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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천연물 소재인 잔대 추출물의 항산화 효과에 대한 연구의 일환으로 6개의 잔대 분획물 중 폴리페놀 성분이 가장 많이 함유된 잔대 에틸 아세테이트 추출물을 인간 간세포인 HepG2에 전 처리한 후 산화적 스트레스를 주었을 때 이들 추출물이 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호할 수 있는지를 알아보았다. 더하여 이들 세포가 산화적 스트레스에 의해 세포를 보호할 수 있다면 어떤 기작에 의해 이와 같은 보호 작용이 있는지 알아보기 위해, 잔대 에틸아세테이트 추출물이 세포내 항산화 방어시스템인 4개의 주요 효소들(SOD 1, SOD 2, GPx와 CAT) 및 glutathione 대사에 관여하는 효소들(GR, GCS, GST, γ-GT와 G6PD)에 미치는 영향을 검토하였다.
- 잔대 뿌리는 우리나라에서 예로부터 민간약으로 이용되어 오고 있다. 본 연구에서는 인간 간세포인 HepG2에 잔대 뿌리의 에틸아세테이트 추출물을 처리했을 때 sodium nitroprusside(SNP)에 의해 유도된 세포 독성 및 항산화 유전자 발현에 미치는 영향력을 알아보았다. 먼저, 잔대 에틸아 세테이트 추출물이 NO에 의해 유도된 세포 사멸을 저해할 수 있는지를 알아보기 위하여 HepG2 세포에 잔대 에틸아세테이트 추출물(각각 50과 100 μg/mL)을 24시간 먼저 처리한 후 세포내에서 NO을 생성시킬 수 있는 0.
제안 방법
- 1에 나타내었다. 0, 0.1, 0.5 그리고 1 mM의 SNP를 HepG2 세포에 처리하였을 때, 각각 100, 90.1, 59.9 그리고 20.5%의 생존율을 나타내었으므로, 산화적 스트레스를 유발시키기 위해서 0.5 mM의 SNP을 선택하였다. 잔대 에틸아세테이트 추출물의 세포내 산화적 스트레스 방어 효과를 알아보기 위하여 세포 독성을 유발하지 않는 50과 100 μg/mL의 잔대 에틸아세테이트 추출물을 24시간 처리한 후 추출물을 첨가된 배지를 제거하고 이어서 0.
- GoTaq Green Master 10 μL, 증류수 8μL, forward primer(15 μM)와 reverse primer(15 μM)을 각각 0.5 μL, 그리고 합성한 first-stand cDNA 1 μL을 PCR tube에 넣은 후 다음과 같은 조건으로 PCR을 하였다.
- HepG2 세포(5×104)를 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양시킨 후 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 0, 50 그리고 100 μg/mL의 잔대 에틸아세테이트 추출물을 처리한 후 24시간 배양하였다.
- HepG2 세포에 잔대 에틸아세테이트 추출물 처리하여 24시간 배양하였고, 이때 처리 농도는 세포독성을 유발시키지 않는 농도인 50과 100 μg/mL이었으며, 시료를 처리하지 않은 무처리군을 대조군으로 하였다.
- HepG2를 24 well plate에 5×104 cells/mL 농도로 1 mL씩 각 well에 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양시킨 후 MEM/ENSS에 0, 50 그리고 100 μg/mL의 잔대 에틸아세테이트 추출물을 녹인 시료를 1 mL씩 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 5 mM SNP를 처리 하였다. NO에 의한 세포독성이 에틸아세테이트 추출물에 의해 저해되었다는 것을 mitochondrial dehydrogenase 활성을 알아보는 MTT assay를 실시하여 알아보았다. 더하여 우리는 잔대 에틸아세테이트 추출물이 세포내 항산화 방어 시스템인 Cu,Zn superoxide dismutase(SOD 1), Mn SOD (SOD 2), glutathione peroxidase(GPx), catalase와 glutathione metabolism과 관련되어져 있는 glutathione reductase(GR), γ-glutamyl-cystein synthetase(GCS), glutathione-S-transferase(GST), γ-glutamyltranspeptidase (γ-GT), glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 알아보았다.
- 18S를 내부 표준 유전자로 사용 하였다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1.2% agarose gel에 100V에서 30분간 전기영동 후 자외선광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- RNA 추출은 Invitrogen(USA)사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 수행하였고, 추출한 RNA 5 μL을 0.1% DEPC를 처리한 물(995 μL)에 희석시킨 후 260과 280 nm에서 흡광도를 측정하여 이들 비가 1.7 이상일 때 다음 단계를 진행하였다.
- SOD 1, SOD 2, GCS와 CAT는 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 52℃에서 40초, 72℃에서 40초, 72℃에서 10분이었고, GPx, GT, GR, G6PD 그리고 18S rRNA도 유사한 조건으로 PCR 하였으나, annealing 온도가 각각 60, 60, 62, 50 그리고 60℃로 달랐다. SOD 1, SOD 2, GCS, CAT, GPx, GT, GR, G6PD 그리고 18S의 PCR cycles은 각각 22, 23, 27, 22, 25, 35, 25, 21 그리고 15 cycles하였다. 18S를 내부 표준 유전자로 사용 하였다.
- 2% agarose gel에 100V에서 30분간 전기영동 후 자외선광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- 더하여 우리는 잔대 에틸아세테이트 추출물이 세포내 항산화 방어 시스템인 Cu,Zn superoxide dismutase(SOD 1), Mn SOD (SOD 2), glutathione peroxidase(GPx), catalase와 glutathione metabolism과 관련되어져 있는 glutathione reductase(GR), γ-glutamyl-cystein synthetase(GCS), glutathione-S-transferase(GST), γ-glutamyltranspeptidase (γ-GT), glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 알아보았다.
- 더하여 이들 세포가 산화적 스트레스에 의해 세포를 보호할 수 있다면 어떤 기작에 의해 이와 같은 보호 작용이 있는지 알아보기 위해, 잔대 에틸아세테이트 추출물이 세포내 항산화 방어시스템인 4개의 주요 효소들(SOD 1, SOD 2, GPx와 CAT) 및 glutathione 대사에 관여하는 효소들(GR, GCS, GST, γ-GT와 G6PD)에 미치는 영향을 검토하였다.
- 먼저, 잔대 에틸아 세테이트 추출물이 NO에 의해 유도된 세포 사멸을 저해할 수 있는지를 알아보기 위하여 HepG2 세포에 잔대 에틸아세테이트 추출물(각각 50과 100 μg/mL)을 24시간 먼저 처리한 후 세포내에서 NO을 생성시킬 수 있는 0.5 mM SNP를 처리 하였다.
- 본 실험에서 사용한 시료는 강원도에서 재배되고 있는 잔대뿌리를 분말화한 후 시료 중량 10배의 70% 에탄올을 첨가 하고 8시간씩 80℃에서 3회 추출한 후, 뜨거운 상태에서 감압여과를 거쳐 감압 농축기를 사용하여 추출 용매를 제거한 후 동결건조 하였다. 분획물의 제조는 동결 건조한 시료를 물에 녹인 후 용매의 극성에 따라 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올과 물층으로 분별 분리하여 극성의 차이에 따라 분리한 후에 에틸아세테이트 층만 감압농축 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다.
- 인간에게 산화적 스트레스를 가했을 때 잔대 에틸아세테이트 추출물이 산화적 스트레스에 대항하여 얼마나 간을 보호할 수 있는지 알아보기 위하여 인간 간암세포인 HepG2를 이용하여 SNP를 처리하였다. HepG2를 24 well plate에 5×104 cells/mL 농도로 1 mL씩 각 well에 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양시킨 후 MEM/ENSS에 0, 50 그리고 100 μg/mL의 잔대 에틸아세테이트 추출물을 녹인 시료를 1 mL씩 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 잔대 에틸아세테이트 추출물의 세포내 산화적 스트레스 방어 효과를 알아보기 위하여 세포 독성을 유발하지 않는 50과 100 μg/mL의 잔대 에틸아세테이트 추출물을 24시간 처리한 후 추출물을 첨가된 배지를 제거하고 이어서 0.5 mM의 SNP를 24시간 처리하였다.
- 제조된 cDNA를 항산화 유전자 발현을 알아보기 위해 PCR을 실시하였다. GoTaq Green Master 10 μL, 증류수 8μL, forward primer(15 μM)와 reverse primer(15 μM)을 각각 0.
대상 데이터
- SOD 1, SOD 2, GCS, CAT, GPx, GT, GR, G6PD 그리고 18S의 PCR cycles은 각각 22, 23, 27, 22, 25, 35, 25, 21 그리고 15 cycles하였다. 18S를 내부 표준 유전자로 사용 하였다. PCR 산물은 0.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, TRIZOL reagent, oligo(dT)15 primer, dNTP, RNase-free water, 5X first-strand 및 Superscript II Reverse Transcriptase는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. GoTaq Green Master Mix는 Promega(Madison, WI, USA)에서 그리고 oligonucleotide primers는 Bioneer(Daejun, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 인간 간암 세포 HepG2 는 Korea Cell Line Bank(Seoul, KCLB)로부터 분양받았다.
- Minimum essential medium(MEM/EBSS), Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS) 및 Trypsin-EDTA는 Hyclone 사(Logan, UT)로부터 구입하였다. Sodium nitroprusside(SNP), 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethylsulfoxide(DMSO)와 diethyl pyrocarbonate(DEPC)는 Sigma-Aldrich 사(St.
- Minimum essential medium(MEM/EBSS), Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS) 및 Trypsin-EDTA는 Hyclone 사(Logan, UT)로부터 구입하였다. Sodium nitroprusside(SNP), 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethylsulfoxide(DMSO)와 diethyl pyrocarbonate(DEPC)는 Sigma-Aldrich 사(St.Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, TRIZOL reagent, oligo(dT)15 primer, dNTP, RNase-free water, 5X first-strand 및 Superscript II Reverse Transcriptase는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. GoTaq Green Master Mix는 Promega(Madison, WI, USA)에서 그리고 oligonucleotide primers는 Bioneer(Daejun, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 시료는 강원도에서 재배되고 있는 잔대뿌리를 분말화한 후 시료 중량 10배의 70% 에탄올을 첨가 하고 8시간씩 80℃에서 3회 추출한 후, 뜨거운 상태에서 감압여과를 거쳐 감압 농축기를 사용하여 추출 용매를 제거한 후 동결건조 하였다. 분획물의 제조는 동결 건조한 시료를 물에 녹인 후 용매의 극성에 따라 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올과 물층으로 분별 분리하여 극성의 차이에 따라 분리한 후에 에틸아세테이트 층만 감압농축 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다.
- GoTaq Green Master Mix는 Promega(Madison, WI, USA)에서 그리고 oligonucleotide primers는 Bioneer(Daejun, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 인간 간암 세포 HepG2 는 Korea Cell Line Bank(Seoul, KCLB)로부터 분양받았다.
데이터처리
- 2)Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 2)NS: not significantly (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 3)Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS(statitical package for social sciences, Version 10.0, Chicago, USA) program을 이용하여 실험군당 평균±표준편차로 표시하였고, 각 농도의 평균차의 통계적 유의성을 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 검정하였다.
이론/모형
- 5 mM 농도의 SNP 용액 1 mL를 24시간 처리하여 산화적 스트레스 조건을 유발한 다음 SNP 용액을 제거하였다. 배양이 끝난 세포의 생존율은 Chung 등(20)이 사용한 MTT환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 각 well에 FBS와 항생제가 첨가되어 있지 않은 성장배지(MEM/EBSS)의 10분의 1에 해당되는 MTT 용액(5 mg/mL)을 가해주고 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켰다.
성능/효과
- 50과 100 μg/mL 잔대 에틸아세테이트 추출물을 24시간 동안 HepG2 세포에 처리하였을 때 항산화 방어시스템인 4개의 주요 효소들인 SOD 1, SOD 2, GPx 및 CAT의 mRNA 수준이 50 μg/mL 처리군에서 대조군과 비교하여 유의적으로 변화지 않았으나, 100 μg/mL 처리군에서는 CAT가 유의적으로 증가하였다(Fig. 2).
- 50과 100 μg/mL의 잔대 에틸아세테이트 추출물을 처리했을 때 세포 생존율은 각각 70.3% 및 82%로 SNP 단독 처리군과 비교하여 각각 10.4%와 22.1% 세포 생존율이 증가하였다(Fig. 1).
- CAT의 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 증가하였으며, 100 μg/mL 처리군에서 3.2배 증가하였다(Fig. 2).
- Glutathione 대사에 관여하는 5개의 주요 효소들(GR, GCS, GST, γ-GT 와 G6PD) 중 50 μg/mL 처리군은 시료를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 G6PD mRNA 수준만 현저히 증가하였으나, 고농도 처리군에서는 GCS, GR 그리고 G6PD mRNA 수준이 현저히 증가하였다(Fig. 2).
- 5 μL, 그리고 합성한 first-stand cDNA 1 μL을 PCR tube에 넣은 후 다음과 같은 조건으로 PCR을 하였다. SOD 1, SOD 2, GCS와 CAT는 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 52℃에서 40초, 72℃에서 40초, 72℃에서 10분이었고, GPx, GT, GR, G6PD 그리고 18S rRNA도 유사한 조건으로 PCR 하였으나, annealing 온도가 각각 60, 60, 62, 50 그리고 60℃로 달랐다. SOD 1, SOD 2, GCS, CAT, GPx, GT, GR, G6PD 그리고 18S의 PCR cycles은 각각 22, 23, 27, 22, 25, 35, 25, 21 그리고 15 cycles하였다.
- CAT, GCS 그리고 G6PD mRNA 수준이 잔대 에틸아세테이트 추출물 처리 후 증가하였으나, SOD 1, SOD 2, GPx, GST 그리고 γ-GT mRNA 수준은 변화지 않았다. 따라서 잔대 에틸 아세테이트 추출물이 간접적 항산화 효과가 있고, 이들 효과는 아마 CAT, GCS, GR 그리고 G6PD 유전자 발현 증가에 의한 것이라고 추정되었다.
- 본 실험에서 CAT, GCS, GR 그리고 G6PD mRNA 수준이 잔대 에틸아세테이트 추출물 처리 후 증가하였으나, SOD 1, SOD 2, GPx, GST 그리고 γ-GT mRNA 수준은 변화지 않았다.
후속연구
- 모든 결과를 종합해 보면 잔대 에틸아세테이트 추출물은 세포내 방어 시스템을 증가시켜 항산화 작용을 나타내므로 다양한 분야에 기능성 소재로 활용가능성을 제시하고 있다. 앞으로 이 잔대 에틸아세테이트 추출물의 기능성 물질 분석 및 in vivo에서도 유사한 결과를 얻을 수 있는지에 대한 연구 들이 수행되어야 할 것이다.
- 모든 결과를 종합해 보면 잔대 에틸아세테이트 추출물은 세포내 방어 시스템을 증가시켜 항산화 작용을 나타내므로 다양한 분야에 기능성 소재로 활용가능성을 제시하고 있다. 앞으로 이 잔대 에틸아세테이트 추출물의 기능성 물질 분석 및 in vivo에서도 유사한 결과를 얻을 수 있는지에 대한 연구 들이 수행되어야 할 것이다.
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