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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 메밀을 콩나물 형태의 채소로 재배하여 rutin, 아미노산 및 각종 무기물이 풍부하게 함유된 메밀싹을 얻고, 메밀싹 추출물의 항돌연변이원성 및 암세포 성장 억제 효과를 확인함으로서 신선채소로서의 이용은 물론 기능성 식품소재로서의 가치를 밝혀 기능성식품 개발 혹은 신소재 개발을 위한 기초자료를 얻는데 그 목적을 두었다.
제안 방법
- 실험에 사용한 세포주는 인간 암세포로 폐암 세포 A549(Lung carcinoma, Human), 유방암세포 MCF-7 (Breast adenocarcinoma, Human), 간암세포 Hep3B(Human hepatocellular carcinoma), 위암세포 AGS(Human gastric carcinoma), 결장암세포 Colo 205(Colon adenocarcinoma, Human)를 그리고 정상세포로 293(transformed human kidney) 을 Korea Cell Bank(KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. A549, MCF-7, AGS 세포주는 RPMI Medium 1640 복합배지를, Hep3B, Colo205 세포주는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium) 배지를 이용하여 10% fetal bovine serum을 첨가하고, 37P에서 5% CQ에 적응 시켜 각각 배양시켰다.
- 세포독성 실험. SRB(sulforhodamine B)는 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 방법18)으로 10% fetal bovine serum 및 각각의 암세포(A549, MCF-7, AGS, Hep3B, Cok>205)와 정상세포(293)를 함유하는 RPMI 1640과 DMEM배지에 5x1(/ cells/m/농도로 씩 각 well에 첨가하여 24시간 동안 배양(37P, 5% CO2)시킨 후 0.2 M 이하의 DMSO로 녹인 시료를 025, 0.5, 0.75, 1.0mg/m/의 농도로 100 µl씩 첨가하여 4&시간 동안 다시 배양하였다. 그 후 상등액을 aspirator 조심스럽게 제거하고 냉장 보관한 10%(w/v) trichloroacetic acid(TCA)를 100µl씩 첨가한 후 1시간 동안 4℃에서 방치한 후 증류수로 다섯 번 헹구었다.
- Ames test를 개량한 preincubation 법에 따라 항돌연변이원성 실험을 실시하였고, 실험에 사용한 변이원물 질은 4NQO, MNNQ B(a)P 및 Trp-P-1 이다. 건열멸균시킨잉ass cap tube에 시료의 추출물을 각각 50µl 첨가하고 이어서 변이원 물질을 각각 50µl씩 첨가하였다. 간접 변이원인 경우 간접변이원을 활성화시키기 위하여10% S-9 mix를 250 µl씩 첨가하였다.
- Ames test를 이용한 항돌연변이원성. 돌연변이 유발 억제 효과를 나타내는 성분들의 특성을 검토하고자 각각의 메밀 싹에 대한 에탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 부탄올 및 물층으로 분획을 한 후 MNNQ 4NQO, B(a)P 그리고 TipP-l을 사용하여 항돌연변이원성 실험을 수행한 걸과, Fig. 1, 2, 3, 4에 나타낸 바와 같이 각각의 변이원 물질에 대하여각 분획물들은 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 즉 MNNG(0.
- 약산성일 때 SRB는 TCA로 고정된 세포내의 단백질 염기 아미노산 잔기와 걸함하므로 세포 닐도와 직선관계이며 주위 환경의 변경에 덜 민감하고 중간 대사물에 영향을 받지 않는 안정한 end point를 제공해 준다. 따라서 본 실험에서는 각종 암세포에 대한 세포독성을 규병하기 위해 암세포로 A549, MCF-7, Colo 205, AGS, Hep3B와 대조로서 정상세포인 293을 이용하여 메닐싹 에탄올 추출물과 분획물에 대하여 SRB assay를 행하였다. 그 걸과 Fig.
- 메밀싹 추출물의 돌연변이원성 실험은 Salmonella typhimuriimie\ 변이주인 TA98과 TA1O0을 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation법17)으로 실시하였다. 메밀 싹 추출물을 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 각각 50 µl씩 가하고 여기에 미리 TA-culture배지(Diftxo nutrient broth 0.8 g +NaCl 0.5g+증류수 lOOmZ)에서 하룻밤 배양시킨 균액 100µl를 가한 다음 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 가하여 전체부피가700 B가 되도록 하였다. 이것을 30분간 preincubation한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agai를 2 m/ 씩 가하여 잘 혼합한 후에 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평판 고화시켜 37P에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이(His* revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유-무를 판정하였다.
- 이것을 3WC에서 20분간 진탕 배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이성 유무를 판정하였다. 메밀싹 추출물과 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition rate, %)로 나타내었다.
- 재료 및 시료의 조제. 실험에 사용한 메밀싹(길이 12-16 cm 정도, 하배축의 두께 약 1.8시.9 mm 정도)은 추출에 적합하도록 미세분쇄기로 분말화하여 시료중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하고 8시간씩 8(PC에서 3회 추출한 후, 감압여과 장치에서 뜨거운 상태로 여과한 후 감압농축기를 사용하여 추출용 매를 제거한 후 동결건조한 후 실험에 사용하였으며 각각의 분획물의 제조는 동결건조물로부터 용매의 극성에 따라 분별 분리를 행하여 핵산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물층으로 극성의 차이에 의해 다섯 가지 분획물을 분리한 후 감압농축 후 동결건조하여 실험에 사용하였다.
- sulforhodamine B(SRB)는 두 개의 sulfonic group을 가진 밝은핑크색의 aminoxanthene 염색액으로 단백질 염색에 널리 사용되어지는 bromophenol blue와 naphthol yellow와 유사하다. 약산성일 때 SRB는 TCA로 고정된 세포내의 단백질 염기 아미노산 잔기와 걸함하므로 세포 닐도와 직선관계이며 주위 환경의 변경에 덜 민감하고 중간 대사물에 영향을 받지 않는 안정한 end point를 제공해 준다. 따라서 본 실험에서는 각종 암세포에 대한 세포독성을 규병하기 위해 암세포로 A549, MCF-7, Colo 205, AGS, Hep3B와 대조로서 정상세포인 293을 이용하여 메닐싹 에탄올 추출물과 분획물에 대하여 SRB assay를 행하였다.
- 4)를 가하여 전체부피가700 B가 되도록 하였다. 이것을 30분간 preincubation한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agai를 2 m/ 씩 가하여 잘 혼합한 후에 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평판 고화시켜 37P에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이(His* revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유-무를 판정하였다.
- 4)를 가하여 최종 부피가 700µl가 되도록 하였다. 이것을 3WC에서 20분간 진탕 배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이성 유무를 판정하였다. 메밀싹 추출물과 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition rate, %)로 나타내었다.
대상 데이터
- 3- b)indol(Trp-P-l)은 일본 특급시약四光純藥)을 구입하였다. 이들변이원 물질은 dimethyl suHbxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다.
- 세포주 및 배양. 실험에 사용한 세포주는 인간 암세포로 폐암 세포 A549(Lung carcinoma, Human), 유방암세포 MCF-7 (Breast adenocarcinoma, Human), 간암세포 Hep3B(Human hepatocellular carcinoma), 위암세포 AGS(Human gastric carcinoma), 결장암세포 Colo 205(Colon adenocarcinoma, Human)를 그리고 정상세포로 293(transformed human kidney) 을 Korea Cell Bank(KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. A549, MCF-7, AGS 세포주는 RPMI Medium 1640 복합배지를, Hep3B, Colo205 세포주는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium) 배지를 이용하여 10% fetal bovine serum을 첨가하고, 37P에서 5% CQ에 적응 시켜 각각 배양시켰다.
- 직접 돌연변이 원인 N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine(MNNG), 4-nitroquinolinel-oxide(4NQO)는 미국 Sigma 회사로부터 구입하였고, 간접 돌연변이원인 benzo(a)pyrene(B(a)P) 과 3-amino-l , 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3- b)indol(Trp-P-l)은 일본 특급시약四光純藥)을 구입하였다. 이들변이원 물질은 dimethyl suHbxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 항돌연변이원성 실험. Ames test를 개량한 preincubation 법에 따라 항돌연변이원성 실험을 실시하였고, 실험에 사용한 변이원물 질은 4NQO, MNNQ B(a)P 및 Trp-P-1 이다. 건열멸균시킨잉ass cap tube에 시료의 추출물을 각각 50µl 첨가하고 이어서 변이원 물질을 각각 50µl씩 첨가하였다.
- 돌연변이원성 실험. 메밀싹 추출물의 돌연변이원성 실험은 Salmonella typhimuriimie\ 변이주인 TA98과 TA1O0을 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation법17)으로 실시하였다. 메밀 싹 추출물을 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 각각 50 µl씩 가하고 여기에 미리 TA-culture배지(Diftxo nutrient broth 0.
- 발암 과정에서 발암의 개시는 암 유전자나 암 억제유전자에 일어나는 각종 돌연변이인 것으로 알려져 있는데 돌연변이를 억제하는 것이 발암의 억제로 이어진다고 생각되고 있다. 세포의 생육 형태가 부착성 (attachment) 세포인 경우 SRB assay를 사용하였다. sulforhodamine B(SRB)는 두 개의 sulfonic group을 가진 밝은핑크색의 aminoxanthene 염색액으로 단백질 염색에 널리 사용되어지는 bromophenol blue와 naphthol yellow와 유사하다.
성능/효과
- 있다.1) 메닐은 생육 기긴, 이 60~80일로 짧고, 서늘한 기후에서 잘 자라며 흡비력과 병충해에 강한 특성이 있어 많은 양의 화학 비료와 농약을 사용할 필요가 없는 무공해 직물이라고 할 수 있다.그 메밀 성분 중 회분은 대체적으로 20% 내외로 종 피와 과피에 많이 함유되어 있고 단백질은 약 13% 함유되어있다.
- 이는 메밀잎에 존재해 있는 성분과 메밀싹에 형성된 성분이 다를 수 있다는 것을 암시해주었다. 4NQO(0.5 jig/plate)를- 처리한 TA98의 경우 에탄올 추출물이 200 jig/plate농도에서 81.5%의 높은 돌연변이 억제 활성을 나타내었으며, 에탄올 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트, 물, 부탄올, 핵산, 클로로포름 분획물에서는 88.4, 79.1, 76.3, 75.0, 74.6%의 억제효과를 나타내었다. TA100에서는 에탄올 추출물이 77.
- Ames test를 이용한 돌연변이원성. S. typhimurium TA98과 1A100을 이용한 Ames test를 행한 결과 음성대조군의 복귀 돌연변이 집락수는 TA98이 17±4, TA100은 183±6이었고, 에탄올 추출물을 첨가하여 실험한 결과 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 의존성을 나타내지 않으므로 메밀싹 에탄올 추출물은 돌연변이원성 및 독성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다 (데이타 생략). 이는 메밀잎 에탄올 추출물19)그리고 메밀국수 에탄올 추출물끼) 모두에서 돌연변이원성을 나타내지 않는다는 연구보고와 일치하였다.
- 따라서 본 실험에서는 각종 암세포에 대한 세포독성을 규병하기 위해 암세포로 A549, MCF-7, Colo 205, AGS, Hep3B와 대조로서 정상세포인 293을 이용하여 메닐싹 에탄올 추출물과 분획물에 대하여 SRB assay를 행하였다. 그 걸과 Fig. 5에서와 같이 인간 폐암세포인 A549 세포에 대한 분획물들의 억제효과를 검토한 걸과 lmg/m/ 첨가시 에틸아세테이트 분획물에서 70.3%의 억제효과를 보였으며 다른 나머지 분획물에서는 65% 이하의 억제효과를 나타내었다. 인간 유방암세포인 MCF-7 세포의 경우 시료농노 1 mg/m세서 부탄올, 에틸아세테이트 및 클로르포름 분획물에서 각각 80.
- 25 mg/m/ 농도에서 에틸아세테이트 분획물이 약 90%의 강한 억제효과를 나타내었고, 부탄올은 약 72%의 억제효과를 나타내었다. 농도가 이보다 높은 0.5 mg/m/인 경우 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서 각각 93.2, 88.7% 그리고 0.75 mg/m/인 경우 94, 93.1%, 1.0 mg/m/인 경우 94.8, 93.6%로서 모두 88% 이상의 강한 암세포 성장 억제효과를 나타내었다. 본 실험에 사용한 5종의 인간 암세포 중 위암세포인 AGS에 있어서 메닐싹 메닐싹 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 및 부탄올 분획이 매우 탁월한 억제 효과가 있는 것으로 평가되었다.
- 1). 또한, 동일농도에서 물, 핵산, 클로로포름 분획물에서는 각각 70.6, 65.3, 64.3%를 나타내었다. Hamm 등은 MWG가 첨가된 TA100 균주에 대해 메닐잎의 에탄올 추출물로부터 얻어진 핵산, 클로로포름 분획물이 강한 돌연변이 억제 효과를 보임을 보고한 바 있어, 본 실험걸과와 약긴의 차이점이 있음을- 알 수 있었다.
- 6%로서 모두 88% 이상의 강한 암세포 성장 억제효과를 나타내었다. 본 실험에 사용한 5종의 인간 암세포 중 위암세포인 AGS에 있어서 메닐싹 메닐싹 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 및 부탄올 분획이 매우 탁월한 억제 효과가 있는 것으로 평가되었다. 이러한 결과는 메밀싹 추출물이 위암에 강력한 억제제 혹은 치료제로서의 역할을 할 수 있을깃으로 사료되며, 향후 in vivo 실험과 임상실험을 통해 세부적이고 명확한 데이터를 이용하여 구체화시키는 깃이 바람직할 것으로 판단되었다.
- 위와 같은 결과로 미루어 메밀싹은 건강기능식품이나 고부가 가치의 의약품으로서의 개발가능성을 가진 아주 유용한 소재가 될 수 있을 것으로 시사되었다. 특히 메밀싹은 콩나물과는 달리 비린내가 나지 않으며 오히려 그 향이 독특하고 조직이 연하고 부드럽기 때문에 생식하거나 샐러드, 즉석 나물무침 등에 이용할 수 있으며, 메밀싹을 소재로 한 각종 음료 및 식품의 개발도 가능하다고 할 수 있겠다.
- 이는 컴프리를 첨가한 밀가루의 열수 추출물이 폐암세포인 A549에서 23%의 낮은 억제효과를 나타내었다는 연구보고24에서와 같이 물 추출물의 경우는 암세포 성장 억제효과가 낮은 것으로 판단되었다. 이들 실험결과로 미루어 메밀싹 에탄올 추출물의 물 분획 시에 극성에 가용되는 암세포 증식억제 효과를 가진 생리활성 물질은 내우 적은 깃으로 추정할 수 있었다.
- 이상의 실험 결과에서 나타낸 바와 같이 메밀싹 에탄올 추출물의 에틸아세테이트와 부탄올 분획은 탁월한 항돌 연변 이원성 및 암세포 성장 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다. 독히 위암 세포인 AGS에 대해 보이는 매우 강한 암세포 억제효과는 에틸아세테이트와 부탄올 분획으로부터 유용성분만을 분리하여 위의 건강에 도움이 되는 건강기능식품 소재나 의약품 소재로서 충분히 활용 가능한 토대를 마련할 수 있을 것으로 기대된다.
- Kwak22)등은 한국산 메밀, 수수, 기장, 율무의 에탄올 추출물들은 모든 시료에서 농도 의존적으로 항돌연변이원성 효과를 나타내었고, 또 각각의 시료들이 직접변이원에 대하여 높은 돌연변이 억제활성을 나타내는 깃으로 보고하였는데 이는 본 실험의 걸과와 유사성을 보여주었다. 이상의 항돌연변이 효과 실험에서 메닐싹 에탄올 추출물의 에틸아세테이트나 부탄올 분획이 높은 돌연변이 억제 활성을 나타내었다. 메밀싹 에탄올 추출물의 에틸아세테이드 분획에서 RC50 값이 26.
- 3%의 높은 억제효과를 나타내었다(Fig 9). 이에 반해, 인간의 정상 세포인 293에 대하여 메닐싹 에탄올 주줄 물과 분획물을 농도에 따른 세포독성은 시료농도 1 mg/m/ 의 농도에서 클로로포름 분획물에서 38.9%의 억제율을- 보였을뿐 다른 분획물에선 모두 32% 이하의 억제율을 나타내어 메밀 싹 추출물과 분획물이 비교적 낮은 독성효과를 나타냄을 알 수 있었다(Fig. 10).
- 3%의 억제효과를 보였으며 다른 나머지 분획물에서는 65% 이하의 억제효과를 나타내었다. 인간 유방암세포인 MCF-7 세포의 경우 시료농노 1 mg/m세서 부탄올, 에틸아세테이트 및 클로르포름 분획물에서 각각 80.9, 79.6 그리고 772%의 비교적 높은 억제효과를 나타내었으며(Fig. 6), 물 분획물에서는 20% 이하의 낮은 값을 나타내었다. 이는 컴프리를 첨가한 밀가루의 열수 추출물이 폐암세포인 A549에서 23%의 낮은 억제효과를 나타내었다는 연구보고24에서와 같이 물 추출물의 경우는 암세포 성장 억제효과가 낮은 것으로 판단되었다.
- 5jig/plate)를 처리한 TA98 균주의 경우 에틸아세테이트 분획물에서 80% 이상의 억제율을 보였고, 1A100 균.주에 대해서는 헥산과 에틸 아세테이트 분획물에서 85% 이상의 높은 억제율을 나타내었으며, 농도증가에 따라 억제효과도 증가함을 보였다(Fig 4). Kwak22)등은 한국산 메밀, 수수, 기장, 율무의 에탄올 추출물들은 모든 시료에서 농도 의존적으로 항돌연변이원성 효과를 나타내었고, 또 각각의 시료들이 직접변이원에 대하여 높은 돌연변이 억제활성을 나타내는 깃으로 보고하였는데 이는 본 실험의 걸과와 유사성을 보여주었다.
- 1, 2, 3, 4에 나타낸 바와 같이 각각의 변이원 물질에 대하여각 분획물들은 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 즉 MNNG(0.4 ㎍/plate)에 대해서는 200 ㎍/plate농도에서 에틸아세테이트, 부탄올 분획물이 각각 80.6%와 79.6%로서 높은 억제율을 나타내었다(Fig. 1). 또한, 동일농도에서 물, 핵산, 클로로포름 분획물에서는 각각 70.
- Hamm 등은 MWG가 첨가된 TA100 균주에 대해 메닐잎의 에탄올 추출물로부터 얻어진 핵산, 클로로포름 분획물이 강한 돌연변이 억제 효과를 보임을 보고한 바 있어, 본 실험걸과와 약긴의 차이점이 있음을- 알 수 있었다. 즉, Ham의 걸과는 주로 비극성 용내 분획 물에서 강한 활성을 나타낸 반면, 본 실험 결과에서는 극성과 비극성의 중간적 성질을 띤 에틸아세테이트 등의 용내 분획물에서 강한 활성을 나타내었다. 이는 메밀잎에 존재해 있는 성분과 메밀싹에 형성된 성분이 다를 수 있다는 것을 암시해주었다.
후속연구
- 암세포 성장 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다. 독히 위암 세포인 AGS에 대해 보이는 매우 강한 암세포 억제효과는 에틸아세테이트와 부탄올 분획으로부터 유용성분만을 분리하여 위의 건강에 도움이 되는 건강기능식품 소재나 의약품 소재로서 충분히 활용 가능한 토대를 마련할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 실험에 사용한 5종의 인간 암세포 중 위암세포인 AGS에 있어서 메닐싹 메닐싹 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 및 부탄올 분획이 매우 탁월한 억제 효과가 있는 것으로 평가되었다. 이러한 결과는 메밀싹 추출물이 위암에 강력한 억제제 혹은 치료제로서의 역할을 할 수 있을깃으로 사료되며, 향후 in vivo 실험과 임상실험을 통해 세부적이고 명확한 데이터를 이용하여 구체화시키는 깃이 바람직할 것으로 판단되었다.
- 특히 메밀싹은 콩나물과는 달리 비린내가 나지 않으며 오히려 그 향이 독특하고 조직이 연하고 부드럽기 때문에 생식하거나 샐러드, 즉석 나물무침 등에 이용할 수 있으며, 메밀싹을 소재로 한 각종 음료 및 식품의 개발도 가능하다고 할 수 있겠다. 향후 이러한 좋은 건강기능식품 소재로서 부각을 시키기 위해서는 에틸아세테이트나 부탄올 분획물과 같은 생리활성 기능이 강한 성분들을 분리, 정제하여 추가적인 연구 및 활용방안에 대한 충분한 검토가 이루어져야 할 깃으로 사료된다.
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