어 PARP발현의 감소를 보였다. Caspase3의 cleavged된 활성은 관찰할 수 없었으나, 전체 caspase-3의 양 및 PARP를 보아 간접적인 활성저하를 유추할 수 있었다.
HT22세포에서도 glutamate에 의한 oxidative pathway를 통해 전형적인 oxidative toxicity를 일으키며[8, 27], 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병을 포함하는 신경퇴행성 과정에 중요한 특징 중 하나이다[16, 18]. 본 연구의 MTT 및 LDH분석결과, 천문동 추출물은 glutamate에 의한 신경독성으로부터 보호하는 효과가 있음을 확인할 수 있으며 oxidative toxicity으로부터 보호 기능을 알 수 있었다. 나아가 세포죽음에 대한 유형 분석을 위한 Annexin Ⅴ와 PI 염색에 의한 flow cytometer분석 결과, 천문동 추출물은 apoptotic cell death를 현저히 감소시킴을 확인 할 수 있었다.
즉 미토콘드리아의 permeability transition pore(MPTP)가 산화적 스트레스로 인해 일시적으로 열리게 되어 삼투압의 팽창, 기질 대산산물이 방출되면서 MMP의 붕괴가 일어난다[10, 11]. 본 연구의 ROS 및 MMP분석 결과를 살펴보면, 천문동 추출물은 glutamate에 의한 ROS생성을 현저히 감소시킬 뿐 아니라 미토콘드리아의 MMP를 조절함으로서 신경세포를 보호하는 것을 확인 할 수 있었다.
이러한 세포생존율을 LDH분석을 통해 재확인 한 결과, Fig. 1B에서 보는 바와 같이 glutamate처리군에서 71.9%로 증가하였으나 10, 50 및 100 μg/ml 농도의 천문동추출물 처리는 LDH양을 각각 65.8%, 55.8% 및 46.4%로 유의성있게 감소시켰다.
또한 glutamate에 의해 증가된 HO-1은 천문동 추출물에 의해 감소하였으며, 이와 반대로 Opa-1은 glutamate처리 후반부에 증가하였다. 이로 보아 천문동 추출물은 산화적 스트레스와 관련된 단백질의 발현 또한 조절함으로서 신경세포 죽음에 대한 보호효과를 가진다는 것을 확인 할 수 있었다.
86%로현저히 감소시켰다. 이상의 결과는 천문동 추출물은 glutamate에 의한 ROS형성을 저해함으로서 신경세포 보호작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.
4%로 유의성있게 감소시켰다. 이상의 결과는 천문동 추출물이 HT22세포에서 glutamate에 의한 독성에 대해 보호효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
53%로 유의성 있게 감소하였다. 이상의 결과는 천문동 추출물이 glutamate에 의한 apoptotic cell death와 necrotic cell death를 억제함으로서 신경세포 보호효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
74%로 증가하므로 대조군과 유사한 membrane potential을 나타내었다. 이상의 결과로 보아 천문동 추출물은 glutamate에 의한 미토콘드리아 MMP를 회복시킴으로서 미토콘드리아의 손상를 저해하여 신경세포 보호작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.
Opa-1은 glutamate처리에 의해 감소하고 12시간 후 140%로 일시적 증가를 보였으나, 천문동 추출물은 24시간째에 143%로 증가시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 보아 천문동 추출물은 관련 단백질 발현을 조절함으로서 신경세포 보호작용을 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 결과로 보아, 천문동 추출물은 해마세포에서 glutamate에 의한 oxidative toxicity에 대해 ROS형성저해 및 MMP 회복에 의해 세포죽음을 완화시킴으로서 신경세포 보호작용을 나타내는 것으로 생각된다. 이러한 천문동 추출물의 해마신경세포 보호작용은 glutamate에 의한 산화적 독성에 의해 나타내는 뇌졸중, 파킨스병, 알츠하이머병 등과 같은 퇴행성 신경질환 및 인지장애에 대한 치료와 예방에 적용 가능한 약재로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Glutamate이란?
Glutamate는 척추동물의 신경계에서 가장 널리 분포하는 대표적인 흥분성 신경전달물질로서[20], 이의 과분비는 신경독성 즉 excitotoxicity를 유발하며 허혈성 뇌졸중, 간질, 알츠하이머병, 파킨스병 등 다양한 뇌질환에 관여한다[4, 8]. 신경세포에서 glutamate에 의한 독성은 두 가지 주된 경로와 관련되어 있다.
Glutamate의 과분비가 인체에 미치는 영향은?
Glutamate는 척추동물의 신경계에서 가장 널리 분포하는 대표적인 흥분성 신경전달물질로서[20], 이의 과분비는 신경독성 즉 excitotoxicity를 유발하며 허혈성 뇌졸중, 간질, 알츠하이머병, 파킨스병 등 다양한 뇌질환에 관여한다[4, 8]. 신경세포에서 glutamate에 의한 독성은 두 가지 주된 경로와 관련되어 있다.
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