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문제 정의
- Elastase 활성저해실험.Elastase 활성저해실험은 elastin을 분해하는 elastase의 활성을 저하시키는 정도를 확인하기 위해 실시하였다. 시료의 제조는 coenzyme Q, Q, , Q3, Q3-L, Q3-C, (%와 Qi 0.
- 또한, Rajindar 등은 coenzyme Qo의 산화적 스트레스 억제기전은 coenzyme Q의 구조 중 isoprenoid chain에 의하여 산화적 스트레스를 감소시키는 것으로 연구되었으며, coenzyme Q9 또한 유사한 항산화적 활성이 있음을 확인하였다 하지만 피부노화에 대한 coenzyme Qn의 연구는 항산화 활성에만 대부분 연구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 isoprenoid 개수가다른 cgnzyme Qn 화합물들에 대하여 피부노화에 대한 다른부분의 연구를 실시하였다.
제안 방법
- Solanesyl bromide(66의 합성. 100 m/ 둥근바닥 플라스크에 질소 기류 하에서 solanesol(4.10g, 6.50 mmol)을 가하고 헥산 (20mZ)과 테트라히드로후란(3 m/)을 가하여 완전히 녹인 후 반응 온도를 -500로 조절하였다. 삼브롬화인 (1.
- 4- Dimethoxy-2, 5-bis(trimethylsilyloxy)-6-(isoprenyl-4- benzeiiesiilfoiiy])to]iieiie(5)의 합성. 50 ml 둥근바닥 플라스크에 d3i, 4m- ethoxy-2, 5-dihydroxy-6-(isoprenyl-4-benzene-sulfonyl) toluene(4)(2.00 g, 5.10 mmol)과 염화메칠렌(20m/>을 가하여 상온에서 완전히 용해시킨 후 트리메칠아민(4.3) 가하였다. 30℃ 이하에서 염화삼메칠실란(4.
- 합성. 50 ml 둥근바닥 플라스크에 염화메칠렌(10 mZ )을 가하고 2, 3, 4, 5-tetramethox>toluene(l)(l .00 g, 4.71 mmol)과 4-chloro- 2-methyl-1 -benzenesulfonyl-2-butene(2)(0.80 g, 327 mmol)을 용해시키고 무수 염화철(IH)(0.13g, 0.80 mmol)을 상온에서 가하였다. 반응물을 12시간 동안 환류시켰다.
- 합성. Coenzyme Qn 유도체들은 Scheme 1과 같이 합성하였다Coenzyme Q0의 합성 방법은 다음과 같으며 coenzyme Qi, coenzyme Q2, coenzyme Q3, coenzyme Q3-L, coenzyme Q3-C 및 coenzyme (%는 coenzyme Q(괴과 같은 방법으로 제조하였다.
- 복합체이다. Coenzyme Qn 화합물의 in vitro 상태에서 멜라닌 생성 저해 효과를 알아보았다. 이와 유사한 연구로 천 등의 2W quercetin이 melan-a 멜라닌세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향과 비교할 때 quercetine 10 μg/ 처리군에서 대조군보다 30%의 활성을 보인 것에 비해 coenzyme Q의 경우는 같은 농도에서 33%의 활성을 보여주었으며 1 μg/g에서도 28.
- 측정하였다. Murine melanoma(B-l 6/F1 5% CO, , 37℃ 하에서 24시간 배양한 후 hemocytometer로 측정한 결과 2.0x10° cells/m/ 가 되도록 배양액의 세포 농도를 조절하였다. 이를 6 well plate 에 세포수가 well당 1.
- 따라서, 본 연구에서는 isoprene unit가 다른 coenzyme Q, Q2, Q3, Q3-L, Q, -C. Q, 와 Qi을 scheme 1 과 같이 합성하였으며 세포 내 멜라닌 생성저해실험, elastase 활성저해실험과 collagenase 활성저해 실험 등을 실시하여 coenzyme Qn의 n수에 따른 구조와 생리활성 관계를 알아보았다.
- Collagenase 활성저해실험.긔) Collagenase 활성저해실험은 ninhydrin방법을 변형하여 측정하고자 하는 시료의 수만큼 collagen 30 mg을 15 m/ 튜브에 각각 가해준 뒤, coHagen이 들어 있는 튜브에 증류수 1 /와 N-tris[hydroxymethyl]methyl-2- aminoethansulfonic acid 12.6 g, calcium chloride 0.05 g을 가하여 제조한 N-tris[hydroxj.Tnethyl]-methyl-2-aminoethansulfonic acid buflfer를 3 m/씩 가하였다. 시료의 제조는 coenzyme Q, Q2, Q3, Q3-L, Q3-C, (%와 Qi 0.
- 대조물질은 시료 50 / 대신 같은 양의 무수 에탄올을 가하여 동일조건에서 반응을 시켰다. 반응 후 ELISA readere 사용하여 415nm에서 대조물질과 각 시료들의 흡광도 값을 측정하였다.
- 38 mmol)이 용해된 테트라히드로후란(20 mZ)을 10분 동안 가하였다. 반응액에 [1, 2-bis (diphenylphosphino)ethane]dicHoropalladium(nX0.03 g, 0.05 mmol) 을 가하고 온도를 4(PC로 유지하면서 12시간 교반하였다. 헥산 (10mZH 소금물(6 017>을 가하고 30분간 교반한 다음 유기층을 분리하고 진한 염산을 가하여 1시간 교반하였다.
- 001% 시료를 제조하였다. 배양 후 배양액을 제거한 후 4가지 농도의 시료 300/와 배지(5% fetal bovine serum) 2, 700를 각각의 well에 가해주고 5% CO, , 37℃ 하에서 3일 동안 배양하였다. 대조물질은 시료 대신 같은 양의 무수 에탄올을 가하여 동일 조건에서 실험하였다.
- 50 mmol)을 가하고 헥산 (20mZ)과 테트라히드로후란(3 m/)을 가하여 완전히 녹인 후 반응 온도를 -500로 조절하였다. 삼브롬화인 (1.76 g, 6.50 mmol) 에 테트라히드로후란(1.60 m/)을 혼합한 용액을 10분간 서서히 가한 후 피리딘 1~2방울 가하였다. 온도를 (TC로 조절하여 45 분 동안 교반하였다.
- 세포배양. 세포배양은 배양하고자하는 세포와 배지를 petri- dish에 넣은 후 CO, , 37℃ 배양기에서 배양하고 현미경과 hemocytometei를 이용하여 세포배양 상태와 세포수를 측정하였다. 초저온 냉동고에 보관 중이던 B-16/F1 세포를 35℃ 항온조에 옮겨 세포를 녹였다.
- 60 m/)을 혼합한 용액을 10분간 서서히 가한 후 피리딘 1~2방울 가하였다. 온도를 (TC로 조절하여 45 분 동안 교반하였다. 반응용액 온도를 -10℃S- 조절한 후 증류수(20m/M 초산에틸(15 01/>을 가하여 상온에서 30분간 교반 시킨 후 유기층을 분리하고 10% NaHCO3 용액(2μ17>을 가하여유기층을 세척하였다.
- 7 m/의 n-프로판올과 혼합하고 10분간 원심분리 (x 12, 000 rpm)하였다. 원심분리 후 상등액 200 를 취하여 96-well plate 에 옮겨준 뒤 ELISA reader를 사용하여 600 nm에서 대조물질과 각 시료들의 흡광도 값을 측정하였다.
- 이 세포 침전물을 6(TC에서 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1 M 수산화나트륨 100 를 가하여 시료들을 희석한 후 60℃ 항온 조에서 7]온하면 노란색 용액이 된다. 이 용액을 ELISA readere 사용하여 400nm에서 대조물질과 각 시료들의 흡광도 값을 측정하였다.
- 현미경으로 관찰하여 각 모서리에 있는 사각형(1x1 mm) 내의 세포수를 측정하여 4로 나눈 값을 평균 세포수로 하였다. 즉정한 세포수를 (전체세포수=평균 세포수xl04x희석농도)식에 대입하여 배양한 세포수를 구하였다. 실험에 필요한 세포수는 계산에 의해 구한 세포수를 희석하여 사용하였으며 실험하고자 하는 크기의 well plate에 희석한 세포와 DulbeccoAbgt modified Eagle's minimal essential medium을 가하여 5% CO, , 37(3의 배양기에서 24시간 배양 후 다음 생리활성 실험에 사용하였다.
- 활성저해시험. 피부 탄력인자인 elastin을 분해하는 효소인 elastase에 대한 활성저해에 대하여 coenzyme Qn 유도체들에 대하여 실험하였다. 그 걸과는 Fig.
- 현탁액 10/를 취하여 hemocytometei의 V-모양의 홈에 가하였다. 현미경으로 관찰하여 각 모서리에 있는 사각형(1x1 mm) 내의 세포수를 측정하여 4로 나눈 값을 평균 세포수로 하였다. 즉정한 세포수를 (전체세포수=평균 세포수xl04x희석농도)식에 대입하여 배양한 세포수를 구하였다.
대상 데이터
- 32g, 96%)을 얻었다. IR(KBr disk, cm-1) 1558, 1359, 1356; NMR(CDC13, 5): 1.8(s, 3H), 2.1 (s, 3H), 32(d, 2H), 3.7(s, 12H), 4.0(s, 2H), 5.7(t, 1H), 7.7(s, 5H).
- 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후 감압 농축하였다. 농축액을 실리카겔 크로마토그래피법(초산에틸과 헥산 1:9)으로 정제하여 coenzyme Q10(0.85 g, 85%)을 얻었다. 다른 coenzyme Qn 화합물들도 위와 같은 방법으로 제조하였다.
- 세포에 영양분을 공급하기위해 DulbeccoAbgt modified Eagle's minimal essential medium 89%, fetal bovine serum 10%, antibiotics 1%로 제조한 배지를 5% CO, , 37℃ 배양기에서 보관하였다. 배지 9 m세 세포배양액 Iml를 가하여 총 부피가 10m/가 되도록 하여 5분간 원심분리(xlOOOrpm)한 뒤 상등액을 제거하고 침전물에 배지 1 ml 를 가하여 현탁액을 제조하였다. 배지 9 m/가 들어있는 petri- dish(00)에 위에서 제조한 세포 현탁액 1 ml를 가하여 5% CO, , 37℃ 배양기에서 배양하였다.
- 시약. 본 합성에 사용한 모든 시약은 Aldrich사의 제품을 이용하였으며 용매는 공업용 시약을 정제하여 사용하였다. 피부 노화 검증을 위해 사용한 시약은 Sigma사의 제품, 2, 2-azobis- (2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)fe- Wako사 제품을 사용하였다.
- 0x10, 이 되도록 옮겨준 후 37℃, 5% CO, 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 시료로 coenzyme Qi, Q2, Q3, Q3-L, Q3-C, (%와 Qi0.01 g게 무수에탄올 1 ml 를 가하여 1% 용액을 제조하고 이를 희석하여 0.1, 0.01 과 0.001% 시료를 제조하였다. 배양 후 배양액을 제거한 후 4가지 농도의 시료 300/와 배지(5% fetal bovine serum) 2, 700를 각각의 well에 가해주고 5% CO, , 37℃ 하에서 3일 동안 배양하였다.
- Elastase 활성저해실험은 elastin을 분해하는 elastase의 활성을 저하시키는 정도를 확인하기 위해 실시하였다. 시료의 제조는 coenzyme Q, Q, , Q3, Q3-L, Q3-C, (%와 Qi 0.001 gH] 무수에탄올 1 ml를 가하여 0.1% 용액을 제조하고 이를 희석하여 0.01, 0.05과 0.001% 시료를 제조하였다. 8.
- Tnethyl]-methyl-2-aminoethansulfonic acid buflfer를 3 m/씩 가하였다. 시료의 제조는 coenzyme Q, Q2, Q3, Q3-L, Q3-C, (%와 Qi 0.01 g에 무수에탄올 1 ml를 가하여 1% 용액을 제조하고 이를 희석하여 0.1, 0.01과 0.001% 시료를 제조하였다. 4가지 농도로 준비한 시료 Im/와 collagenase solution 1 ml를 collegen과 N-tris[hydroxymethyl]- methyl-2-aminoethansulfonic acid buffer 3 m/가 혼합되어 있는 튜브에 가한 뒤 37℃ 하에서 5시간 동안 교반하며 효소 활성화 반응을 시켰다.
- 즉정한 세포수를 (전체세포수=평균 세포수xl04x희석농도)식에 대입하여 배양한 세포수를 구하였다. 실험에 필요한 세포수는 계산에 의해 구한 세포수를 희석하여 사용하였으며 실험하고자 하는 크기의 well plate에 희석한 세포와 DulbeccoAbgt modified Eagle's minimal essential medium을 가하여 5% CO, , 37(3의 배양기에서 24시간 배양 후 다음 생리활성 실험에 사용하였다.
- 본 합성에 사용한 모든 시약은 Aldrich사의 제품을 이용하였으며 용매는 공업용 시약을 정제하여 사용하였다. 피부 노화 검증을 위해 사용한 시약은 Sigma사의 제품, 2, 2-azobis- (2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)fe- Wako사 제품을 사용하였다.
- 실험기기. 피부노화 억제효과를 검증하기위해 사용한 CO2배양기는 Thermo사의 Forma series H water jaketed CO2 incubater, 무균대는 대청사인언스사, 원심분리기는 Eppendorf사의 centrifuge 5810R, ELISA readerfe- Oasis사의 UVM 340, 현미경은 Olympus사의 CKX41과 hemocytometei는 Marienfeld 사의 제품을 사용하였다.
이론/모형
- 세포 내 멜라닌생성 저해실험:19)세포 내 멜라닌 저해시험은 murine melanoma(B-16/Fl)세포의 생존률 방법으로 측정하였다. Murine melanoma(B-l 6/F1 5% CO, , 37℃ 하에서 24시간 배양한 후 hemocytometer로 측정한 결과 2.
성능/효과
- 이 등2?)은 감태(Ecklonia cava)에서 분리한 phkmtannin성분의 elastase 저해활성 및 hyaluronidase 저해활성과 비교하여 기준물질로 사용되었던 ursolic acid의 elastase 억제활성은 10 μg/m/에서 40%의 저해활성을 나타내었으며, 추출물인 dieck아은 34%의 억제활성을 보였다. 그러나 cgnzyme Qn화합물들 모두가 60% 이상의 우수한 elastase 억제활성을 나타내었다.
- " 이러한 작용으로 활성산소에 의해 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산의 과산화반응과 체내의 과산화 지질의 축적을 방지함으로서 활성산소로 생겨나는 생체기능 저하 및 성인병을 예방한다.한편, coenzyme Qme 피부의 주름살 개선 및 미백효과 등의 효과가 입증되어 화장품으로도 널리 사용되고 있으며, 피부내의 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈과 같은 색소들에 영향을 줌으로써 피부 탄력을 유지하는 콜라겐과 하이루론산 생성을 촉진시킨다?4) 또한, 피부노화를 막아주고 피부세포의 독성물질을 분해하는 항산화 작용이 비타민 E보다 매우 우수하여 활성산소 및 노폐물들의 생성을 억제한다.06)그러나, coenzyme Qn화합물들의 isoprene unit의 개수가 다른 유도체들에 대한 피부노화 연구는 거의 이루어져 있지 않다.
- Clagena 저해활성 실험은 피부의 지지역할을 하는 collagen 분해를 담당하는 collagenase의 저해 활성을 측정함으로써 피부노화의 감소 정도를 측정하는 실험으로 피부노화에 있어서 탁월한 효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있는 coenzyme 과 비교하여 coenzyme Qi의 경우는 월등히 우수한 collagenase 저해활성을 보여주었으며, 다른 coenzyme Qn 유도체들도 coenzyme Q(과 유사한 활성을 나타냄으로써 coenzyme Qn 화합물이 갖는 기본 구조물질 모두가 collagenase 저해활성이 있음을 확인하였다.
- 7%를 나타내었다. Coenzyme Q-C는 79.2, 792, 81.0과 91.2%, coenzyme Q4는 82.0, 83.1, 82.6과 80.0%, coenzyme Qme 82.9, 84.2, 86.1과 91.1%의 억제율을 나타내었다. 위와 같은 걸과로 coenzyme Q, Q, , Q-Le 낮은 농노인 0.
- 8%의 억제율을 나타내었다. Coenzyme Qn 시료의 농도를 0.1, 0.05, 0.01 와 0.001 %로 변화시키면서 elastase 활성저해 시험 걸과 coenzyme Qe 각각 80.2, 63.7, 61.3과 60.1 %의 억제율을 나타내었고, coenzyme Q는 70.5, 65.0, 432와 26.6%를 보였다. coenzyme Qe 69.
- 7%의 억제율을 나타내었다. Coenzyme Qn의 여러 농도 0.001, 0.01, 0.1 과 1%에서 collagenase 활성 저해율을 측정한 걸과 coenzyme Qe 각각 86.4, 88.3, 81.6과 81.2%, coenzyme Q는 88.8, 90.5, 86.1과 85.8%를 나타내었다. coenzyme Q:는 81.
- 5%를 나타내었다. coenzyme Q, - C는 61.7, 51.7, 42.2와 22.3%의 억제율을 확인하였으며, coenzyme Q4는 59.0, 50.3, 22.2와 11.2%, coenzyme Qme 73.3, 60.8, 50.8과 39.3%의 억제율을 나타내었다. 모든 농도에서 coenzyme Qe coenzyme Qi(보다 우수한 elastase 활성 저해효과를 나타내었고, coenzyme Q2, coenzyme Q3, coenzyme Q3-C, coenzyme Q3-L과 coenzyme Q4는 0.
- 6%를 보였다. coenzyme Qe 69.5, 62.8, 33.7과 20.0%의 억제율을 나타내었으며, coenzyme Q-Le 672, 63.0, 38.6과 20.5%를 나타내었다. coenzyme Q, - C는 61.
- 5%의 억제율을 나타내었다. 위와 같은 걸과로 coenzyme Qi, coenzyme Q?과 coenzyme Q는 거의 모든 농도에서 coenzyme Qm보다 우수한 억제효과를 나타내었으나 coenzyme Q3-L, coenzyme Q-C 와 coenzyme Q4는 coenzyme Q보다 비슷하거나 닞은 효과를 나타내었다. 따라서, 겉사슬의 탄소수가 적을수록 멜라닌 억제효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 1에 나타내었다. 그 걸과 대조물질인 무수 에탄올은 멜라닌 억제율이 없었으며, coenzyme Qn 의 농도를 0.001, 0.01과 0.1%로 변화시키면서 억제율을 측정한 걸과 coenzyme Qe 각각 28.5, 33.4, 38.6과 55.5%의 억제율을 나타내었고, coenzyme Q는 20.8, 27.1, 31.8과 44.9% 를 보여주었다. Coenzyme Q.
- 위와 같은 걸과로 coenzyme Qi, coenzyme Q?과 coenzyme Q는 거의 모든 농도에서 coenzyme Qm보다 우수한 억제효과를 나타내었으나 coenzyme Q3-L, coenzyme Q-C 와 coenzyme Q4는 coenzyme Q보다 비슷하거나 닞은 효과를 나타내었다. 따라서, 겉사슬의 탄소수가 적을수록 멜라닌 억제효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 01에서는 coenzyme Qm보다 높은 collagenase 활성 저해효과를 나타내었고, coenzyme Q3, Q3-C, Q4는 coenzyme Qm보다 닞은 collagenase 활성 저해효과가 있었다. 모든 coenzyme Qm유도체들이 collagenase 활성저해효과를 나타내었으며, 80-90%의 비교적 높은 활성 저해효과를 나타내므로 collagenase의 활성 저해효과는 coenzyme Qm의 isoprene imit 수와 농도에 무관하며, 모핵 구조인 benzoquinone 구조에 의한 깃으로 사료된다.
- 3%의 억제율을 나타내었다. 모든 농도에서 coenzyme Qe coenzyme Qi(보다 우수한 elastase 활성 저해효과를 나타내었고, coenzyme Q2, coenzyme Q3, coenzyme Q3-C, coenzyme Q3-L과 coenzyme Q4는 0.01 %의 농도에서 coenzyme Qo과 유사한 elastase 활성저해효과를 확인하였다. 특히, coenzyme Qfe 거의 모든 농도에서 가장 우수한 elastase 활성 저해효과를 나타내었다.
- 1%의 억제율을 나타내었다. 위와 같은 걸과로 coenzyme Q, Q, , Q-Le 낮은 농노인 0.001과 0.01에서는 coenzyme Qm보다 높은 collagenase 활성 저해효과를 나타내었고, coenzyme Q3, Q3-C, Q4는 coenzyme Qm보다 닞은 collagenase 활성 저해효과가 있었다. 모든 coenzyme Qm유도체들이 collagenase 활성저해효과를 나타내었으며, 80-90%의 비교적 높은 활성 저해효과를 나타내므로 collagenase의 활성 저해효과는 coenzyme Qm의 isoprene imit 수와 농도에 무관하며, 모핵 구조인 benzoquinone 구조에 의한 깃으로 사료된다.
- Coenzyme Qn 화합물의 in vitro 상태에서 멜라닌 생성 저해 효과를 알아보았다. 이와 유사한 연구로 천 등의 2W quercetin이 melan-a 멜라닌세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향과 비교할 때 quercetine 10 μg/ 처리군에서 대조군보다 30%의 활성을 보인 것에 비해 coenzyme Q의 경우는 같은 농도에서 33%의 활성을 보여주었으며 1 μg/g에서도 28.5%의 활성을 유지함을 확인하여 coenzyme Qe 미백효과가 탁월함을 확인하였다.
후속연구
- 그러나 cgnzyme Qn화합물들 모두가 60% 이상의 우수한 elastase 억제활성을 나타내었다. 따라서, coenzyme Qi0 뿐만 아니라 isoprene unit의 수가 다른 여러 coenzyme Qn 유도체들이 기능성 화장품으로 사용될 수 있을 것이며 특히, coenzyme Q과 coenzyme Q2는새로운 기능성 화장품으로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
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