잔대(Adenophora triphylla var. japonica)순 아세트산에틸 분획물의 피부 미백 효과 Skin Whitening Effect of Ethyl Acetate Fraction of Adenophora triphylla var. japonica Sprout원문보기
본 연구에서는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica)순 아세트산에틸 분획물의 in vitro 미백 효과에 대하여 연구하였다. EFAT는 다른 분획물과 비교하여 뛰어난총폴리페놀 함량(246.25 mg GAE/g)과 총 플라보노이드 함량(303.94 mg RE/g)을 나타내었으며, ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP assay 및 MDA 억제 활성에서 상대적으로 우수한 항산화 활성을 보였다. EFAT는 ${\alpha}-glucosidase$ 억제 활성에서 $41.93{\mu}g/ml$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었으며, L-DOPA를 기질로 이용한 tyrosinase 억제 활성의 $IC_{50}$은 $438.67{\mu}g/ml$로 tyrosinase의 산화 반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 또한 B16/F10 melanome 세포에서 ${\alpha}-MSH$에 의해 유도된 멜라닌을 $200{\mu}g/ml$의 농도에서 108.04%로 높은 저해 효과를 보여주었다. 따라서 EFAT는 ${\alpha}-glucosidase$ 억제 효과를 통한 tyrosinase의 glycosylation을 저해 작용과 tyrosinase의 가역적인 산화반응 저해를 통한 멜라닌의 생성을 억제하는 것으로 사료된다. 마지막으로 EFAT의 생리활성 물질을 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시한 결과, 주요 생리활성 물질은 chlorogenic acid와 rutin으로 추정되었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 볼 때, EFAT는 자외선 등으로부터 발생되는 산화적 스트레스로 발생되는 멜라닌의 생합성 저해 효과를 통하여, 미백 기능성을 함유한 향장소재로의 이용가능성이 높다고 판단되어진다.
본 연구에서는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica)순 아세트산에틸 분획물의 in vitro 미백 효과에 대하여 연구하였다. EFAT는 다른 분획물과 비교하여 뛰어난총폴리페놀 함량(246.25 mg GAE/g)과 총 플라보노이드 함량(303.94 mg RE/g)을 나타내었으며, ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP assay 및 MDA 억제 활성에서 상대적으로 우수한 항산화 활성을 보였다. EFAT는 ${\alpha}-glucosidase$ 억제 활성에서 $41.93{\mu}g/ml$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었으며, L-DOPA를 기질로 이용한 tyrosinase 억제 활성의 $IC_{50}$은 $438.67{\mu}g/ml$로 tyrosinase의 산화 반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 또한 B16/F10 melanome 세포에서 ${\alpha}-MSH$에 의해 유도된 멜라닌을 $200{\mu}g/ml$의 농도에서 108.04%로 높은 저해 효과를 보여주었다. 따라서 EFAT는 ${\alpha}-glucosidase$ 억제 효과를 통한 tyrosinase의 glycosylation을 저해 작용과 tyrosinase의 가역적인 산화반응 저해를 통한 멜라닌의 생성을 억제하는 것으로 사료된다. 마지막으로 EFAT의 생리활성 물질을 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시한 결과, 주요 생리활성 물질은 chlorogenic acid와 rutin으로 추정되었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 볼 때, EFAT는 자외선 등으로부터 발생되는 산화적 스트레스로 발생되는 멜라닌의 생합성 저해 효과를 통하여, 미백 기능성을 함유한 향장소재로의 이용가능성이 높다고 판단되어진다.
To investigate skin-whitening effect of Adenophora triphylla var. japonica sprout extract, antioxidant activity, inhibitory effect on tyrosinase and melanin synthesis in B16/F10 melanoma cell were examined. Total phenolic content (246.25 mg GAE/g) and total flavonoid content (303.94 mg RE/g) of ethy...
To investigate skin-whitening effect of Adenophora triphylla var. japonica sprout extract, antioxidant activity, inhibitory effect on tyrosinase and melanin synthesis in B16/F10 melanoma cell were examined. Total phenolic content (246.25 mg GAE/g) and total flavonoid content (303.94 mg RE/g) of ethyl acetate fraction from Adenophora triphylla sprout (EFAT) showed the highest contents than other fractions (n-hexane, chloroform and distilled water). Antioxidant activities of EFAT has been evaluated using ABTS, DPPH radical scavenging activities, FRAP and inhibitory effect of lipid peroxidation. EFAT showed excellent radical scavenging activity and inhibitory effect on MDA production. Inhibitory effect of tyrosinase as a major enzyme of melanin synthesis was also measured. In these results, EFAT showed higher inhibitory effect against L-DOPA (51.27%) than L-tyrosine. $IC_{50}$ value on ${\alpha}-glucosidase$ was $41.93{\mu}g/ml$. In B16/F10 melanoma cells, EFAT inhibited melanin synthesis at $200{\mu}g/ml$ concentration (about 42% decrease). Finally, main physiological compounds of EFAT were identified as a rutin and a chlorogenic acid using high performance liquid chromatography.
To investigate skin-whitening effect of Adenophora triphylla var. japonica sprout extract, antioxidant activity, inhibitory effect on tyrosinase and melanin synthesis in B16/F10 melanoma cell were examined. Total phenolic content (246.25 mg GAE/g) and total flavonoid content (303.94 mg RE/g) of ethyl acetate fraction from Adenophora triphylla sprout (EFAT) showed the highest contents than other fractions (n-hexane, chloroform and distilled water). Antioxidant activities of EFAT has been evaluated using ABTS, DPPH radical scavenging activities, FRAP and inhibitory effect of lipid peroxidation. EFAT showed excellent radical scavenging activity and inhibitory effect on MDA production. Inhibitory effect of tyrosinase as a major enzyme of melanin synthesis was also measured. In these results, EFAT showed higher inhibitory effect against L-DOPA (51.27%) than L-tyrosine. $IC_{50}$ value on ${\alpha}-glucosidase$ was $41.93{\mu}g/ml$. In B16/F10 melanoma cells, EFAT inhibited melanin synthesis at $200{\mu}g/ml$ concentration (about 42% decrease). Finally, main physiological compounds of EFAT were identified as a rutin and a chlorogenic acid using high performance liquid chromatography.
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문제 정의
그러므로 본 연구에서는 잔대 순을 이용하여 미백 기능성을 함유한 향장소재로의 산업화 가능성을 확인하고자 in vitro 항산화 활성과 α-glucosidase, tyrosinase 저해 효과 및 B16/F10 melanoma cell에서의 melanin 생합성 저해 효과를 연구하였다.
따라서 tyrosinase의 glycosylation에 작용하는 α-glucosidase, 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase 억제 활성 및 B16/F10 세포에서의 멜라닌 생성 억제효과를 평가함으로써 EFAT의 미백효과와 함께 개략적인 기작을 알아보고자 한다.
본 연구에서는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica)순 아세트산에틸 분획물의 in vitro 미백 효과에 대하여 연구하였다. EFAT는 다른 분획물과 비교하여 뛰어난총폴리페놀 함량(246.
제안 방법
1 ㎖를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, 30% trichloroacetic acid 0.1 ㎖와 1% thiobarbituric acid 0.3 ㎖를 첨가하여 80℃ water bath에서 20분간 가열한 후, 반응액을 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
C18 column (250×4.6 mm, 5.0 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 이용하였고, 이동 용매는 0.1% formic acid (A)와 100% MeOH (B)의 조성비를 0-100% (0-30 min)로 총 30분간 분석하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성 측정 방법은 0.1 mM 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH)를 80% 메탄올에 용해하여 흡광도 값이 517 ㎚에서 1.00±0.02가 나오도록 80% 메탄올을 희석해서 사용하였다.
6A와 같다. EFAT을 처리하였을 때 전체 처리농도(200-10,000 ㎍/㎖)에서 세포 생존율에 영향이 없음을 확인함에 따라, 최소 농도 200 ㎍/㎖ 농도에서 세포 내 멜라닌 생성 저해효과를 측정하였다.
반응 후 ELISA microplate reader로 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. L-DOPA를 이용한 tyrosinase의 저해 활성은 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)과 시료 40 ㎕, tyrosinase (125 unit/mL) 40 ㎕, 10 mM L-DOPA 용액 40 ㎕를 순서대로 첨가하여 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. L-tyrosine를 기질로 사용하였을 때는 arbutin을, L-DOPA를 기질로 사용할 경우에는 ascorbic acid를 양성대조구로 사용하였다.
Tyrosinase 저해 활성을 측정하기 위하여 Mason (Mason and Peterson, 1965)등의 방법을 변형하여 사용하였으며, Ltyrosine과 L-DOPA의 두 가지 기질을 이용하였다. L-tyrosine을 기질로 이용한 방법은 96 well plate에 0.
japonicasprout)는 잔대 잎의 에탄올추출물보다 비교적으로 다량의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 가지는 것으로 판단되며, 이로 인해 상대적으로 우수한 항산화 효과를 나타낼 것으로 사료된다. 각 분획물별 결과에 따라 가장 높은 총페놀과 총플라보노이드 함량을 나타낸 잔대 순 아세트산에틸 분획물(EFAT)을 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
0 ㎖/min이며 UV 검출장치의 파장은 diode array detector (DAD)로 310 ㎚에서 분석하였다. 검출 파장에 대한 UV 스펙트럼은 분석 파장을 저장하고 표준물질의 파장과 비교하여 유사성을 판단하였고, 검출된 생리 활성물질의 정량 분석을 위해 시료와 같은 방법으로 표준물질의 검량선을 통해서 페놀성 화합물의 정량분석을 수행하였다.
배지를 모두 제거하고 trypsin을 처리하여 세포를 회수하여 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 제거한다. 물에 불용성을 나타내는 멜라닌을 액화시키기 위하여 1N-NaOH in 10% DMSO를 첨가하고 80℃ water bath에서 20분간 방치하여 멜라닌을 완전히 녹인 후 96 well plate에 100 ㎕씩 옮겨 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(Hosoi et al., 1985).
여기에 시료를 농도별로 각 well에 처리하여 48시간 배양 후, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을 첨가 하여 배양기에서 반응시킨 후, 3시간 뒤 DMSO를 이용하여 세포를 용해시켜 ELISA microplatereder에서 570 ㎚를 측정하였다. 세포 생존율은 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 성장률을 측정하였다(Sohn etal., 1989).
시료 0.2 ㎖에 뇌 조직 상등액 0.1 ㎖, 10 μM FeSO4 0.1 ㎖, 0.1 mM ascorbic acid 0.1 ㎖를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
, 2001)등의 실험방법을 변형하여 실험하였다. 시료 1 ㎖에 diethylene glycol 10 ㎖와 1 N NaOH 1 ㎖를 혼합하여 30℃에서 60분 동안 방치시켜 420㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 rutin을 이용하여 시료와 같은 방법으로 작성된 검량선으로 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
1% formic acid (A)와 100% MeOH (B)의 조성비를 0-100% (0-30 min)로 총 30분간 분석하였다. 시료의 주입량은 20 ㎕, 이동상의 유속은 1.0 ㎖/min이며 UV 검출장치의 파장은 diode array detector (DAD)로 310 ㎚에서 분석하였다. 검출 파장에 대한 UV 스펙트럼은 분석 파장을 저장하고 표준물질의 파장과 비교하여 유사성을 판단하였고, 검출된 생리 활성물질의 정량 분석을 위해 시료와 같은 방법으로 표준물질의 검량선을 통해서 페놀성 화합물의 정량분석을 수행하였다.
incubator에서 24시간 배양하여 세포를 부착시킨다. 여기에 시료를 농도별로 각 well에 처리하여 48시간 배양 후, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을 첨가 하여 배양기에서 반응시킨 후, 3시간 뒤 DMSO를 이용하여 세포를 용해시켜 ELISA microplatereder에서 570 ㎚를 측정하였다. 세포 생존율은 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 성장률을 측정하였다(Sohn etal.
잔대 순 아세트산에틸 분획물의 생리활성 물질을 동정하기 위하여 High-Performance liquid chromatography (HPLC, Ultramate 3000 series, Dionex, CA, USA) 분석을 수행하였다. 시료는 1000 ㎍/㎖로 메탄올에 용해한 후 0.
총 플라보노이드 분석은 Lee (Lee et al., 2001)등의 실험방법을 변형하여 실험하였다. 시료 1 ㎖에 diethylene glycol 10 ㎖와 1 N NaOH 1 ㎖를 혼합하여 30℃에서 60분 동안 방치시켜 420㎚에서 흡광도를 측정하였다.
총폴리페놀 함량 분석은 Kim (Kim et al., 2003)등의 실험방법을 변형하여 실험하였다. 시료 1 ㎖에 3차 증류수 9 ㎖를 첨가한 후 Folin & Ciocalteau's phenol reagent 1 ㎖를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시켰다.
건조시킨 시료 60 g에 80% 에탄올3L를 첨가하여 환류냉각 하에 2시간 동안 추출하였다. 추출물은 증류수 300㎖로 정용하고 같은 양의 노말헥세인(n-hexane), 클로로포름(chloroform) 및 아세트산에틸(ethyl acetate) 용매를 이용하여 순차적으로 분획을 시행하였다. 분획을 통해 얻어진 각각의 분획물은 농축 및 동결건조를 통해 용매를 모두 제거한 뒤-20℃에 냉동 보관하여 각 실험에 사용하였다.
상온에서 2시간 동안 혼합 용액을 반응시킨 후 760 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 시료와 같은 방법으로 작성된 검량선으로 총 페놀화합물 함량을 계산하였다(Kim et al., 2003).
시료 1 ㎖에 diethylene glycol 10 ㎖와 1 N NaOH 1 ㎖를 혼합하여 30℃에서 60분 동안 방치시켜 420㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 rutin을 이용하여 시료와 같은 방법으로 작성된 검량선으로 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
대상 데이터
Folin-Ciocalteu's phenol reagent, gallic acid, 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,4,6-tripyridyl-S-triazine (TPTZ), trichloroacetic acid, thiobarbituric acid, ascorbic acid, cetechin, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (S t. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다.
마우스 뇌 조직을 이용한 지질과산화물 생성 억제 활성 측정을 위하여 ICR (수컷, 4주령)을 실험 동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입 한 후, 항온(22 2℃), 항습(50-55%)을 유지하며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 환경에서 사육하였다(경상대학교 동물실험 인가번호 GNU-131105-M0067). 상기 환경에서 사육한 ICR 마우스의 뇌를 적출한 후 뇌 조직 무게 10 배의 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
본 연구에 사용한 잔대(Adenophora triphylla var. japonica) 순은 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 식물로 강원도 화천군 화천가시오갈피 농장에서 2015년4월에 재배된 것을 구입하였으며, 국립산림과학원 특용자원연구과 이욱 박사의 동정을 거쳤다. 실험에 사용한 시료의 확증표본(표본번호 NIBRVP0000586797)은 국립생물자원관에 보관되고 있다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복 실행하여 mean±SD로 나타냈으며, 각 평균값에 대한 유의성 검증은 SAS software (version 9.1, SAS institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 실시하고, Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 각 시료간의 유의차를 5% 수준에서 검증하였다.
성능/효과
α-MSH 처리군 대비 EFAT의 200 ㎍/㎖ 농도에서 108.04% 수준으로 양성 대조군인 α-MSH 대비 유의적으로 우수한 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내었으며, 약 40% 정도 감소하는 효과를 나타냈다.
α-MSH 처리군의 멜라닌 함량은 대조군 대비 약 48%가 증가하였으며, 양성대조군으로 사용된 500 ㎍/㎖의 arbutin은 control과 유사한 멜라닌 생성량을 보였다.
98%의 라디칼 소거 활성을 나타내었으며 이는 동일한 농도의 양성대조군인 vitamin C와 유사한 활성을 나타내며 EFAT이 vitamin C와 비슷한 라디칼 소거능이 있다는 것을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 농도 1000 ㎍/㎖에서 72.85%로써 vitamin C와 비교하였을 때 다소 낮은 활성을 나타냈다(Fig. 2B). 그러나 ABTS 라디칼 소거활성과 유사하게 분획물의 처리농도가 증가함에 따라 점차적으로 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다.
2A와 같으며 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. EFAT 1000 ㎍/㎖에서 98.98%의 라디칼 소거 활성을 나타내었으며 이는 동일한 농도의 양성대조군인 vitamin C와 유사한 활성을 나타내며 EFAT이 vitamin C와 비슷한 라디칼 소거능이 있다는 것을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 농도 1000 ㎍/㎖에서 72.
EFAT는 α-glucosidase 억제 활성에서 41.93 ㎍/㎖의 IC50값을 나타내었으며, L-DOPA를 기질로 이용한 tyrosinase 억제 활성의 IC50은 438.67 ㎍/㎖로 tyrosinase의 산화 반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
japonica)순 아세트산에틸 분획물의 in vitro 미백 효과에 대하여 연구하였다. EFAT는 다른 분획물과 비교하여 뛰어난총폴리페놀 함량(246.25 ㎎ GAE/g)과 총 플라보노이드 함량(303.94 ㎎ RE/g)을 나타내었으며, ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP assay 및 MDA 억제 활성에서 상대적으로 우수한 항산화 활성을 보였다. EFAT는 α-glucosidase 억제 활성에서 41.
3과 같다. EFAT은 농도가 증가함에 따라 지질과산화물 생성을 유의적으로 억제하는 경향을 나타내었으며, 최고농도 100 ㎍/㎖과 동일한 농도의 양성 대조군인 카테킨은 각각 72.08%, 74.37%로 유사한 저해 효과를 보였다. 이러한 결과로 볼 때 EFAT은 체내의 활성산소에 의해 발생하는 지질과산화물을 억제 시킬 수 있는 효과가 뛰어난 것으로 사료된다.
낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridyltrizaine (Fe3+-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine (Fe2+-TPTZ)으로 환원되는 원리에 기초하여 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점에 착안하여 고안되어진 방법이다(Benzie and Strain, 1996). EFAT을 이용하여 FRAP assay에 의한 항산화 활성을 측정한 결과는 Fig. 2C와 같으며 분획물의 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 농도 의존적인 경향을 보였으며 농도 1000 ㎍/㎖에서는 1.17의 가장 높은 흡광도 값을 나타냈다. Osawa (1994)는 식물로부터 얻어진 페놀성 화합물의 항산화 효과 및 생리학적 기능은 주로 산화·환원력에 의한 것이라고 보고하였다.
EFAT을 이용한 α-glucosidase 억제 활성 측정 결과는 Fig. 5와 같으며, 분획물의 농도가 높아짐에 따라 α-glucosidase 억제 활성이 증가하는 경향을 나타내었다.
, 1999). EFAT의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2A와 같으며 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. EFAT 1000 ㎍/㎖에서 98.
EFAT의 주요 생리 활성 물질로 확인된 chlorogenic acid(y=0.21x+5.99, R2=0.99)와 rutin (y=0.64x+1.41, R2=0.99)을 정량 분석한 결과 각각 181.83±26.11, 57.20±6.22 ㎍/㎎ of dried weight로 나타났다.
HPLC 분석 결과 310 nm의 UV-VIS 파장에서 15.96분과 23.77분에서 확인된 피크는 EFAT의 주요 생리 활성 물질인 것으로 판단되며, 시료와 같은 방법으로 표준물질인 chlorogenic acid와 rutin의 retention time과 UV 스펙트럼을 비교하였을 때 similarity가 매우 높은 것으로 확인되었다(Fig. 7B & 7C).
4B와 같다. L-tyrosine의 tyrosinase 저해 활성과는 다소 다르게 농도 의존적인 경향을 보였으며 IC50 값은 438.67 ㎍/㎖로 나타났다. 최고 농도인 500 ㎍/㎖에서 51.
1A). 각 분획물의 총 폴리페놀 함량은 아세트산에틸, 클로로포름, 물, 노말헥세인 순서로 낮아졌다. 총플라보노이드 함량을 분석한 실험의 결과는 총폴리페놀 함량의 결과와 유사하게 아세트산에틸 분획물에서 303.
27%의 저해 활성을 보여주며 양성대조군인 vitamin C 보다는 낮은 활성을 나타내지만 시료가 천연 소재 추출물임을 감안하면 비교적으로 높은 저해 활성을 나타낸 것으로 판단된다. 결국 두 가지 기질을 사용하여 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과를 바탕으로 판단할 때, EFAT의 tyrosinase 저해효과는 melanogenesis의 Ltyrosine이 L-DOPA로 산화되는 반응보다 DOPA가 L-DOPAquinone으로 산화되는 반응에 관여함으로써 일정 수준의 미백효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.
2B). 그러나 ABTS 라디칼 소거활성과 유사하게 분획물의 처리농도가 증가함에 따라 점차적으로 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다. ABTS 라디칼 소거활성이 DPPH 라디칼 소거활성 보다 높게 나타난 이유는 ABTS 법은 소수성과 친수성 모두를 측정할 수 있는 장점을 가지고 있기 때문에 ABTS 라디칼 소거 활성이 더 감도 높게 나타난 것으로 판단된다(Roberta et al.
농도 500 ㎍/㎖에서는 97.35%로써 양성대조군인 acarbose과 유사한 저해효과를 나타냈고, αglucosidase 억제 활성의 IC50값은 41.93 ㎍/㎖로 나타났다.
따라서 EFAT는 α-glucosidase 억제 효과를 통한 tyrosinase의 glycosylation을 저해 작용과 tyrosinase의 가역적인 산화반응 저해를 통한 멜라닌의 생성을 억제하는 것으로 사료된다.
또한 B16/F10 melanome 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌을 200 ㎍/㎖의 농도에서 108.04%로 높은 저해 효과를 보여주었다.
, 1999). 라디칼 소거 활성 결과들을 종합하면 EFAT의 라디칼 소거 활성은 농도가 증가함에 따라 항산화 능력이 증가하는 경향을 보여주었다.
따라서 EFAT는 α-glucosidase 억제 효과를 통한 tyrosinase의 glycosylation을 저해 작용과 tyrosinase의 가역적인 산화반응 저해를 통한 멜라닌의 생성을 억제하는 것으로 사료된다. 마지막으로 EFAT의 생리활성 물질을 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시한 결과, 주요 생리활성 물질은 chlorogenic acid와 rutin으로 추정되었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 볼 때, EFAT는 자외선 등으로부터 발생되는 산화적 스트레스로 발생되는 멜라닌의 생합성 저해 효과를 통하여, 미백 기능성을 함유한 향장소재로의 이용 가능성이 높다고 판단되어진다.
4B와 같다. 먼저 L-tyrosine에 hydroxylation을 시키는 EFAT의 tyrosinase 저해 활성 측정한 결과, 양성 대조군인 arbutin 200 ㎍/㎖ 처리 시 59.47%로 나타났으며 동일한 농도의 EFAT 처리 시 17.37%로 상대적으로 낮은 저해효과를 나타내었다(Fig. 4A). 또한 모든 농도에서 양성대조군인 arbutin 대비 유의적인 tyrosinase 저해 효과가 나타나지는 않았다.
바위수염 추출물에 비해 상대적으로 더 낮은 EFAT 200 ㎍/㎖의 농도에서 41%의 저해 효과를 나타내었으며, 이러한 결과를 고려할 때 EFAT의 αglucosidase 저해 활성 및 L-DOPA 산화과정에서의 tyrosinase 저해 효과에 의한 B16/F10 세포에서의 멜라닌 생성 억제로 판단되어진다.
(2012) 등은 천연식물자원에 포함된 총 페놀 및 플라보노이드 화합물이 라디칼 소거 활성을 나타낸다고 보고하였다. 이들 연구 결과를 고려할 때, EFAT에 함유되어 있는 우수한 항산화 효과는 다양한 페놀성 화합물과 플라보노이드 성분에 의한 것으로 판단된다.
이러한 결과들을 종합하여 볼 때, 잔대 순이 갖는 in vitro항산화 활성, α-glucosidase, tyrosinase 저해활성 및 B16/F10 melanoma cell에서의 멜라닌 생성 억제 효과는 주요 생리활성물질인 chlorogenic acid와 rutin에 의한 효과로 사료되어진다.
37%로 유사한 저해 효과를 보였다. 이러한 결과로 볼 때 EFAT은 체내의 활성산소에 의해 발생하는 지질과산화물을 억제 시킬 수 있는 효과가 뛰어난 것으로 사료된다.
이러한 결과를 바탕으로 볼 때, 갈근 아세트산에틸 분획물의 IC50값은 247.8 ㎍/㎖로 EFAT 값과 비교했을 때 약 6배 더 우수한 α-glucosidase 저해 활성을 나타내는 것으로 판단된다.
4 ㎎ QE/g으로 나타났다. 이에 비해 본 연구에서 사용된 EFAT (ethyl acetate fraction from Adenophora triphylla var. japonicasprout)는 잔대 잎의 에탄올추출물보다 비교적으로 다량의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 가지는 것으로 판단되며, 이로 인해 상대적으로 우수한 항산화 효과를 나타낼 것으로 사료된다. 각 분획물별 결과에 따라 가장 높은 총페놀과 총플라보노이드 함량을 나타낸 잔대 순 아세트산에틸 분획물(EFAT)을 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
, 2012). 잔대 순의 총페놀성 화합물 함량은 노말 헥세인(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 아세트산에틸(ethyl acetate) 및 물 분획물(distilled water)에서 각각 33.00, 74.67, 246.25, 45.83 ㎎ Gallic Acid Equivalent/g(㎎ GAE/g)으로 아세트산에틸 분획물이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타내었다(Fig. 1A). 각 분획물의 총 폴리페놀 함량은 아세트산에틸, 클로로포름, 물, 노말헥세인 순서로 낮아졌다.
각 분획물의 총 폴리페놀 함량은 아세트산에틸, 클로로포름, 물, 노말헥세인 순서로 낮아졌다. 총플라보노이드 함량을 분석한 실험의 결과는 총폴리페놀 함량의 결과와 유사하게 아세트산에틸 분획물에서 303.94 ㎎ Rutin Equivalent/g (㎎ RE/g) 으로 다른 분획물과 비교하여 상대적으로 높은 함량을 나타내었다. 아세트산에틸 분획물 이외의 노말헥세인산, 클로로포름, 물 층에서는 각각95.
67 ㎍/㎖로 나타났다. 최고 농도인 500 ㎍/㎖에서 51.27%의 저해 활성을 보여주며 양성대조군인 vitamin C 보다는 낮은 활성을 나타내지만 시료가 천연 소재 추출물임을 감안하면 비교적으로 높은 저해 활성을 나타낸 것으로 판단된다. 결국 두 가지 기질을 사용하여 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과를 바탕으로 판단할 때, EFAT의 tyrosinase 저해효과는 melanogenesis의 Ltyrosine이 L-DOPA로 산화되는 반응보다 DOPA가 L-DOPAquinone으로 산화되는 반응에 관여함으로써 일정 수준의 미백효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
자외선에 의해 생성된 활성산소가 피부에 색소 침착을 촉진한다는 메커니즘에 대하여 Tobin and Thody (1994)등은 활성산소를 제거하면 멜라닌 생합성을 억제하는데 효과적이라는 연구를 보고하였고, Han and Jung (2003)등은 활성산소를 제거하는 항산화 효과를 가진 식물들은 멜라닌 생합성의 주요 효소인 tyrosinase를 억제 할 수 있는 유효 성분이 다량 함유되어 있다고 보고하였다. 본 실험에서 EFAT가 나타내는 뛰어난 항산화 효과는 연속적인 산화과정에 의해 발생하는 멜라닌 형성을 억제하는데 도움이 될 수 있는 소재라고 사료되어진다. 따라서 tyrosinase의 glycosylation에 작용하는 α-glucosidase, 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase 억제 활성 및 B16/F10 세포에서의 멜라닌 생성 억제효과를 평가함으로써 EFAT의 미백효과와 함께 개략적인 기작을 알아보고자 한다.
이러한 결과들을 종합해 볼 때, EFAT의 경우 DOPA가 L-DOPA quinone으로 산화되는 과정에서의 tyrosinase 저해효과 뿐만 아니라, 뛰어난α-glucosidase 저해효과를 나타냄에 따라 다양한 기작을 갖는 미백소재로의 가능성을 제시할 수 있다고 사료된다.
이러한 결과들을 종합하여 볼 때, 잔대 순이 갖는 in vitro항산화 활성, α-glucosidase, tyrosinase 저해활성 및 B16/F10 melanoma cell에서의 멜라닌 생성 억제 효과는 주요 생리활성물질인 chlorogenic acid와 rutin에 의한 효과로 사료되어진다. 이러한 물질들은 세포노화와 직접적인 관련성을 나타냄에 따라 피부 미백효과를 나타낼 수 있는 기능성 원료로의 가능성이 있을 것으로 사료되며, 따라서 이러한 물질들을 함유하는 잔대 순은 한 피부미백효과에 도움을 줄 수 있는 소재가 될 것으로 판단되어진다. 하지만, HPLC 분석에 의해 확인되지 않은 상대적 미량 물질들 분석을 위해 LC/MS/MS 등의 추가적인 연구와 함께, EFAT가 나타내는 미백효과에 대한 분자 생리학적 기작 연구가 향후 필요하다고 사료된다.
마지막으로 EFAT의 생리활성 물질을 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시한 결과, 주요 생리활성 물질은 chlorogenic acid와 rutin으로 추정되었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 볼 때, EFAT는 자외선 등으로부터 발생되는 산화적 스트레스로 발생되는 멜라닌의 생합성 저해 효과를 통하여, 미백 기능성을 함유한 향장소재로의 이용 가능성이 높다고 판단되어진다.
이러한 물질들은 세포노화와 직접적인 관련성을 나타냄에 따라 피부 미백효과를 나타낼 수 있는 기능성 원료로의 가능성이 있을 것으로 사료되며, 따라서 이러한 물질들을 함유하는 잔대 순은 한 피부미백효과에 도움을 줄 수 있는 소재가 될 것으로 판단되어진다. 하지만, HPLC 분석에 의해 확인되지 않은 상대적 미량 물질들 분석을 위해 LC/MS/MS 등의 추가적인 연구와 함께, EFAT가 나타내는 미백효과에 대한 분자 생리학적 기작 연구가 향후 필요하다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소의 종류는?
오랫동안 햇빛에 노출된 피부에서 관찰되는 광노화(photoaging)는 자외선에 의한 영향이 크게 미치는 것으로 알려져 있으며, 자외선 조사에 의해 피부 조직 내에 높은 농도의 여러 활성 산소가 생성되며 색소 침착의 주요 원인으로 알려져 있다(Han and Park, 2006). 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에는 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 초과산화음이온(superoxide anion, ·O2-), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH) 등이 있으며, 구조적으로 매우 불안정하기 때문에 주변의 분자와 높은 반응성을 나타내어 단백질, 세포막, 효소 및 DNA 등에 산화적 손상을 일으킨다(Papa and Skulachev, 1997). 이러한 활성산소는 피부 조직 내에 높은 농도로 생성되어 피부 노화를 촉진시키는데, 세포 방어 기전으로 멜라닌이 생성되는 것으로 알려져 있다(Tobin and Thody, 1994).
멜라닌 생합성을 저해할 수 있는 제제는?
, 2013). 그러므로 α-glucosidase를 저해하게 되면 tyrosinase의 glycosylation이 저해되어 구조는 변형되고 불활성 형태로 멜라노좀으로 이동하게 되어 결과적으로 melanogenesis가 억제되고, 결과적으로 α-glucosidase 저해제는 멜라닌 생합성을 저해할 수 있는 것으로 알려져 있다(Petrescu et al., 1997).
잔대 뿌리와 비슷한 약효가 있는 것은?
japonica)는 사삼, 딱주, 제니 등 여러 이름으로 불려지고 있으며, 몸에 털이 있고 굵은 뿌리를 가지는 여러해살이풀로 한국, 일본 및 중국 등지에 분포되어 있다. 봄에는 어린새싹을 이용하여 나물로 먹고, 뿌리를 이용해서 구워먹거나 주로 약재로 사용되어져 오고 있으며, 그 중뿌리는 가장 많이 이용되고 있는 부위로써 더덕, 도라지와 비슷한 약효가 있는 것으로 알려져 있고, 주요 성분은 saponin과 inulin으로 알려져 있다(Kim et al., 1995).
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