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문제 정의
- 이에 저자는 이전 연구를 토대로 처방한 한약복합처방(Herb-Combined Remedy, HCR) 이 당뇨병 유발 흰쥐의 혈당 및 당뇨병성 신증에 미치는 영향을 실험적으로 구명하기 위하여, 실험동물에 당뇨병을 유발하고, HCR의 투여 기간에 따른 혈당 변화를 확인하고, HCR 의 경구 투여가 끝난 후 흰쥐의 심장에서 채취한 혈액으로부터 BLWBlood urea nitrogen) 및 Creatinine 함량을 측정하고 신장 조직의 조직병리학적 소견을 광학현미경으로 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2주간의 HCR 투여가 끝난 후 흰쥐를 희생시키고 신장조직을 적출하였다. 적출된 신장조직은 10% 포르말린(formalin)에 3일 동안 담가뚠 후 자일렌(xylene) 을 이용하여 탈수 시켰다.
- 2주간의 구강 투여가 끝난 후, 흰쥐로부터 심장 채혈의 방법으로 혈액을 얻었다. 얻어진 혈액은 원심분리기(VS~L5, OOON, Vision, Korea)를 이용하여 3, 000rpm 에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 버리고 상층액을 취하였다.
- HCR의 혈당 조절 기전의 이해를 돕기 위하여 약물을 투여하고 4시간 동안 공복시 혈당 변화 추이를 살펴보았다. 그 결과 정상군에서는 90분째에 기저치에 이르러 그 이후로는 특별한 변화가 없는데 반해, 당뇨병대조군은 4시간 동안 공복시 혈당의 변화가 거의 없었다.
- Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. OD값(Optical density)의 측정을 위하여 분광광도계(U-2800, Hitachi, Japan)를 사용하였으며, 육안적 관찰을 위하여 광학현미경 (Olympus, Japan)을 사용하였다.
- Streptozotocin(Sigma, USA)의 1회 보강 추사법을 이용하여 당뇨병을 유발하였다. 0.
- 경구 투여하였다. 당뇨병 대조군(Control group, n=6)은 당뇨병을 유발시킨 후, hi比의 증류수(D/W)를 하루 1회 경구 투여하였다. 한약복합처방군(HCR group, n=6)은 당뇨병을 유발시킨 후 600㎎/㎏의 농도로 녹인 HCR용액을 1皿씩 하루 1회 경구 투여하였다.
- 1M 의 citrate buffer 500, 枫를 복강 주사하였다. 대조군(Consol group)과 실험군은 STZ을 0.1M의 citrate buffer 에 녹여 복강 주사로 당뇨병을 유발하였다. 자세한 실험군의 분류는 다음과 같다.
- 본 논문에서는 Streptozotocin(STZ)을 이용하여 실험동물에 당뇨병을 유발하였다. STZe 주로 췌장의 P 세포만을 선택적으로 파괴함으로써 당뇨병을 유발시킨다고 알려져 있다.
- 실험군에 약물을 경구 투여하고 실험 첫날 및 경구투여 1주 후 그리고 2주간의 경구투여가 끝난 후에 고형사료를 제거하고 최소한 12시간이 경과한 후, 혈당측정기(Roche, Germany)를 이용하여 공복시 혈당(Fasting Blood Glucose, FBG)을 측정하였다. 체중은 고형사료와 음용수를 투여하기 전에 전자저울을 이용하여 측정하였다.
- 한약복합처방군(HCR group, n=6)은 당뇨병을 유발시킨 후 600㎎/㎏의 농도로 녹인 HCR용액을 1皿씩 하루 1회 경구 투여하였다. 양약 대조군 (MF group, n=6) 에는 200㎎/㎏으로 녹인 글루코닐(Metformin)을 ]血씩 하루 1회 경구 투여하였다.
- 얻어진 혈액은 원심분리기(VS~L5, OOON, Vision, Korea)를 이용하여 3, 000rpm 에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 버리고 상층액을 취하였다. 얻어진 혈청에서 혈중 BUN 및 Creatinine 함량 측정은 전용 Kit올 아산제약(Incheon, Korea) 제품으로 측정하였다.
- 22um Syringe Filter(Whatman)로 걸러 줌으로써 멸균하였다. 이렇게 하여 얻어진 STZ용액을 40㎎/㎏ 의 분량으로 주 1회 총 2주간 복강 주사하였고, 정상굾은 동일한 양의 0.1M citrate buffer를 복강 주사하였다. 두 번째 복강 주사를 마친 48시간 후, 공복시 혈당을 측정한 결과 20飾#业가 넘는 쥐를 당뇨병이 유발되었다 생각하고 실험에 사용하였다.
- 정상군(Normal group, n=6)은 당뇨병을유발하지 않고, In比의 증류수(D/W)를 하루 1회 oral zonde를 이용하여 경구 투여하였다. 당뇨병 대조군(Control group, n=6)은 당뇨병을 유발시킨 후, hi比의 증류수(D/W)를 하루 1회 경구 투여하였다.
- 음수량을 측정하였다. 측정 단위는 24시간으로 전일 오후 6시 에 고형사료와 음용수를 공여 한 후 다음 날 6시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다.
- 적출된 신장조직은 10% 포르말린(formalin)에 3일 동안 담가뚠 후 자일렌(xylene) 을 이용하여 탈수 시켰다. 탈수된 조직으로 파라핀 블록을 만들고, 다시 박절하여 슬라이드 글라스에 부착시키고 hematoxylin과 eosin으로 염색한 후 광학 현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 한약복합처방(HCR)이 혈당 및 당뇨병성 신증 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 흰쥐에 STZ로 당뇨병을 유발한 다음 한약복합처방(HCR)을 경구 투여한 후 공복시 혈당변화, 음수량 식이 량, BUN, Creatinine 함량의 변화, 신장 조직의 조직병리학적 변화를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 당뇨병 대조군(Control group, n=6)은 당뇨병을 유발시킨 후, hi比의 증류수(D/W)를 하루 1회 경구 투여하였다. 한약복합처방군(HCR group, n=6)은 당뇨병을 유발시킨 후 600㎎/㎏의 농도로 녹인 HCR용액을 1皿씩 하루 1회 경구 투여하였다. 양약 대조군 (MF group, n=6) 에는 200㎎/㎏으로 녹인 글루코닐(Metformin)을 ]血씩 하루 1회 경구 투여하였다.
- 혈당 및 체중을 측정하기 하루 전날에 각각 식이량 및 음수량을 측정하였다. 측정 단위는 24시간으로 전일 오후 6시 에 고형사료와 음용수를 공여 한 후 다음 날 6시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다.
대상 데이터
- HCRe 저자가 임상에서 사용하고 있는 처방으로 이를 구성하는 총 11종의 약재는 동신대학교 목동한방병원에서 구입하였다. 처방의 내용은 Table 1과 같다.
- 上記한 총 11개 약물을 세말하여 산제로 조제된 HCR 은 경구 투여일의 하루 전날, 3차 증류수에 120mg/m£ 분량으로 녹여 준비하였다.
- 1M citrate buffer를 복강 주사하였다. 두 번째 복강 주사를 마친 48시간 후, 공복시 혈당을 측정한 결과 20飾#业가 넘는 쥐를 당뇨병이 유발되었다 생각하고 실험에 사용하였다. 약물의 투여기간은 총 2주간이었다.
- 실험동무은 160-180g의 Wistar계 수컷 흰쥐暑 샘타코(Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 실험이 진행되는 동안 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, Korea)와물을 충분히 공급하였다.
-
3) 실험군의 선정
정상군(Normal group)은 STZ을 녹이지 않은 0.1M 의 citrate buffer 500, 枫를 복강 주사하였다. 대조군(Consol group)과 실험군은 STZ을 0.
- 혈액 내의 BIM 및 Creatinine 함량은 각각의 Detection kit을 아산제약(Incheon, Korea) 제품을 구입하였으며, Streptozotocin(STZ, Sigma, USA) 및 Citric acid 등의 기타 시약은 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. OD값(Optical density)의 측정을 위하여 분광광도계(U-2800, Hitachi, Japan)를 사용하였으며, 육안적 관찰을 위하여 광학현미경 (Olympus, Japan)을 사용하였다.
데이터처리
- 0, USA)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 students t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot(Sigma plot for Windows, ver. 9.0, USA)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 students t-test로 검정하여 p-값이 0.
이론/모형
- 공복시 및 식이 유지 시 혈당측정을 위하여 ACCU-CHEK GO 혈당측정시스템(Roche, Germany)을 사용하였다. 혈액 내의 BIM 및 Creatinine 함량은 각각의 Detection kit을 아산제약(Incheon, Korea) 제품을 구입하였으며, Streptozotocin(STZ, Sigma, USA) 및 Citric acid 등의 기타 시약은 Sigma(St.
성능/효과
- 1. 공복시 혈당은 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 보였다.
- 2. 혈당 감소의 작용은 HCR을 투여한 후 120분째부터 시작되었다.
- 2주간 약물을 투여하면서 공복시 혈당 변화를 관찰 한 결과, HCR 투여군에서는 실험 1주차와 2주차 모두 유의한 공복시 혈당의 감소를 보였으나, 양약 대조군에서는 그렇지 못하였다. 양약 대조군은 1주차에 HCR 투여군 과거의 동일한 공복시 혈당을 보였으나, 2주차에는 HCR 군의 평균 혈당보다 높아지는 경향을 보였다(Table 2, Fig.
- 2주간의 실험 기간 동안 당뇨병이 유발된 모든 실험군에서 정상군에 비하여 증가된 식이량을 보였으나, HCR군과 Control군, MF군 사이에 통계적으로 유의한 식이량 및 음수량의 차이는 관찰되지 않았다(Table 4).
- 이와 유사한 기전으로 당뇨병을 일으키는 약물로는 alloxan이 있다②绑). 2회의 STZ 복강투여에 의하여 통계적으로 유의하게 증가된 공복시 혈당을 보였고, 또한 통계적으로 유의하게 증가된 식이량 및 음수량을 보이는 등 전형적인 인간에서의 당뇨병 질환을 잘 표현한 것으로 생각된다. 또 양약 대조군을 설정하여 HCR과 동일한 환경에서 투여하였는데, 이때 사용한 약물은 Metformin(MF)으로 Metformine Phenformin과 함께 Biguanide의 일종으로 간에서의 당신생을 억제함으로써 혈당을 감소시키고扣, 말초 조지에서 포도당의 이용을 증가시키며 지방산의 산화를 억제시키는 작용이 알려져 있다32).
- 3. 혈중 Creatininee 대조군에 비하여 유의한 감소를 보였다.
- 4. 신장 조직의 염증 빛 손상을 방지하는 결과를 보였다.
- 그 결과 정상군에서는 90분째에 기저치에 이르러 그 이후로는 특별한 변화가 없는데 반해, 당뇨병대조군은 4시간 동안 공복시 혈당의 변화가 거의 없었다. HCR 투여군은 구강투여 후 90분째까지는 상승하뉴:듯하다가 120분째부터 감소세로 나타났으며, MF 투여군은 60분째에 최고치를 기록하고 90분째부터 감소하는 경향을 나타내었다. 4시간 내의 공복시 혈당 변화 폭은 MF군이 가장 컸다(Table 5.
- 그 결과 정상군에서는 90분째에 기저치에 이르러 그 이후로는 특별한 변화가 없는데 반해, 당뇨병대조군은 4시간 동안 공복시 혈당의 변화가 거의 없었다. HCR 투여군은 구강투여 후 90분째까지는 상승하뉴:듯하다가 120분째부터 감소세로 나타났으며, MF 투여군은 60분째에 최고치를 기록하고 90분째부터 감소하는 경향을 나타내었다.
- 본 연구의 결과에서 HCR군 및 MF군 모두에서 유의한 체중 변화는 보이지 않았다. 그러나 2주간의 HCR 투여를 마치고 난 후의 평균 체중은 비록 유의하지는 않았지만 당뇨병 대조군에 비하여 20% 정도가 증가된 수치를 보였다(Table 3, Fig. 3}. 이러한 사실은 실험동물의 체중이 혈당 수치에 비하여 비교적 늦게 영향을 받는다는 점39을 감안할 때, 추후에 유의한 체중의 증가가 있을 가능성이 매우 높은 것으로 생각된다.
- 나타낸다는 사실을 알 수 있었다. 또한 상기한공복시 혈당 변화와 비교하여 볼 때, HCRe MF에 비하여 느린 반응을 보이며, 지속 효과는 더 뛰어날 수있다는 가능성을 확인할 수 있었다(Table 2. Fig. 2). 이러한 결과로부터 HCR의 공복시 혈당 조절 기전은 식이량 및 음수량 등의 외적 요인에 기인하는 것이 아니며(Table 4), 혈중 인슐린 농도에 특별한 영향을 미치지 않는다는 사실33)을 감안하면, HCRe 내당능 증가와 관련된 이차적 요인에 의해 당뇨병에서 혈당을 조절하는 것이라는 사실을 유추할 수 있다.
- 120분째부터 혈당 감소의 효력을 나타냈다. 또한 혈중 Creatinine을 유의하게 낮추었으며, 신장 조직의 염증 및 조직 손상을 방지하는 결과를 보였다.
- 지표로서 임상적 가치를 갖는다36). 본 논문의 결과를 살펴보면, 당뇨병 유발에 의하여 혈중 BUN 및 Creatinine 함량은 정상군에 비해 유의하게 상승하였다. HCR 투여군 및 MF 투여군에서 혈중 Creatinine 을 유의하게 감소시켰으나, BUN 함량에는 특별한 영향을 미치지 않았다(Table 6, 7.
- 본 논문의 결과에서 HCR 및 MF의 투여는 당뇨병 유발에 의하여 발생하는 신장의 염증 및 조직 손상을 방지하는 결과를 보였다(Fig. 7).
- 하나이다34). 본 연구의 결과에서 HCR군 및 MF군 모두에서 유의한 체중 변화는 보이지 않았다. 그러나 2주간의 HCR 투여를 마치고 난 후의 평균 체중은 비록 유의하지는 않았지만 당뇨병 대조군에 비하여 20% 정도가 증가된 수치를 보였다(Table 3, Fig.
- 약물 투여 14일째에 12시간 이상 금식시킨 후 오전 10시에 정상군 및 당뇨병 대조군에는 증류수를 구강 투여하고, HCR군 및 MF군에는 해당 약물을 구강투여 한 다음 시간별로 혈당 변화를 측정한 결과 HCR 군 및 MF군에서 당뇨병 대조군에 비하여 유의한 혈당의 감소가 관찰되었다(Table 5, Fig. 4).
- 2주간 약물을 투여하면서 공복시 혈당 변화를 관찰 한 결과, HCR 투여군에서는 실험 1주차와 2주차 모두 유의한 공복시 혈당의 감소를 보였으나, 양약 대조군에서는 그렇지 못하였다. 양약 대조군은 1주차에 HCR 투여군 과거의 동일한 공복시 혈당을 보였으나, 2주차에는 HCR 군의 평균 혈당보다 높아지는 경향을 보였다(Table 2, Fig. 2). 이러한 결과로부터 HCR이 혈중 인슐린 함량에 특별한 영향을 미치지 않음에도 불구하고33) 효율적인 혈당강하 작용이 있음을 알 수 있으므로, 작용시간 및 기전 면에서 Metformin과 다른 점이 있는 것으로 추정된다.
- 조직 손상이 관찰되었다. 염증 세포의 침윤을 비롯한 신장 조직 손상은 HCR 및 MF의 구강 투여에 의하여 소실되는 경향을 보였다(Fig. 7).
- 이러한결과로부터 HCRe 구강투여 후, 120분째부터 유효한 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다. 또한 상기한공복시 혈당 변화와 비교하여 볼 때, HCRe MF에 비하여 느린 반응을 보이며, 지속 효과는 더 뛰어날 수있다는 가능성을 확인할 수 있었다(Table 2.
- 이상의 결과들을 정리해보면, HCR의 투여는 대조군에 비해 공복시 혈당을 유의하게 낮추었으며, 투여후 120분째부터 혈당 감소의 효력을 나타냈다. 또한 혈중 Creatinine을 유의하게 낮추었으며, 신장 조직의 염증 및 조직 손상을 방지하는 결과를 보였다.
- 정상군에 비하여 당뇨병 유발군(Control)에서 공복 시 유의한 혈당의 증가를 관찰할 수 있었다. 이러한 공복 시 혈당 증가는 한약복합처방군(HCR)의 투여에 의하여 유의한 감소를 보였다.
후속연구
- 또한 이에 대한 지속적인 실험과 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이러한 결과들을 바탕으로 저자는 HCR이 혈중 인슐린 농도에 대한 일차적 영향이 아니라 내당능 증가와 관련된 이차적 요인에 의해 당뇨병에서 혈당과 체중을 조절할 수 있으며, 당뇨병성 신증으로의 전변을 예방하거나, 치료하는 데에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대한다.
- 이러한 결과들을 바탕으로 저자는 HCR이 혈중 인슐린 농도에 대한 일차적 영향이 아니라 내당능 증가와 관련된 이차적 요인에 의해 당뇨병에서 혈당과 체중을 조절할 수 있으며, 당뇨병성 신증으로의 전변을 예방하거나, 치료하는 데에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다. 또한 이에 대한 지속적인 실험과 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이상을 종합해 볼 때, HCRe 대체적으로 性味가 苦寒하며 淸熱, 滋陰, 生津하는 효능을 지닌 약물들로 구성되어 당뇨병의 치료에 유의할 만한 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
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